Summary
En beskrivning av de metoder som används för att konvertera en HP DeskJet 500 skrivare till en bioprinter. Skrivaren är kapabel att behandla levande celler, vilket orsakar övergående porer i membranet. Dessa porer kan utnyttjas för att införliva små molekyler, inklusive fluorescerande G-aktin, i de tryckta celler.
Abstract
Bioprinting har ett brett spektrum av tillämpningar och betydelse, inklusive tissue engineering, direkta cellterapi ansökan och Biosensor mikrofabrikation. 1-10 har nyligen termisk bläckstråleskrivare också använts för gen transfektion. Visades 8,9 Den termiska bläckstråleskrivare tryckprocessen temporärt störa cellmembranen utan att påverka cellernas livskraft. De transienta porerna i membranet kan användas för att introducera molekyler, vilka annars skulle vara för stora för att passera genom membranet, in i cellens cytoplasma. 8,9,11
Det program som visas här är användningen av termiska bläckstråleutskrift för inkorporering av fluorescensmärkta G-aktin-monomerer in i celler. Fördelen med att använda termisk bläckstråleskrivare, för att injicera molekyler in i celler är att tekniken är relativt godartad till celler. 8, 12 Cell-livsdugligheten efter tryckning har visat sig vara liknande standardcell PLAting metoder 1,8. Dessutom kan bläckstråleskrift tusentals celler i minuter, vilket är mycket snabbare än manuell mikroinjektion. De porer som skapas genom tryckning har visat att stänga inom ca två timmar. Det finns emellertid en gräns för storleken hos porerna som skapas (~ 10 nm) med denna tryckningsteknik, som begränsar tekniken att injicera celler med små proteiner och / eller partiklar. 8,9,11
En standard HP DeskJet 500 skrivare ändrades för att möjliggöra för cell utskrift. 3, 5, 8 Omslaget till skrivaren bort och pappret matningsmekanismen var förbi med en mekanisk spak. Ett stadium skapades för att möjliggöra placering av objektglas och täckglas direkt under skrivhuvudet. Bläckpatroner öppnades, bläcket avlägsnades och de rengjordes före användning med celler. Tryckeriet Mönstret skapades med hjälp av standard ritprogram, som sedan styrde skrivaren via ett enkelt tryck kommando. 3T3 Fibroblaster odlades till konfluens, trypsiniserades och återsuspenderades sedan i fosfatbuffrad saltlösning med lösliga fluorescensmärkta g-aktin-monomerer. Cellsuspensionen pipetterades in i bläckpatronen och linjer av celler trycktes på täckglas mikroskop slirar. De levande cellerna avbildades med användning av fluorescensmikroskopi och aktin i hela cytoplasman. Inkorporering av en fluorescerande aktin i cellen tillåter avbildning av kortvariga cytoskelettala dynamik och är användbar för en mängd olika applikationer. 13-15
Protocol
1. Konvertera HP DeskJet 500
Det bör noteras att denna teknik skulle fungera med många kommersiellt bläckstråleskrivare. Men äldre skrivare tenderar att fungera bättre när de använder bläckpatroner med större diameter munstycken som inte täpper lika lätt. Dessutom, äldre skrivare tenderar att använda mekaniska sensorer pappersmatningen som är lättare att kringgå. Skrivare med optiska sensorer kan luras, men med en liten remsa av papper på den bortre kanten av skrivaren under varje cykel, men är lite svårare än det mekaniska systemet för att "trick". De för närvarande kommersiellt tillgängliga skrivare som fungerar bäst har låg upplösning (DPI).
Högre upplösning skrivare tenderar att täppa lättare. Upplösningen av HP Deskjet 500 är 300 dpi. Det finns många kommersiellt tillgängliga skrivare (HP Deskjet-serien och andra) som har en upplösning på 600 dpi. Denna typ av skrivare kan användas med endast en liten ökning av munstyckeigensättning frågor som kan lindras med hjälp noggrann rengöring (avsnitt 3).
- Ta bort den övre plasthöljet på skrivaren genom att låsa upp flera plast klipp från botten skrivarens bottenplatta och sakta lyfta av toppen.
- Skruva knapp / belysningen panel från toppen av skrivare, vilket den är ansluten till skrivaren moderkort.
- Rengör insidan av skrivaren, särskilt de områden där bläckpatronen vilar och där utskrift sker.
- Leta reda på kablarna som levererar ström till mekanismerna pappersmatningen och dra dem från moderkortet.
