Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Summary

Análise de conteúdo de gordura é rotineiramente realizada em estudos utilizando modelos murinos obesidade. Métodos emergentes de pequenos animais a tomografia computadorizada ea análise estão fornecendo para longitudinal de análise de conteúdo de gordura riqueza de detalhes. Aqui passo detalhamos por procedimentos passo para a realização de pequenos animais tomografia computadorizada, análise e visualização.

Abstract

A obesidade está associada com aumento da morbidade e mortalidade, bem como métricas de redução na qualidade de vida. ¹ Ambos os fatores ambientais e genéticos estão associados com a obesidade, embora os mecanismos precisos subjacentes que contribuem para a doença estão sendo delineadas. ^2,3 animais vários pequenos modelos de obesidade têm sido desenvolvidos e são empregues numa variedade de estudos. ⁴ Um componente crítico para estes experimentos envolve a recolha de regionais e / ou total de animais os dados do conteúdo de gordura sob condições variadas.

Os métodos tradicionais de experimentais disponíveis para medir o teor em gordura, em modelos animais pequenos de obesidade incluem invasiva (por exemplo, medição ex vivo de depósitos de gordura) e não-invasivos (por exemplo, Dual Energy X-ray absorptiometry (DEXA), ou por ressonância magnética (MR)) protocolos, cada uma das quais apresenta em relação trade-offs. Atuais métodos invasivos para medir o teor de gordura podem fornecer detalhespara órgão e distribuição região específica de gordura, mas o sacrifício dos indivíduos impedirá avaliações longitudinais. Por outro lado, os atuais não-invasivos estratégias fornecem informações limitadas para órgão e distribuição região específica de gordura, mas permitem uma avaliação longitudinal valioso. Com o advento da dedicados pequenos animais de raios-X a tomografia computadorizada (CT) sistemas e procedimentos analíticos customizados, tanto de órgãos e análises região específica de distribuição de gordura e perfil longitudinal pode ser possível. Recentes estudos têm validado o uso da TC para imagem in vivo longitudinal de adiposidade em ratos vivos. ^5,6 Aqui nós fornecemos um método modificado que permite que a gordura / total medição do volume, análise e visualização utilizando a Carestream Imagem Molecular Albira sistema de CT em conjunto com pacotes de software e PMod Volview.

Protocol

1. Animais

1. Para os resultados relatados abaixo, três ratos C57BL/6J e quatro B6.V-Lep ^ob / J ratinhos foram obtidos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, principal, EUA). B6.V-Lep ^ob / J ratos representam um dos primeiros modelos de obesidade e permanecer ativamente pesquisado. B6.V-Lep ^ob / J ratinhos apresentam um fenótipo caracterizada pelo tamanho dos adipócitos aumentada e número e pode pesar até três vezes mais do que ratinhos de tipo selvagem. ^7,8 Aqui, B6.V-Lep ^ob / J ratinhos foram empregues como um positivo controlo para um fenótipo de obesidade para ilustrar a viabilidade do sistema de CT Albira para TC baseados medição do teor de gordura.
2. Imagem foi feita quando os animais atingiram cerca de 12 semanas de idade. (Obesidade em ratos ^ob / J B6.V-Lep se manifesta após 4 semanas de idade).
3. Os ratinhos foram anestesiados por isofluorano (taxa de fluxo de 2,5%) e mantidos sob a 2,5%, através de uma configuração de nariz-cone para imagiologia. Umimals foram posicionados propenso no leito de rato padrão (M2M Imaging Inc. Cleveland, OH) em fornecido com a estação de imagem Albira. Membros foram posicionados lateralmente a partir do tronco para uma aquisição CT uniforme.
4. Após a aquisição da imagem foi completada, os ratinhos foram removidos a partir do cone de nariz e voltou a uma gaiola de recuperação até ambulatório.

2. Aquisição de Imagem e Reconstrução

1. Imagem aquisições são realizadas utilizando o sistema de CT Albira (Carestream Molecular Imaging, Woodbridge, CT). Os ratinhos foram anestesiados por isofluorano (taxa de fluxo de 2,5%) e mantidos sob a 2,5%, através de uma configuração de nariz-cone para imagiologia. Aquisições foram realizadas para verificar um leito de 115 mm de comprimento, com 600 projeções. A fonte de raios-X foi definido como uma corrente de 200 mA e tensão de 45 kVp, e usado um filtro de 0,5 mm Al para endurecer a trave.
2. Aproximado de radiação equivalente de dose profunda para as configurações de TC foi de 220 mSv, e dose equivalente superficial foi 357,4 mSv. Estesdoses são mais de 20 vezes menor do que o relatado valores de LD50. ⁹
3. As imagens são reconstruídas usando o algoritmo de FBP (retroprojeção filtrada) por meio da Suite Albira 5,0 Reconstructor usando "Standard" parâmetros. Estes aquisição combinada e as configurações de reconstrução produzir uma imagem final com 125 mM voxels isotrópicos, considerada suficiente para análise animal inteiro. Para a análise detalhada região específica, uma reconstrução com 35 mM voxels isotrópicos podem ser selecionados para uma resolução final de 90 mM.

