Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Segmentering och Mätning av FAT-volymer i murina fetma modeller med hjälp av X-ray datortomografi

doi: 10.3791/3680 Published: April 4, 2012

Summary

Fetthalt analys rutinmässigt utförs i studier murina fetma modeller. Emerging metoder i litet djur CT och analys tillhandahåller för longitudinell detaljer rika fetthalt analys. Här har vi närmare steg för steg procedurer för att utföra litet djur CT, analys och visualisering.

Abstract

Fetma är associerad med ökad morbiditet och mortalitet samt minskade statistik i livskvalitet. 1 både miljömässiga och genetiska faktorer är förknippade med fetma, men de exakta bakomliggande mekanismer som bidrar till sjukdomen närvarande avgränsas. 2,3 Flera litet djur modeller av fetma har utvecklats och används i en mängd olika studier. 4 En viktig komponent i dessa experiment innebär insamling av regionala och / eller total animaliskt fett i viktprocent data under varierande förhållanden.

Traditionella experimentella metoder som finns för att mäta fetthalten i små djurmodeller för fetma innefattar invasiv (t.ex. ex vivo mätning av fettdepåer) och icke-invasiv (t.ex. Dual Energy X-ray (DEXA), eller Magnetic Resonance (MR)) protokoll, var som presenterar relativa kompromisser. Nuvarande invasiva metoder för att mäta fetthalten kan ge närmareför orgel och region specifika fettfördelning, men att offra ämnen kommer utesluter längsgående bedömningar. Omvänt, aktuella icke-invasiva strategier ger begränsade uppgifter för orgel och regionspecifika fett, men att värdefulla longitudinell bedömning. Med tillkomsten av särskilda små djur X-ray datortomografi (CT) system och kundanpassade analytiska förfaranden, både orgel och Region särskild analys av fett och längsgående profilering kan vara möjligt. Nya rapporter har validerat användningen av CT för in vivo longitudinell avbildning av fetma i levande möss. 5,6 Här erbjuder vi en modifierad metod som möjliggör för fett / total volym mätning, analys och visualisering utnyttja Carestream Molecular Imaging Albira CT-system i kombination med PMOD och Volview programvarupaket.

Protocol

1. Djur

  1. För de resultat som rapporteras nedan, har tre C57BL/6J-möss och fyra B6.V-LEP ob / J möss från Jackson Laboratories (Bar Harbor, Main, USA). B6.V-LEP ob / J möss utgör ett av de tidigaste modellerna av fetma och förblir aktivt forskat. B6.V-LEP ob / J möss uppvisar en fenotyp som kännetecknas av ökad fettceller storlek och antal och kan väga upp tre gånger mer än vildtyp möss. 7,8 Här var B6.V-LEP ob / J möss som används som en positiv kontroll för en överviktig fenotyp för att illustrera genomförbarheten av Albira CT för CT-baserade fetthalt mätningar.
  2. Imaging utfördes när djuren nådde cirka 12 veckor gamla. (Fetma i B6.V-LEP ob / J möss är uppenbar efter 4 veckors ålder).
  3. Mössen sövdes med isofluoran (2,5% flödeshastighet) och hölls under på 2,5% genom en noskon konfiguration för avbildning. EnDJUR placerades liggande i standarden råtta bädden (M2M Imaging Inc. Akron, OH) i medföljer Albira bilden stationen. Lemmar placerades i sidled från bålen en enhetlig CT förvärv.
  4. Efter bilden Förvärvet slutfördes, möss ur noskonen och återvände till en återhämtning bur fram till ambulatorisk.

2. Bild Förvärv och återuppbyggnad

  1. Bild förvärv utförs med användning av Albira CT-systemet (Carestream Molecular Imaging Woodbridge, CT). Mössen sövdes med isofluoran (2,5% flödeshastighet) och hölls under på 2,5% genom en noskon konfiguration för avbildning. Förvärv utfördes för att skanna en bädd av 115 mm längd, med hjälp av 600 projektioner. Den röntgenkällan sattes till en ström av 200 | iA och spänning av 45 kVp, och användes ett 0,5 mm Al filtret för att härda strålen.
  2. Ungefärlig strålning djupt dosekvivalenten för CT-inställningar var 220 mSv, och grunt dosekvivalenten var 357,4 mSv. Dessadoser är över 20-gånger lägre än vad som rapporterats LD50-värden. 9
  3. Bilder rekonstrueras med hjälp av FBP (Filtrerat tillbaka projektion) algoritmen via Albira Suite 5,0 Reconstructor använder "Standard" parametrar. Dessa sammanlagda förvärvspriset och inställningar återuppbyggnad en slutlig bild med 125 nm isotropa voxlar, anses tillräckligt i hela djuret analys. För detaljerad region specifik analys, kan en rekonstruktion med 35 nm isotropa voxlar väljas ut för en slutlig lösning av 90 nm.