- I HP DeskJet 500, är dessa finns strax under pappersfacket mot vänster fram.
- Leta mekanismen papper upptäckt. Förbikoppla den mekanism genom anbringande en sträng eller tråd slinga för att tjäna som en manuell draghandtag.
- I HP DeskJet 500, är papperet upptäckt mekanismen en grå plast hävstång finns ovanför och bakom utskrift / papper matningsmekanismen.
- Skapa en scen framför papperet matningsmekanismen (där pappret skulle matas från och deponeras) för att få de önskade utskrift bilderna till en nivå strax under patronen skrivhuvudet.
- För våra experiment skummet sjöfarten hållaren för 15 ml centrifugrör användas med flera objektglas tejpade på plats i den grafiska området för att få den slutliga nivån på bilderna till önskad höjd.
- För att bibehålla aseptisk teknik, kan skrivaren placeras inuti en standard biohazard skåp eller bord laminärt flöde huva.
- Det är viktigt att notera att modifiera en kommersiellt tillgänglig bläckstråleskrivare brukar upphäver skrivarens tillverkarens garanti.
2. Konvertera Stock HP bläckpatroner (HP 26 svart bläckpatron)
- Ta ut patronen ur förpackningen, vilket innebär att skyddstejpen som täcker skrivaren kontakter och skrivhuvud för närvarande.
- Stabilisera kroppenav patronen (svarta delen) antingen med en klämma eller skruvstäd (bara fast grepp patronen för hand vanligen arbetade också), lämnar gröna toppen fri från hinder.
- Med en tång eller en skiftnyckel, ta tag i gröna toppen av patronen och vrid fram och tillbaka flera gånger tills den lossnar.
- Detta bör inte ta mycket kraft, men toppen är inte längre behövs, så det är okej om det bryter när du tar bort den.
- Med skruvmejslar, bända bort den genomskinliga plastbiten nu utsätts för.
- Återigen bör inte ta mycket kraft, men det kommer inte att behövas, så det är okej om det går sönder under borttagning.
- Töm eventuell kvarvarande från reservoaren.
- Ta bort plasten skyddstejpen som täcker skrivaren kontakter och skrivhuvudet.
- Spola omsorgsfullt igenom behållarna med vatten.
- Använda en pipett eller spruta för att driva vattnet genom kanalerna.
- Vatten kommer sannolikt läcka ut från skrivhuvudet underdenna process, vilket är acceptabelt, och inte orsakar någon skada på funktionaliteten hos patronen.
- När vattnet är klart, låt patronen torka.
3. Rengöring bläckpatron
- För att upprätthålla en ren utskriftsmiljö bör bläckpatronen rengöras före och efter användning.
- Detta hjälper också till att undvika kristallisation av salter och annat biologiskt material i patronen som kan orsaka blockering.
- Fullständigt dränka patronen i en bägare fylld med avjoniserat vatten, och sonikera under 15 minuter före och efter tryckning.
- Efter ultraljudsbehandling, ta ut patronen ur vattnet och skaka ut överflödigt vatten.
- Sprej 70% etanol i patronen för att skapa en mer aseptisk miljö.
- Se till att etanolen har torkat innan du lägger till lösningen bioink utskrift.
4. Göra Cell Suspension - "Biobläck "
- Kultur celler tills den ska passage.
- För 3T3-fibroblaster: Seed celler på T-75 kolvar vid ca 1.3x10 4 celler / cm 2 i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS). Odlingsceller under två dagar i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Göra fluorescerande g-aktin förrådslösning vid koncentration 50 | ig / ml i fosfatbuffertlösning (PBS).
- Passage celler.
- För 3T3 fibroblaster: Ta ut mediet från kolv och skölj två gånger med PBS. Täcka cellerna med 5 ml 0,25% trypsin + EDTA och inkubera under 5 min.
- Tillsätt 5 ml färskt medium och pipettera cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt centrifugrör och centrifugera vid 1000 rpm under 5 minuter. Aspirera förbrukade mediet.
- Återsuspendera cellerna i PBS med fluorescerande g-aktin stamlösning för att skapa bioink.
- Bioink bör ha en slutlig koncentration av g-aktin i 10 | ig / ml och en cell concentration av 1x10 5 celler / ml. Denna koncentration har optimerats för att begränsa mängden celler per droppe och igensättning av skrivaren huvudet. 8
- Notera att 250 | il av bioink skrivs tre täckremsor med mönstret som visas i figur 2.