3. Análise de Imagem

A análise das imagens é realizada usando o software de análise PMOD (PMOD Technologies LTD, Zurich, Suíça). As imagens são segmentadas em PMOD de acordo com a densidade do tecido do primeiro para o volume total e, em seguida, para o volume de gordura.

3.1 As imagens podem ser reduzidos para a análise para minimizar as demandas computacionais.

1. Para reduzir, navegue até a guia Exibir principal. Selecione Ferramentas> Reduzir.
2. Seleccione X por 2, Y por 2, e Z por 2.
3. Verifique Substituir.
4. Selecione Executar.

A mensagem: "Caixa delimitadora vai mudar" é exibido uma vez que a redução é completa.

3.2 As imagens podem ser mascarados para eliminar cama e nariz cone-elementos para posterior do volume de interesse análise (VOI).

1. Para mascarar, navegue até Planes, Layouts, rotações, espelhos, Marcadores 3D> Planos e layouts.
2. Selecione avião Visualizar Z.
3. Vá até o cone do nariz do avião Z.
4. Selecione a guia VOI principal> Desenhar vértices.
5. Desenhe uma região de interesse (ROI) em torno do animal nariz, excluindo a cama e cone do nariz.
6. SelecionarCopie ROI real.
7. Mover para a próxima fatia, e cole ROI de buffer através dos planos pertinentes do nariz.
8. Use Editar grupo de vértices para ajustar o ROIs, conforme necessário.
9. Selecione Excluir ROI para os primeiros aviões além dos cones de ogiva.
10. Gerar um VOI novo para abranger o perímetro de animais (excepto o leito animal) com os primeiros aviões para além dos cones de ogiva.
11. Navegue até VOI Masking> Ferramentas e Álgebra.
12. Digite -1000 na caixa de diálogo fornecida.
13. Selecione os voxels Máscara fora do botão VOIS selecionado.

A mensagem: ". Operação de dados irreversível Você quer continuar?" displays.

14. Selecione Sim.
15. Navegue até Planes, Layouts, rotações, espelhos, Marcadores 3D> Aviões & Layouts.
16. Selecione Mostrar todos os planos.
17. Examine o VOI de integridade.
18. Selecione Salvar.
19. Salvar como analisar.
20. Alterar o prefixo do nome do arquivo.

3,3 segmento, a primeira imagem para o volume total de animais:

1. Selecione Ferramentas> externo.
2. Selecione a caixa de seleção de segmentação.
3. Introduza um intervalo de -300 a 3500 (de referência de densidade gama derivado de faixa de densidade de gordura abdominal-região).
4. Selecione Executar Segmentação.
5. Examinar a integridade da segmentação.
6. Clique em OK.
7. Selecione Remover ROI.
8. Selecione VOI estatísticas.

Estatísticas apresentadas representam o volume total.

9. Anote o volume reportado.

   3,4 segmento, seguida da imagem para o volume de gordura:

   1. Retornar para a imagem não-segmentado mascarado para a gordura volume de segmentação.
   2. Para carregar o arquivo salvo Masked dados, marque a caixa Analisar na janela Load).
   3. Selecione Ferramentas> externo.
   4. Selecione a caixa de seleção de segmentação.
   5. Inserir um intervalo de -200 a -50.
   6. Selecione Executar Segmentação.
   7. Examinar a integridade da segmentação.
   8. Clique em OK.
   9. Selecione VOI estatísticas.

   As estatísticas apresentadas representam o volume de gordura.

   10. Anote o volume reportado.
   11. Selecione Salvar.
   12. Salvar como analisar.
   13. Alterar o prefixo do nome do arquivo.

   Opcional: Se a pele densidade / periférica permanece, a "erosão e dilatação" protocolo abaixo podem ser realizados para eliminar essas regiões para análise VOI.

   1. Selecione Ferramentas> externo.
   2. Selecione a caixa de seleção morfológica. As exposições morfológicas vista.
   3. Selecione erosão.
   4. Clique em OK.
   5. Selecione Ferramentas> externo.
   6. Selecione a caixa de seleção morfológica. As exposições morfológicas vista.
   7. Selecione dilatação.
   8. Clique em OK.

   4. Visualização de imagens de TC

   4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, EUA) foi utilizado para criar apresentações visuais em 3D renderizados de imagens segmentadas.