3. Bildanalys

Bildanalys utförs med hjälp av PMOD (PMOD Technologies LTD, Zürich, Schweiz) analysprogram. Bilder är segmenterad i PMOD enligt vävnadsdensiteten-först för total volym och sedan för fett volym.

3.1 Bilder kan minskas för analys för att minimera beräkningsproblem krav.

  1. För att minska, navigera till den huvudsakliga fliken Visa. Välj Verktyg> Minska.
  2. Välja X genom 2, Y genom 2, och Z och 2.
  3. Kontrollera Ersätt.
  4. Välj Kör.

Meddelandet: "markeringsramen kommer att förändras" visas när minskningen är klar.

3.2 Bilder kan maskeras för att eliminera säng och noskonen element för efterföljande volymer av intresse (VOI) analys.

  1. Att dölja, navigera till Planes, layouter, rotationer, Mirror, 3D markörer> Planes och layouter.
  2. Välj Visa planet Z.
  3. Bläddra till noskonen i Z-planet.
  4. Välj viktigaste VOI fliken> Rita hörn.
  5. Rita ett område av intresse (ROI) runt djuret näsan exklusive sängen och noskonen.
  6. VäljKopiera Faktisk avkastning.
  7. Flytta till nästa skiva, och klistra in ROI från bufferten genom relevanta plan näsa.
  8. Använd Redigera grupp Hörn att justera ROI behov.
  9. Välj Ta bort ROI på de första planen utanför noskoner.
  10. Skapa ett nytt VOI att omfatta djuret omkrets (exklusive djuret sängen) på de första planen utanför noskoner.
  11. Navigera till VOI Verktyg> Maskering och algebra.
  12. Skriv -1000 i avsedd dialogrutan.
  13. Välj Mask voxlar utanför den markerade VOIs knappen.

Meddelandet: ". Irreversibel information drift Vill du fortsätta?" skärmar.

  1. Välj Ja.
  2. Navigera till Planes, layouter, rotationer, Mirror, 3D markörer> Planes & Layouts.
  3. Välj Visa alla plan.
  4. Undersök VOI för integritet.
  5. Välj Spara.
  6. Spara som Analysera.
  7. Ändra prefixet filnamnet.

3,3 Först segment bilden för total djur volym:

  1. Välj Verktyg> Extern.
  2. Markera kryssrutan Segmentering kontrollen.
  3. Ange ett urval av -300 till 3500 (densitet områdesreferens härrör från bukfett-regionen densitetsintervall).
  4. Välj Kör Segmentering.
  5. Undersök integritet segmentering.
  6. Välj OK.
  7. Välj Ta bort ROI.
  8. Välj VOI statistik.

Rapporterade statistiken representerar den totala volymen.

  1. Anteckna redovisade volymen.

    3,4 Därefter segment bilden för fett volym:

    1. Återgå till den icke-segmenterade maskerade bilden för fett-volymer segmentering.
    2. För att ladda sparade Masked datafil markera Analysera rutan i Load fönster).
    3. Välj Verktyg> Extern.
    4. Markera kryssrutan Segmentering kontrollen.
    5. Ange ett urval av -200 till -50.
    6. Välj Kör Segmentering.
    7. Undersök integritet segmentering.
    8. Välj OK.
    9. Välj VOI statistik.

    De redovisade statistiken representerar fettet volymen.

    1. Anteckna redovisade volymen.
    2. Välj Spara.
    3. Spara som Analysera.
    4. Ändra prefixet filnamnet.

    Valfritt: Om huden / perifer täthet kvarstår kan "Erosion och utvidgning" protokollet nedan utföras för att eliminera dessa regioner för VOI analys.