5. Bioprinting
- Strömmen och låta skrivaren värmas upp.
- Placera önskat tryckyta (här använder vi 22 mm x 22 mm täckglas) på mitten av scenen framställd i steg 1,6.
- Skapa en fil utskrift mönster.
- Öppna Microsoft Word (eller något annat ritprogram) och rita det önskade mönstret.
- Välj ett önskat tryck mönster för cell utskrift i premade filen.
- Sätt i preparerade kassetten med önskad cellsuspension.
- Pipett suspensionen in i de små cirkulära väl vid botten av patronen utrymmet. Använd ca 100-120 pl lösning. Den tryckta droppstorlek är ca 130picoliters. 8
- Skriv ut filen med HP Deskjet 500 skrivare.
- För bästa resultat, skriv ut mindre mönster flera gånger (5), genom att ändra antal exemplar som önskas i ordbehandlingsprogrammet.
- Skrivaren värms upp igen, då kassetten kommer att flytta till "färdig position".
- När kassetten flyttar in den färdiga läget (något till vänster om bläcket dropp långt under och stannar där), dra upp på papperet matningsmekanismen tråd, och tryck bör inledas.
- För flera kopior av utskrift, kommer papperet matningsmekanismen måste ut efter varje cykel eller sida skrivs ut. Patronen kommer sedan tillbaka till "Klar" läget, och papperet matningsmekanismen tråden bör höjas igen.
- Skrivaren skriver ut på täckglaset placeras på mitten av tryckeriet i steg 5,2 (se figur 2).
6. Representativa resultat </ P>
De representativa resultat av hela omvandlingsprocessen av en standard, off-the-shelf HP Deskjet 500, kommer vanliga HP 26-serien patroner skapar en skrivare med möjlighet att skriva ut cell lösningar för många olika typer av analys som tidigare nämnts. Den färdiga Skrivaren efter omvandling visas i figur 3, med ett tryckeri steg att placera slip mikroskopet locket på. Skrivaren kan vara användbart i analys på många områden, inklusive men inte begränsat till: encelliga mekanik, vävnadsteknik, genterapi transfektion, biosensor micropatterning och direkta cellterapi 1-10, 16-22.
I detta exempel har en HP Deskjet 500 skrivare och HP 26-serien bläckpatroner modifierad för bioprinting. Med användning av denna skrivarinstallationen med en bioink bestående av en fibroblast-cellsuspension i en g-aktin monomerlösningen, cellerna trycks på täckglas av glas mikroskop. Figur 1 illustrerar representativa res ÜLTS av tryckta fibroblastceller, som visar ingår fluorescerande aktinmonomerer. De resultat som erhölls i en kontrollerad aseptisk miljö i vilken cellerna trycks in anpassningsbara mönster.
Mönstret används i detta exempel har skapats i Microsoft Word (figur 2). Detta mönster skapas en kontinuerlig linje av den tryckta lösningen över huvuddelen av mikroskopets objektglas. Figur 4 visar den raka linjen, i vilken bioink och celler är ömsesidigt deponeras. Det bör noteras att omedelbart efter tryckning, det finns en ökning av bakgrundsfluorescens eftersom bioink lösning, i vilken cellerna är suspenderade, innehåller fria överskottet av fluorescerande aktinmonomerer. Denna bakgrundsfluorescens minskar signifikant efter tillsatsen av tillväxtmedia på cellerna (Figur 1), som tvättar överskott monomer från substratet.
ad/3681/3681fig1.jpg "/>
Figur 1. Representativa bilder av 3T3 fibroblaster 3 timmar efter utskrift med den modifierade bläckstråleskrivare. Det inre av cellerna visar ingår fluorescensmärkta aktin monomerer. Skalstrecken representerar 50 pm.
Figur 2. Design används för att skriva bioink.
Figur 3. Skrivaren efter konvertering med frigolit scen. Den orange tråd i mitten förbi pappersavkännaren matningsspakarna.
Figur 4. Representativ bild av 3T3-fibroblaster tryckta i en lokaliserad tryckzonen. Mikroskopi bild tagen 5 minuter efter utskrift med 20x förstoring.
/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
Figur 5. Fluorescens bild (40x förstoring) tas 3 timmar efter tryckning visar en fibroblast med internaliserade fluorescerande aktin monomerer. Skalstrecket betecknar 50 | am.
Figur 6. Fluorescensmikroskopi (20x förstoring) av en cell tagen 15 minuter efter tryckning. Bilden visar både G-aktin (grön) och kärnan (blå). Från vänster till höger: g-aktin med Alexa Fluor 488, kärnan med DAPI och en överlagring av båda.
Figur 7. Fluorescensmikroskopi visar två fibroblaster i en linjemönster 3 timmar efter tryckning. Bilden till vänster visar fluorescensmärkta aktinmonomerer inuti celler. Bilden till höger är en överlagring av fluorescerande kanal med bakgrundsbild att visa att även omdet kan finnas skräp på bilden (nedre vänstra hörnet), det fluorescerar inte. Skala staplar representerar 50 m, om storleken inte anges längst till höger är en kontrollgrupp av icke-tryckta cellerna odlades i 3 timmar med fluorescerande taggade monomerer. Denna kontroll är att visa att monomerer inte kunde penetrera cellmembranet utan membran permeabilisering av cell utskrift.
Discussion
Processen att omvandla en vanlig skrivare bläckstråleskrivare skrivbordet för bioprinting är inte särskilt svårt. Den mest utmanande steget är att avgöra hur man ska kringgå mekanismen pappersmatning, som är beroende på märke och modell som används av skrivare. Emellertid är denna relativt enkla när pappersmatningskedjan sensorn är mekaniskt såsom beskrivits här. För modeller med optisk foder sensorer, kan andra tekniker behöva användas för att lura skrivaren att tro att det är att använda papper, till exempel, kan man köra en liten bit papper genom skrivaren medan den skriver på objektglas. Förbi mekanismen papperet foder sannolikt kommer att vara det svåraste steget i tillämpningen av dessa förfaranden för att olika skrivarmodeller.
Vid konstruktionen av en fas för att hålla täckglasen för tryckning, är det viktigt att säkerställa korrekt inriktning och höjd. Scenen bör göra det möjligt att täckglaset skall placeras i mitten av tryckområdet. Dessutom bör det PLace täckglaset på en lämplig höjd så att utrymme för tonerkassetten att passera över bilden utan att störa den. Den exakta höjden av scenen kommer att bero på skrivarmodell.
För att säkerställa att tryckta celler inte blir tvättas bort, de objektglasen placerades i en inkubator omedelbart efter tryckning under ca 30 minuter för att möjliggöra cellvidhäftning innan ytterligare celltillväxt-medium tillsattes. Eftersom cellerna är tryckta i en lösning som innefattar stora mängder av PBS cellerna inte torkar ut och förblev livskraftiga. Cellerna försågs med bild med användning av fluorescensmikroskopi för att visualisera fördelningen av de taggade G-aktin-monomerer inne i cellen (figurerna 1, 5-7). Vid utskrift med 3T3-fibroblaster, visar figur 5 ett representativt resultat med aktin orsakar mycket av cellen att fluorescera, men uppvisande linjer av ökad ljushet. Införlivandet av fluorescensmärkta g-aktin i cytoskelettet äranvändbara för studier av cytoskelett dynamik och cellulära mekanik. 12-15 En begränsning med denna teknik är att det är endast för molekyler och proteiner som har diametrar mindre än ca 10 nm.
Att säkerställa att cellerna faktiskt var som behandlas av den omvandlade skrivaren tillsattes DAPI (1:5000 i PBS) tillsattes till bioink i stället för hälften av volymen ren PBS. Den fluorescerande färgen DAPI binder till aminosyraklasser rika delar av DNA är belägna i kärnan. Därför DAPI är en användbar färgning i fluorescent avbildning kärnor av de tryckta celler. Figur 6 visar en representativ bild av en cell som visar både Alexa Fluor 488 (aktin) och DAPI (kärna) fluorescens med en överlagring bild av båda. Figur 7 illustrerar också hur cellerna kommer att fluorescera när de G-aktin-monomerer har införlivats medan icke-biologiskt material, som har deponerats i provet inte kommer att fluorescera på grund av den absence av g-aktin monomerer.
Ett viktigt övervägande för bioprinting är de vattenhaltiga medierna som används för bioink. Man fann att med användning av standardmetoder celltillväxtmedium med serum gav motsägande resultat. Detta är sannolikt på grund av igensättning av skrivhuvud munstycken från serumproteiner. Användning av PBS ökade konsistensen av tryckta mönster och antalet celler deponerade. En nackdel med användning av PBS är att celler inte skulle lämnas kvar i suspensionen under längre tidsperioder. Emellertid var fibroblaster i dessa exempel kan tolerera de bioink för åtminstone en timme utan någon ändring av cellviabilitet. Detta överensstämmer med flera tidigare fynd, som rapporterar att celler skrivas ut via termiska bläckstråleskrivare mekanismer har visat sig ha hög lönsamhet priser. 2-8
Denna modifierade Skrivarinställning kan användas för andra tillämpningar än cellen utskrift. 16-22 Matrix proteiner, såsom kollagen eller fibronectin, kan lätt tryckas på substrat med denna teknik, som kan vara användbara för cellen mönstring. Till exempel, kollagen typ I tryckt in linjemönster kommer att resultera i linje med varandra kollagen som kan användas för in vitro-cellodling studier. 17 Förutom matrisproteiner och andra molekyler, inklusive tillväxtfaktorer, kan tillförlitligt lokaliserad på substrat för cellstudier och potentiella terapeutiska tillämpningar. 18
En viktig begränsning av den konstruktion som beskrivs i ovanstående steg är att skrivaren är inte kapabel att skriva mer än en dimension. Detta begränsar möjligheterna för användning i mönstrade applikationer såsom schavotten utskrift. För att tillåta 3D tryckning, behöver en specialiserad steg som skall användas. Scenen måste ha inkrementella höjd justeringar för lager-på-lager avsättning av bioink.
Bioprinting har visat sig lovande som en effektiv och kostnadseffektiv metod för vävnadsteknik, Gen transfektion, micropatterning och microarray tillverkning 1-12, 16-22 De framtida tillämpningar av denna typ av enhet är många, inklusive: skapande av kontrollerade och mönstrade cellulära mikromiljöer, införlivande av makromolekyler till cellens cytoplasma och deposition av celler på byggnadsställningar och strukturer som inte förekommer naturligt eller effektivt.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Dr Thomas Boland för idén att använda HP Deskjet-skrivare för cell utskrift. Finansieringen för detta projekt från NSF RII-EPS 0903795 och NIH K25 HL0922280.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
References
- Calvert, P. Materials science. Printing cells. Science. 318, 208-209 (2007).
- Mironov, V., Reis,, Derby, B. Review: Bioprinting: A beginning. Tissue Eng. 12, 631-634 (2006).
- Pepper, M. E., Parzel, C. A., Burg, T., Boland, T., Burg, K. J. L., Groff, R. E. Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).
- Campbell, P., Weiss, L. Tissue engineering with the aid of inkjet printers. Expert Opin. Biol. Th. 7, 1123-1127 (2007).
- Boland, T., Xu, T., Damon, B., Cui, X. Application of inkjet printing to tissue engineering. Biotechnol. J. 1, 910-917 (2006).
- Mironov, V., Prestwich, G., Forgacs, G. Bioprinting Living Structures. J. Mater. Chem. 17, 2054-2060 (2007).
- Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E. C., Atala, A., Yoo, J. J. Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery. Tissue Eng. Part A. 15, 95-101 (2009).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., Boland, T. Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Saunders, R., Derby, B. B. ioprinting Inkjet Deposition. Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. 15, John Wiley & Sons. (2010).
- Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., Labhasetwar, V. Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles. Int. J. Pharm. 244, 105-115 (2002).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Apodaca, G. Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton. Traffic. 2, 149-159 (2001).
- Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanpää, K., Faix, G., Rivera, C., Lappalainen, P. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J. Cell Biol. 185, 323-339 (2009).
- Allen, P. G. Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles. Nat Cell Biol. 5, 972-979 (2003).
- Cooper, G. M., Miller, E. D., Desesare, G. E., Usas, A., Lensie, E. L., Bykowski, M. R., Huard, J., Weiss, L. E., Losee, J. E., Campbell, P. G. Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation. Tissue Eng. Part A. 16, 1749-1759 (2010).
- Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., Dean, D. Collagen matrix alignment using inkjet printer technology. Proc. 1094 (DD. , 7-16 (2008).
- Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., Hermanson, O. Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation. Biomaterials. 28, 3936-3943 (2007).
- Ringeisen, B. R., Orthon, C. M., Barron, J. A., Young, D., Sparago, B. J. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, 930-948 (2006).
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260, 920-926 (1993).
- Okamoto, T., Suzuki, T., Yamamoto, N. Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology. Nature Biotechnol. 18, 438-441 (2000).