   Analisar formato.
   1. Use as configurações padrão na janela pop-up.
   2. Abra o menu de plug-ins.
   3. Sob Utility, selecione Mesclar volumes.
   4. Desmarque a opção Componentes redimensionar.
   5. Clique em Atribuir segunda entrada.
   6. Escolher os dados segmentados de gordura para a segunda entrada.
   7. Use as configurações padrão na janela pop-up.
   8. Clique em Aplicar plug-in.
   9. Clique duas vezes em janela de exibição de Volume para aumentar a exibição do mouse assunto.

   4,2 Voltar para a guia Cor / opacidade. O componente de caixa drop-down que se refere ao conjunto de dados está sendo editado. Duas barras são localizados na parte inferior do separador e determinar o brilho relativo de cada componente de dados fixados dentro da sobreposição, utilizando os valores de 0 a 1. Para o componente 1, the CT, nós preferimos usar um esquema de cores em tons de cinza. Para alterar a cor:

   1. Na seção de mapeamento escalar cor, clique duas vezes em um dos controles deslizantes de cor.
   2. Para remover um controle deslizante, arraste-o para fora da caixa.
   3. Para adicionar uma barra nova, clique em qualquer lugar dentro da área de controle deslizante.
   4. Retire um dos controles deslizantes.
   5. Faça a esquerda cor controle deslizante preto (valor escalar (S) = -19.000).
   6. Vire à direita de cor branca deslizante ((S) = 15000).
   7. Na caixa de mapeamento escalar opacidade, criar um novo ponto, clicando dentro da caixa. Isto vai dar um total de três pontos na janela.
   8. Para o ponto médio, alterar o (S) a ~ -3000, eo valor de opacidade (O) a 0.
   9. Seleccione o terceiro ponto no lado direito da janela.
   10. Variação (S) a cerca de 32000, e .25.
   11. O primeiro ponto pode ser em qualquer lugar a esquerda, tal como desde que o valor de opacidade é definido como 0.
   12. Mude para dois componentes, que deve editar o visual da gordura.
   13. Altere cada um dos controles deslizantes de cor para vermelho, clicando duas vezes e deslizando o Hue (H) controle deslizante para a esquerda para falsa cor mapa da gordura para vermelho. Muito pouca coisa deve ser necessária para ajustar o visual da gordura.

   4.3 Para criar um filme de rotação de três painéis exibindo o CT, gordura e overlay:

   1. Clique e arraste o mouse sujeito em uma posição ereta com as costas voltada para você.
   2. Sob Pesos componentes, defina o valor de dois componentes a 0 para exibir somente varredura do CT.
   3. Clique em Revisar> Câmera.
   4. Selecione um número de quadros for filme a rotação (para o caso presente, optou-se "36").
   5. Alterar o valor de rotação X a 360 graus.
   6. Selecione Criar.
   7. Na caixa de diálogo pop-up, crie uma nova pasta chamada CT, e salve o arquivo no formato TIFF, que resultará em uma série de imagens de rotação.
   8. Repetir este passo para a imagem de gordura, bem como para a imagem de gordura / CT sobreposto, poupando-los em pastas individuais de cada vez.

   4,4 ImageJ v 1.43u foi usado para gerar um arquivo de filme rotação usando as imagens de saída VolView.

   1. No ImageJ, selecione File> Import Image Sequence>.
   2. Selecione a primeira imagem na pasta CT. O software detecta automaticamente os outros arquivos e abri-los como uma pilha.
   3. Repita o procedimento para abrir as seqüências de gordura e de sobreposição.
   4. Abra o gerenciador de ROI em Analisar> Ferramentas> ROIManager.
   5. Desenhe um ROI em torno do tema do mouse, excluindo pixels de fundo desnecessárias.
   6. No gerenciador de ROI, clique em Adicionar para adicionar o ROI.
   7. Selecione uma seqüência de imagem diferente.
   8. No gerenciador de ROI, clique no ROI para aplicá-lo à imagem. Desta forma, cada uma das pilhas cultivadas se encaixarão perfeitamente.
   9. Quando o ROI é em todas as pilhas, botão direito do mouse dentro do ROI.
   10. Selecione Duplicar.
   11. Seleccione Verifique a caixa de pilha duplicado para separar o ROI a partir do resto da imagem.
   12. Feche as pilhas de imagens maiores.
   13. Repita esse procedimento para todas as três seqüências de imagens.
   14. Vá em Image> Pilhas> Ferramentas> Combine para combinar as pilhas em conjunto.
   15. Selecione CT para Stack 1.
   16. Selecione Fat para Stack 2.
   > Repetir e selecione Stacks combinados para Stack 1 e Overlay para Stack 2.
   17. Há agora uma de três painéis, pilha de imagens de rotação, que pode ser visualizado através da selecção Play no canto inferior esquerdo da janela de imagem.
   18. Para salvar o filme como AVI, selecione Arquivo> Salvar como ...> AVI ...
   19. Clique em Salvar.