    1. Välj Verktyg> Extern.
    2. Markera Morfologisk kryssrutan. De morfologiska view visas.
    3. Välj erosion.
    4. Välj OK.
    5. Välj Verktyg> Extern.
    6. Markera Morfologisk kryssrutan. De morfologiska view visas.
    7. Välja dilation.
    8. Välj OK.

    4. Visualisering av CT-bilder

    4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, USA) användes för att skapa renderade 3D ​​visuella skärmar av segmenterade bilder.

      Analysera format.
    1. Använd standardinställningarna i pop-up fönster.
    2. Öppna plug-ins menyn.
    3. Under verktyg, markera Sammanfoga volymer.
    4. Avmarkera skalar komponenter.
    5. Klicka på Tilldela andra ingång.
    6. Välj segmenterade fett data för den andra ingången.
    7. Använd standardinställningarna i pop-up fönster.
    8. Klicka på Verkställ plug-in.
    9. Dubbelklicka på Volym vy fönster för en större bild av ämnet musen.

    4,2 tillbaka till Färg / Opacitet fliken. Komponenten listrutan hänvisar till vilken uppsättning uppgifter håller på att redigeras. Två glidstycken är belägen vid botten av fliken och bestämma den relativa ljusstyrkan hos varje komponent datauppsättning i överlagring, med användning av värdena 0 till 1. För 1-komponent, the CT, föredrar vi att använda en gråskala färgschema. För att ändra färg:

    1. Vid skalär Color Mapping avsnittet dubbelklicka på en av de färgreglagen.
    2. För att ta bort ett reglage att dra ut den ur lådan.
    3. För att lägga till en ny löpare, klicka var som helst i reglaget området.
    4. Ta bort en av reglagen.
    5. Göra det vänstra svart färg löparen (skalära värdet (S) = -19.000).
    6. Gör rätt färg reglaget vit ((S) = 15000).
    7. Från Skalär Opacitet kartläggning rutan skapa en ny punkt genom att klicka i rutan. Detta ger en totalt tre punkter i fönstret.
    8. För mittpunkt, ändra (S) till ~ -3000 och Opacitet (O) värdet till 0.
    9. Välj den tredje punkten till höger i fönstret.
    10. Ändra (S) till ca 32000, och .25.
    11. Den första punkten kan vara var som helst till vänster, precis så länge Opacitet är satt till 0.
    12. Byt till del två, vilket bör ändra utseendet på fettet.
    13. Ändra varje färgreglagen till röd genom att dubbelklicka på och skjuta Hue (H) reglaget åt vänster för att falskt färgkarta fettet till rött. Mycket lite mer bör krävas för att ändra utseendet på fettet.

    4,3 För att skapa en tre-panel rotation filmen visar CT, fett och overlay:

    1. Klicka och dra föremål musen till en upprätt position med ryggen vänd mot dig.
    2. Under Component Vikter, ange värdet Component två till 0 för att visa bara datortomografi.
    3. KlickaGranska> Kamera.
    4. Välj ett antal ramar FOr rotationen filmen (för det aktuella fallet valde vi "36").
    5. Ändra X-rotationsvärdet till 360 grader.
    6. Välj Skapa.
    7. I popup-dialogrutan Skapa en ny mapp med namnet CT och spara filen i TIFF-format, som kommer ut en serie rotation bilder.
    8. Upprepa detta steg för fettet bilden liksom för den överlagrade fett / CT bild, spara dem i enskilda mappar varje gång.

    4,4 ImageJ v 1.43u användes för att generera en fil rotation film med VolView utgående bilderna.

    1. I ImageJ väljer du Arkiv> Importera> bildsekvens.
    2. Markera den första bilden i CT mappen. Programvaran kommer automatiskt att upptäcka andra filer och öppna dem som en stack.
    3. Upprepa för att öppna fett och overlay-sekvenser.
    4. Öppna ROI chefen enligt Analyze> Verktyg> ROIManager.
    5. Rita en ROI kring ämnet musen, exklusive onödiga bakgrund pixlar.
    6. I ROI Manager, klicka på Lägg till ROI.
    7. Välj en annan bildsekvens.
    8. I ROI Manager klickar du på ROI för att tillämpa den på bilden. På detta sätt kommer varje beskurna staplarna matcha perfekt.
    9. När ROI är på alla stackar, högerklicka i ROI.
    10. Välj Duplicera.
    11. Välj Kontrollera Duplicera Stack Box att separera ROI från resten av bilden.
    12. Stäng större bild stackar.
    13. Upprepa denna procedur för alla tre bildsekvenser.
    14. Gå till Bild> Staplar> Verktyg> Kombinera att kombinera de stackarna tillsammans.
    15. Välj CT för Stack 1.
    16. Välj fett för Stack 2.
    17. > Upprepa och välj Kombinerade Stacks för Stack 1 och Overlay för Stack 2.
    18. Det finns nu ett tre-panel, bild-rotation stack som kan förhandsgranskas genom att välja Spela i det nedre vänstra hörnet i bildfönstret.
    19. Om du vill spara filmen som en AVI, väljer du Arkiv> Spara som ...> AVI ...
    20. Klicka på Spara.