   5. Os resultados representativos

   Os resultados para três WT (C57BL/6J) ratinhos e quatro obesos (B6.V-Lep ^ob / J) ratinhos são aqui relatado como um exemplo representativo de medições de volume de gordura / total de razão que empregam o sistema de Albira CT. Figura 1 abaixo apresenta um representante exibir criado com VolView v3.2 para a segmentação (ou seja, volume total e volume de gordura) de camundongos obesos imagens de TC.

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   Figura 1. Imagens representativas CT segmentados para a gordura. (A) Obesidade mouse (B6.V-Lep ^ob / J) do volume total de CT em escala de cinza, (B) de volume de gordura em vermelho, e (C) fusão de imagens. (D) WT mouse (C57BL/6J) volume total de CT em escala de cinza, (E) o volume de gordura em vermelho, e (F) fusão de imagens.

   Os volumes totais, volumes de gordura, e calculada proporções de volume de gordura / total são relatados abaixo na Tabela 1 para cada ratinho WT e cada ratinho obeso. A proporção em volume média de gordura / total para o grupo WT e do grupo de obesos foi de 0,09 e 0,42, respectivamente (Figura 2). Os rácios de gordura / total de volume para os ratinhos WT versus os ratos obesos foi encontrada para diferem significativamente (p = 0,001).

   WT (C57BL/6J)	Total (cm 3)	Gordura (cm 3)	Fat / Total Relação	Obeso (B6.V-Lep ob	Total (cm 3)	Gordura (cm 3)	Fat / Total Relação
   Animal 1	28,79	3,00	0,10	Animal 1	66,25	26,75	0,40
   Animal 2	33,25	3,05	0,09	Animal 2	61,15	26,31	0,43
   Animal 3	30,30	2,63	0,09	Animal 3	64,19	25,7	0,40
   				Animal 4	54,25	23,78	0,44

   
   

   Tabela 1. O volume total, o volume de gordura,e proporções de volume de gordura / total de camundongos WT e obesos. volumes totais e de gordura foram obtidos a partir de imagens segmentadas usando PMOD análise VOI.

   
   Figura 2. Média de índices de volume de gordura / total de animais WT contra ratos obesos. Média índices de gordura / volume total de WT (C57BL/6J) e obesidade (B6.V-Lep ^ob / J) encontrados para 0,09 e 0,42, respectivamente são exibidos. (As barras de erro = desvio-padrão). WT contra obesos índices de gordura / volume total foram encontrados diferem significativamente (p-valor = 0,001).

Discussion

Aqui, utilizando camundongos ^ob / J B6.V-Lep que ilustramos a viabilidade de realizar medições de conteúdo de gordura em um modelo animal de pequeno porte utilizando o sistema Albira CT. Estas medidas são consistentes com as expectativas para comparações de intra-grupo e inter-grupos medições. Em primeiro lugar, resultados representativos fornecidas aqui destacar a variabilidade intra-grupo limitado de medições de índices de gordura / volume total em ambos os grupos WT e obesos camundongos utilizando estes procedimentos. Em segundo lugar, as taxas de gordura / volume total de animais WT contra obesos diferiram significativamente. Finalmente, com base em comparações (não mostrado) com os anteriores, relatadas para a massa total relativa de gordura e porcentagem de gordura corporal para WT contra B6.V-Lep ^ob / J camundongos, nossas medições de índices de gordura / volume total de WT contra B6.V- Lep ^ob / J ratos cair dentro de uma faixa esperada, ^{7, 8.}

Os métodos descritos aqui pode ser aplicado ou adaptado para m outraodels e / ou objetivos do estudo. Modificações nos parâmetros de reconstrução podem ser necessários para alcançar objetivos específicos. Por exemplo, Judex et al. (2010) relataram que 50 imagens de resolução mM foram necessários para uma análise de determinada região. Um cm volumes isotrópicos de uma imagem pode ser selecionado para 35 mM reconstruções no Reconstructor Albira Suite 5.0 usando o "HR" a opção de reconstrução. Uma vez que o sistema Albira CT tem sido utilizada para região e de órgãos específicos medição do teor de gordura de todos os benefícios (ou seja, simultânea região e de órgãos específicos medições de volume de gordura e medidas longitudinais) de CT análise de conteúdo baseada em gordura pode ser realizado para o sistema de CT Albira.

Conclusões:

Aqui, fornecemos um passo, pelo método detalhado passo para a medição do teor de gordura em ratos in vivo, utilizando raios-X CT de imagem. Nós adquirimos os nossos dados de TC define usando uma estação imagem Albira, e realizada a segmentação subseqüente e analise usando a suíte de software PMOD. Finalmente, fornecer instruções que permitam processamento fácil e visualização da distribuição do tecido de gordura dentro do animal como um todo.