    5. Representativa resultat

    Resultat för tre WT (C57BL/6J) möss och fyra feta (B6.V-Lep ob / J) möss redovisas här som ett representativt exempel på fett / totalt mätningar volymförhållandet utnyttjar Albira CT-systemet. Figur 1 nedan ger en representativ display skapas med VolView v3.2 för segmentering (dvs. total volym och fett volym) av överviktiga möss CT bilder.

    0/3680fig1.jpg "/>
    Figur 1. Representativa CT-bilder segmenterade för fett. (A) Fetma mus (B6.V-Lep ob / J) CT totala volymen i gråskala, (B) fett volym i rött, och (C) bild fusion. (D) WT mus (C57BL/6J) CT totala volymen i gråskala, (E) FAT-volym i rött, och (F) bild fusion.

    Totala volymer, fett volymer, och beräknade fett / totalt nyckeltal volym redovisas nedan i tabell 1 för varje WT mus och varje feta mus. Den genomsnittliga fett / totala volym förhållandet för WT gruppen och feta gruppen var 0,09 och 0,42 respektive (figur 2). De feta / total volym-förhållanden för de WT-möss versus de feta möss befanns skilja sig signifikant (p = 0,001).

    WT (C57BL/6J) Totalt (cm 3) Fett (cm 3) Fett / total-förhållande Feta (B6.V-Lep ob Totalt (cm 3) Fett (cm 3) Fett / total-förhållande
    Djur 1 28,79 3,00 0,10 Djur 1 66,25 26,75 0,40
    Djur 2 33,25 3,05 0,09 Djur 2 61,15 26,31 0,43
    Djur 3 30,30 2,63 0,09 Djur 3 64,19 25,7 0,40
    Djur 4 54,25 23,78 0,44

    Tabell 1. Total volym, fett volym,och fett / total volym förhållanden för WT och feta möss. Totalt och fett volymer kommer från segmenterade bilder med hjälp av PMOD VOI analys.

    Figur 2
    Figur 2. Genomsnitt fett / total volym kvoter för WT möss jämfört feta möss. Averaged fett / total volym kvoter för WT (C57BL/6J) och feta (B6.V-Lep ob / J) befunnits vara 0,09 och 0,42 respektive visas. (Felstaplar = enkel standardavvikelse). WT kontra feta fett / totalt volymförhållanden befanns skiljer sig signifikant (p-värde = 0,001).

Discussion

Här använder B6.V-LEP ob / J möss som vi har visat möjligheten att utföra fetthalt mätningar i en liten djurmodell med Albira CT-systemet. Dessa mätningar överensstämmer med förväntningarna för jämförelser av inom gruppen och mellan grupper mätningar. För det första, om representativa resultat här lyfta fram begränsad inom koncernen variation i mätningar av fett / totalt volymförhållanden i både WT och feta möss grupper som använder dessa förfaranden. För det andra, fett / total volym kvoter för WT kontra feta möss skiljer sig markant. Slutligen, baserat på jämförelser (visas ej) med tidigare redovisade värden för relativ total fettmassa och procent kroppsfett för WT kontra B6.V-LEP ob / J möss, våra mätningar för fett / total volym kvoter för WT kontra B6.V- LEP ob / J möss faller inom ett förväntat intervall, 7, 8.

De metoder som beskrivs här kan användas eller anpassas till andra modeller och / eller mål studie. Ändringar i återuppbyggnadsarbete parametrar kan krävas för att uppnå specifika mål. Exempelvis Judex et al. (2010) rapporterade att 50 um högupplösta bilder krävdes för vissa region särskild analys. En cm isotropa volymer av en bild kan väljas för 35 ^ m rekonstruktioner i Albira 5,0 Suite Reconstructor med användning av "HR" rekonstruktion alternativ. När Albira CT-systemet har använts för regionen och organspecifika fetthalt mätningar full nytta (dvs. samtidigt region och organspecifika fett mätningar volym och longitudinella mätningar) av CT-baserad fetthalt analys kan realiseras för att Albira CT-systemet.

Slutsatser:

Här erbjuder vi en detaljerad steg för steg metod för mätning av fetthalten i levande möss med användning av X-ray CT. Vi förvärvade vår CT-data sätter med hjälp av en Albira bild station, och utförde därefter segmentering och analys med hjälp av PMOD programsvit. Slutligen ger vi anvisningar så att enkel rendering och visualisering av fettvävnad fördelningen inom hela djuret.

Disclosures

Todd A. Sasser, Shengting Li, Sean P. Orton, och Seth T. Gammon är anställda i Carestream Molecular Imaging. Carlos Correcher är anställd av Oncovision, SAW Gem-Imaging Matthew Leevy är konsult för Carestream Molecular Imaging.

Acknowledgments

Vi tackar varmt Notre Dame integrerad bildhantering Facility (NDIIF) och Carestream hälsa för finansiellt stöd för detta projekt.

References

  1. Clarke, P. J., O'Malley, P. M., Schulenberg, J. E., Johnston, L. D. Midlife and Socioeconomic Consequences of Persistent Overweight Across Early Adulthood: Findings From a National Survey of American Adults (1986-2008). Am. J. Epidemiol. (2008).
  2. Brockman, G., Bevova, M. Using Mouse Models to Dissect the Genetic of Obesity. TRENDS in Genetics. 18, 367-376 (2002).
  3. Bray, G. A. Progress in Understanding the Genetics of Obesity. Journal of Nutrition. 127, Suppl 5. 940S-942S (1997).
  4. Carroll, L. Mouse Models of Obesity. Clinics in Dermatology. 22, 345-349 (2004).
  5. Judex, S., Luu, Y. K., Ozcivici, E., Adler, B., Lublinsky, S., Rubin, C. T. Quantification of Adiposity in Small Animal Rodents using Micro-CT. Methods. 50, 14 (2010).
  6. Luu, Y. K., Lublinsky, S., Ozcivici, E., Capilla, E., Pessin, J. E., Rubin, C. T., Judex, S. In Vivo Quantificaiton of Subcutaneous and Visceral Adiposity by Micro Computed Tomography in a Small Animal Model. Med. Eng. Phys. 31, 34-41 (2009).
  7. Medina-Gomez, G., Gray, S. L., Yetukuri, L., Shimomura, K., Virtue, S., Campbell, M., Curtis, R. K., Jimenez-Linan, M., Blount, M., Yeo, G. S., Lopez, M., Seppänen-Laakso, T., Ashcroft, F. M., Oresic, M., Vidal-Puig, A. PPAR gamma 2 prevents lipotoxicity by controlling adipose tissue expandability and peripheral lipid metabolism. PLoS Genet. 3, e64 (2007).
  8. Sakkou, M., Wiedmer, P., Anlag, K., Hamm, A., Seuntjens, E., Ettwiller, L., Tschöp, M. H., Treier, M.A role for brain-specific homeobox factor bsx in the control of hyperphagia and locomotory behavior. Cell Metab. 5, 450-463 (2007).
  9. Patchen, M. L., MacVittie, T. J., Souza, L. M. Postirradiation treatment with granulocyte colony-stimulating factor and preirradiation WR-2721 administration synergize to enhance hemopoietic reconstitution and increase survival. International Journal of Radiation Oncology. 22, 773-779 (1992).
Segmentering och Mätning av FAT-volymer i murina fetma modeller med hjälp av X-ray datortomografi
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Sasser, T. A., Chapman, S. E., Li, S., Hudson, C., Orton, S. P., Diener, J. M., Gammon, S. T., Correcher, C., Leevy, W. M. Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography. J. Vis. Exp. (62), e3680, doi:10.3791/3680 (2012).More

Sasser, T. A., Chapman, S. E., Li, S., Hudson, C., Orton, S. P., Diener, J. M., Gammon, S. T., Correcher, C., Leevy, W. M. Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography. J. Vis. Exp. (62), e3680, doi:10.3791/3680 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter