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Immunology and Infection

XCELLigence सिस्टम को Cr51 रिलीज परख तुलना द्वारा मानव Her2neu विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं के इष्टतम साइटोटोक्सिक गतिविधि निर्धारण

Published: August 8, 2012 doi: 10.3791/3683
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, College of Medicine, Mayo Clinic

Summary

क्रोमियम रिहाई परख, साइटोटोक्सिक टी सेल गतिविधि का पता लगाने के लिए एक आम परख, कई सीमाएं हैं. वर्तमान अनुच्छेद में, प्रतिजन विशेष CD8 टी कोशिकाओं और मानव स्तन कैंसर ट्यूमर लाइन, SKBR3 का उपयोग करना, एक प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण सेल हत्या का पता लगाने की क्षमता के लिए जांच की गई थी.

Protocol

1. लघु अवधि के मानव एंटीजन विशिष्ट CD8 टी सेल लाइन्स 7 की पीढ़ी

  1. Ficoll Paque प्लस का उपयोग कर सामान्य स्वस्थ एचएलए-A2 सकारात्मक दाताओं के खून से अलग परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs).
  2. 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल से कम 6 अच्छी तरह प्लेटें 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह PBMCs के जोड़ें.
  3. एचएलए-A2 बाध्यकारी HER-2/neu p369-377 पेप्टाइड (अमीनो एसिड अनुक्रम KIFGSLAFL) या एचएलए-A2 बाध्यकारी इन्फ्लूएंजा 10 माइक्रोग्राम / एमएल और जगह की एक अंतिम एकाग्रता में सीधे कुओं को p58-66 पेप्टाइड (GILGFVFTL) जोड़ें 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में.
  4. संस्कृति मीडिया में 50 इकाइयों / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए प्रोत्साहित करना और विस्तार टी कोशिकाओं, जोड़, पुनः संयोजक मानव आईएल -2 (50 इकाइयों / μl शेयर) के साथ पूरक हर 2 दिन, 250 μl / अच्छी तरह से ताजा मीडिया में मदद करने के लिए.
  5. फिर से उत्तेजित ही पेप्टाइड्स के 10 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ 2 घंटे के लिए स्पंदित 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल विकिरणित ऑटोलॉगस PBMCs के साथ संस्कृति कोशिकाओं का उपयोगचरण 1.3 और पहले पेप्टाइड उत्तेजना के बाद 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से एक सप्ताह में संस्कृतियों के लिए इन कोशिकाओं को जोड़ने में घ.
  6. के रूप में मौजूदा संस्कृतियों हर 2 दिन में, 1.4 चरण में वर्णित मानव पुनः संयोजक आईएल -2 और ताजा मीडिया, जोड़ें.
  7. दूसरी पेप्टाइड उत्तेजना के बाद 1.5 एक सप्ताह चरण में वर्णित के रूप में पेप्टाइड और विकिरणित ऑटोलॉगस PBMCs के साथ कोशिकाओं को फिर से उत्तेजित.
  8. छह दिन जल्द से जल्द फिर से उत्तेजना पिछले के बाद कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए तैयार करते हैं.

2. स्तन कैंसर की कोशिकाओं की तैयारी

  1. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में xCELLigence प्रतिबाधा मापने स्टेशन (xCELLigence स्टेशन) रखें.
  2. 0.25% trypsin और centrifugation (5 मिनट के लिए 1000 rpm) का उपयोग कर 75% मिला हुआ हैं कि फसल मानव ट्यूमर कोशिकाओं (SKBR3, BT20, MCF7 या HCC1419).
  3. एक hemocytometer और RPMI ट्यूमर मीडिया में पुनर्गठित उन्हें (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 500 इकाइयों / एमएल के साथ पूरक का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं की गणना7.5 एक्स 10 3 ट्यूमर cells/100 μl की एकाग्रता में IFN-गामा).
  4. अच्छी तरह लेआउट निर्धारित करने के लिए लेआउट पेज की स्थापना करके और प्रतिबाधा रीडिंग एक 40 घंटे की अवधि के लिए हर 5 मिनट लेने के लिए अनुसूची पृष्ठ की स्थापना करके कार्यक्रम xCELLigence सॉफ्टवेयर. पहले 18 घंटे के लिए, xCELLigence प्रणाली केवल ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिबाधा रीडिंग ले जाएगा.
  5. XCELLigence ई प्लेटें RPMI ट्यूमर मीडिया के 100 μl जोड़ें और कोशिकाओं के अभाव में प्रतिबाधा को मापने के द्वारा पढ़ने पृष्ठभूमि प्रदर्शन करते हैं.
  6. XCELLigence स्टेशन में अच्छी तरह से और जगह प्रति 100 μl पर ई प्लेटों को ट्यूमर कोशिकाओं जोड़ें.
  7. तुरंत ई प्लेटों का पालन करने के लिए शुरू जो ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिबाधा रीडिंग लेने शुरू करने xCELLigence सॉफ्टवेयर पर शुरू बटन दबाएं.

3. CD8 टी कोशिकाओं के साथ ट्यूमर के सह संस्कृति

  1. ट्यूमर कोशिकाओं 10 x 4 ट्यूमर कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से (लगभग जुड़ा हुआ है और 1.5 से दोगुनी हो गई है एक बारmately 18 घंटे के शुरू में) चढ़ाया जा रहा है के बाद, फसल टी कोशिकाओं कोमल scraping और आंदोलन से धारा 1 में तैयार
  2. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र और 40 टी कोशिकाओं को 1 ट्यूमर सेल की एक अधिकतम अनुपात में शुरू, विभिन्न अनुपात में 10% FBS के साथ एक hemocytometer और RPMI मीडिया में पुनर्गठित उन का उपयोग टी कोशिकाओं की गिनती और के अनुपात तक 2 गुना पतला 1.25 टी कोशिकाओं को 1 ट्यूमर सेल पर पहुंच गया है. उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से प्रति 1.5 एक्स 10 4 ट्यूमर कोशिकाओं रहे हैं. एक 01:40 अनुपात को प्राप्त करने के लिए, प्रति अच्छी तरह से 6 एक्स 5 10 टी कोशिकाओं को जोड़ने और 2 गुना अच्छी तरह से प्रति 1.875 10 x 4 टी कोशिकाओं (1:1.25 अनुपात) को 1.5 एक्स 10 4 ट्यूमर कोशिकाओं का एक अनुपात तक टी कोशिकाओं को कमजोर हासिल की है.
  3. XCELLigence स्टेशन रोकें और ई प्लेट हटा दें.
  4. एक pipet साथ कुओं में मीडिया निकालें और 200 मीडिया अकेले की μl या कुओं के लिए टी कोशिकाओं का उचित अनुपात में जोड़ें.
  5. XCELLigence स्टेशन में ई प्लेट वापस प्लेस और xCELLigence सॉफ्टवेयर समर्थक जारीग्राम इसलिए प्रतिबाधा रीडिंग टी सेल इसके बाद लगभग 20 घंटे के लिए हर 5 मिनट में लिया जाता है.
  6. परख के अंत में परिणाम मानक के अनुसार.

4. क्रोमियम रिलीज परख (सीआरए) 7

  1. 51 करोड़ और 51 करोड़ लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के साथ काम करते समय संस्थागत विकिरण सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें. हमेशा विकिरण जोखिम को कम करने के लिए उचित परिरक्षण का उपयोग करें.
  2. पल्स ट्यूमर 1 से 2 घंटे के लिए कोशिकाओं 10 x 10 μl / एमएल ताजा 51 करोड़ (0,005 सीआइ / एमएल) के साथ 6 ट्यूमर कोशिकाओं / एमएल.
  3. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर 10% FBS और अपकेंद्रित्र के साथ RPMI मीडिया के 10 मिलीलीटर में ट्यूमर कोशिकाओं को धो लें. 100 μl / अच्छी तरह से में 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं में एक 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेट को ट्यूमर कोशिकाओं जोड़ें.
  4. 40 टी कोशिकाओं को 1 ट्यूमर सेल पर शुरू विभिन्न अनुपात में टी कोशिकाओं, जोड़ें और 1.25 टी कोशिकाओं को 1 ट्यूमर सेल का एक अनुपात तक 2 गुना पतला हासिल की है. उदाहरण के लिए, 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं रहे हैं अच्छी तरह से प्रति. एक 01:40 अनुपात को प्राप्त करने के लिए, प्रति अच्छी तरह से 4 एक्स 10 6 टी कोशिकाओं को जोड़ने और 2 गुना अच्छी तरह से प्रति 1.25 एक्स 5 10 टी कोशिकाओं (1:1.25 अनुपात) के लिए 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं का एक अनुपात तक टी कोशिकाओं को कमजोर हासिल की है.
  5. थाली को सहज और अधिकतम ट्यूमर सेल नियंत्रण जोड़ें. ट्यूमर कोशिकाओं से 51 करोड़ की सहज रिहाई की गणना करने के लिए, प्रत्येक युक्त 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं के 10% FBS के साथ RPMI मीडिया की μl 100-100 μl में छह कुओं जोड़ें. ट्यूमर कोशिकाओं से 51 करोड़ की अधिकतम रिहाई की गणना करने के लिए, 100 μl के लिए 100 μl 0.1% ट्राइटन सभी कोशिकाओं lyses जो पीबीएस में एक्स 100 में छह कुओं प्रत्येक युक्त 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं को जोड़ने.
  6. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से कम 5 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.
  7. ऊष्मायन के बाद, हर अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला के 50 μl हटाने और एक luma थाली में जोड़ें.
  8. रातोंरात प्लेटें सूखी और एक गामा काउंटर का उपयोग करते हुए सीपीएम के उपाय.
ले "> 5. प्रतिशत Lysis गणना

  1. प्रतिबाधा परख: विभिन्न बिंदुओं पर समय सेल सूचकांक (सीआई) के रूप में की सूचना दी प्रतिबाधा पढ़ने, ले लो और प्रतिशत सेल निर्धारित करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें: (सीआई ट्यूमर केवल - (सीआई ट्यूमर + टी कोशिकाओं)) / (केवल सीआई ट्यूमर) * 100.
  2. सीआरए: प्रतिशत सेल निर्धारित करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें: (सीपीएम प्रयोगात्मक - सीपीएम सहज) / (सीपीएम अधिकतम - सीपीएम सहज) * 100.

6. प्रतिनिधि परिणाम

अकेले टी कोशिकाओं प्रतिबाधा वृद्धि नहीं

टी कोशिकाओं, सामान्य रूप में, सबसे ठोस सतहों का पालन नहीं करते और सक्रियण और प्रसार के लिए पालन करने की आवश्यकता नहीं है. इसलिए, यह टी कोशिकाओं xCELLigence ई प्लेटों पर प्रतिबाधा में योगदान नहीं होना चाहिए कि धारणा थी. इस परीक्षण के लिए, कुओं SKBR3 स्तन कैंसर की कोशिकाओं या हौसले से शुद्ध मानव CD8 टी कोशिकाओं के साथ या तो भरी हुई थी. प्रतिबाधा 40 घंटे के दौरान और एक प्रतिनिधि उदाहरण demonst से अधिक मापा गया थाटी कोशिकाओं की रेटिंग अनिवार्य रूप से कम प्रभाव चित्रा 1 ए में दिखाया गया है. इसके विपरीत, यह केवल थोड़ा यद्यपि टी कोशिकाओं पृष्ठभूमि प्रतिबाधा कम हो सकता है कि तर्क दिया जा सकता है. उस के बावजूद, सह संस्कृति प्रतिबाधा माप की दीक्षा निम्नलिखित 18 घंटे में टी कोशिकाओं को जोड़ने की प्रक्रिया एक प्रतिबाधा विघटन (चित्रा 1 बी) में कहा कि परिणाम से पता चला है. अन्य अध्ययनों अवरोधों इनक्यूबेटर के इंटीरियर के रूप में एक ही संकेत में कमी के बाद से निपटने के लिए भाग में टी सेल युक्त समाधान की कि तापमान सुनिश्चित करने के द्वारा कम किया जा सकता है की वजह से किया गया था रहे थे कि पता चला.

टी कोशिकाओं द्वारा प्रतिबाधा मध्यस्थता में कटौती खुराक पर निर्भर हैं.

साइटोटोक्सिक टी सेल गतिविधि के लिए नमूने तुलना करने के लिए एक प्रतिबाधा आधारित परख की उपयोगिता प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के विभिन्न सांद्रता के बीच भेद करने की क्षमता की आवश्यकता है. यह संभव है कि परीक्षण करने के लिए, SKBR3 कोशिकाओं concentra है बदलती के साथ सह सुसंस्कृत थेटी कोशिकाओं का माहौल टी सेल लाइन एक HER-2/neu विशेष p369 से निकाली गई. जैसा कि चित्र 2A में दिखाया गया है, प्रतिबाधा में कटौती टी कोशिकाओं की खुराक पर निर्भर थे. चित्रा 2B शो 10 घंटे में सेल इंडेक्स टी कोशिकाओं की सीमा पर एक सरल दूसरे क्रम बहुपद पालन कि. इस प्रकार, xCELLigence स्टेशन सेल सूचकांक में एक बूंद के रूप में वास्तविक समय में SKBR3 ट्यूमर के CD8 टी सेल मध्यस्थता मौत पर नज़र रखता है.

प्रतिबाधा आधारित परख प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का पता लगाता है

एक HER-2/neu और एचएलए-A2 सकारात्मक स्तन कैंसर के ट्यूमर सेल लाइन है जो SKBR3 की प्रतिबाधा में कटौती, HER-2/neu द्वारा p369 विशेष टी कोशिकाओं प्रतिजन थे निर्धारित करने के लिए SKBR3 युक्त विशिष्ट, अलग कुओं भी incubated रहे थे एक इन्फ्लूएंजा (फ्लू) विशेष टी सेल लाइन से निकाली गई टी कोशिकाओं के साथ. फ्लू विशिष्ट टी कोशिकाओं एचएलए-A2 सकारात्मक जा रहा है, एक गैर विशिष्ट नियंत्रण के रूप में सेवा की है, लेकिन HER-2/neu पहचान करने के लिए किसी भी क्षमता नहीं. फाई में दिखाया गया हैgure 3, फ्लू विशेष टी कोशिकाओं (पी <0.0001) की तुलना में p369 विशेष टी कोशिकाओं HER-2/neu की अपघट्य गतिविधि के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है. कुछ मामलों में, ट्यूमर के लिए विशिष्ट नहीं टी कोशिकाओं (जैसे फ्लू विशिष्ट या anti-CD3/anti-CD28 प्रेरित) अपघट्य गतिविधि (आंकड़े 3 ए बी) के एक कम स्तर का प्रदर्शन किया. टी कोशिकाओं को या तो गैर विशेष रूप फैस के माध्यम से, दो में से एक तरीके को मार सकता है: फैस ligand बातचीत या प्रतिजन विशेष रूप से granzymes और perforins की रिहाई के माध्यम से. आगे HER-2/neu-specific टी कोशिकाओं को एक प्रतिजन विशेष फैशन में मार रहे थे उस धारणा की पुष्टि करने के लिए, हम फैस ligand के लिए एक अवरुद्ध एंटीबॉडी शामिल किया. चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, एंटीबॉडी HER-2/neu p369 विशेष टी कोशिकाओं की अपघट्य गतिविधि को कम नहीं किया. एंटीबॉडी के रूप में anti-CD3/CD28 मोतियों के साथ गैर विशेष रूप से सक्रिय थे कि टी कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया फैस और फैस Ligand के बीच बातचीत को बाधित कर सकता है. इन परिणामों का सुझाव है कि जबट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं गैर ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं के साथ परीक्षण कर रहे हैं, फैस ligand नाकाबंदी एक न्यूनतम करने के लिए गैर TCR मध्यस्थता बातचीत को कम करने की जरूरत हो सकती है. वैकल्पिक रूप से, अल्पकालिक सुसंस्कृत टी कोशिकाओं लाइनों का उपयोग करते समय टी कोशिकाओं का एक अंश ही पूर्व vivo पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया प्रतिजन के लिए विशिष्ट हैं, जिसमें MHC बेमेल की मध्यस्थता टी सेल सक्रियण की संभावना गैर विशिष्ट lysis के लिए अग्रणी हो सकता है. इस मामले में, अप्रासंगिक HLAs ब्लॉक कि एंटीबॉडी के अलावा warranted हो सकता है. P369 विशेष टी कोशिकाओं मैं निर्भर तरीके, या तो विरोधी एचएलए वर्ग मैं एंटीबॉडी या निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी सह संस्कृतियों के लिए जोड़ा गया एक एचएलए वर्ग में ट्यूमर कोशिकाओं को मार रहे थे, तो यह निर्धारित करने के लिए. जैसा p369 विशेष टी कोशिकाओं द्वारा चित्रा -3 सी, सेल में दिखाया एचएलए वर्ग मैं प्रतिबंध प्रदर्शन एंटीबॉडी के शामिल किए जाने से दबा दिया गया था. इस परख का विकास काफी हद तक SKBR3 का उपयोग किया गया था के बाद अंत में, यह पता लगाने के लिए अगर अन्य अनुयायी एचएलए महत्वपूर्ण थाA2 और HER-2/neu व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं p369 विशेष टी कोशिकाओं द्वारा मारा जा सकता है. इस प्रकार, टी कोशिकाओं को तैयार है और एचएलए A2 और HER-2/neu-expressing ट्यूमर कोशिकाओं, SKBR3, MCF 7, और HCC1419 कोशिकाओं को एक 1:05 के अनुपात में जोड़ा गया था. एचएलए-A2 नकारात्मक ट्यूमर कोशिका लाइन, BT20 एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. जैसा BT20 छोड़कर चित्रा 3 डी, इन अतिरिक्त ट्यूमर कोशिकाओं के सभी में दिखाया भी रूप में प्रतिबाधा द्वारा मूल्यांकन मारे गए थे. इस प्रकार, विधि एकाधिक लक्ष्य पक्षपाती ट्यूमर कोशिकाओं के लिए उपयोगी प्रतीत होता है.

प्रतिबाधा आधारित परख साइटोटोक्सिक टी सेल गतिविधि का पता लगाने में मानक क्रोमियम रिहाई परख की तुलना में अधिक संवेदनशील है

cytolytic गतिविधि उपाय है कि क्रोमियम (51 करोड़) रिहाई परख (सीआरए) लंबे CD8 टी सेल प्रतिक्रिया पर नजर रखने के द्वारा जो सोने के मानक किया गया है. इस परख में, लक्ष्य कोशिकाओं (जैसे ट्यूमर कोशिकाओं) 51 करोड़ के साथ लेबल रहे हैं. ज्यादातर मामलों में, स्वस्थ कोशिकाओं लक्ष्य का बहुमत बनाए रखने के लिए कर सकते हैंपरख के पाठ्यक्रम पर radiolabel. CD8 टी कोशिकाओं को आमतौर पर अलग सांद्रता में लक्ष्य कोशिकाओं, जोड़ा, और लक्ष्य कोशिकाओं की हत्या कर रहे हैं मध्यम में 51 करोड़ की रिहाई से पता चला है. एक तरफ यह खतरनाक विकिरण का उपयोग करता है कि इस तथ्य से, सीआरए के साथ दो प्रमुख समस्याओं को संवेदनशीलता की कमी कर रहे हैं और परख आम तौर पर इसकी उपयोगिता सीमित CD8 टी कोशिकाओं की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है. प्रतिबाधा आधारित परख unlabeled ट्यूमर कोशिकाओं या युक्त मानक polypropylene प्लेट युक्त ई प्लेटों या तो, अलग मात्रा में, सीआरए, HER-2/neu p369 विशेष टी कोशिकाओं इन विट्रो और अनुप्रयुक्त में उत्पन्न थे की तुलना में अधिक संवेदनशील था, तो यह निर्धारित करने के लिए 51 करोड़ लेबल लक्ष्य कोशिकाओं. माप, या तो प्रतिबाधा या मुफ्त क्रोमियम, टी सेल इसके बाद 5 घंटे में मापा गया. चित्रा 4, एक प्रतिनिधि उदाहरण, प्रतिबाधा परख क्रोमियम रिहाई से बेहतर साबित दिखाता है.

इंट्रा परख भिन्नताप्रतिबाधा आधारित परख का आमतौर पर नीचे 20% है.

इस परख के व्यापक उपयोग काफी हद तक अपनी reproducibly और भिन्नता (चित्रा 5) द्वारा निर्धारित किया जाएगा के बाद से अंतरराज्यीय परख बढ़ रहे हैं, जांच की गई थी. दो p369 विशेष टी सेल लाइनों के 30 दिनों के अलावा स्वतंत्र रूप से उत्पन्न होता है और टी सेल अनुपात को ट्यूमर सेल की एक सीमा से अधिक तीन प्रतियों में जोड़ा गया था. लाइनों SKBR3 कोशिकाओं lysing के मामले में काफी हद तक बराबर थे कि चित्रा 5 में इनसेट ग्राफ से पता चलता है. विभिन्नता का% गुणांक प्रत्येक कोशिका अनुपात की गणना और साजिश रची गई थी. 01:40 और 01:05 के अनुपात के बीच चित्रा 5 में दिखाया गया है भिन्नता (सीवी) का% गुणांक नीचे 15% थे. 1:2.5 और 1:1.25, तथापि, सीवी उच्च या अप्रत्याशित थे. क्योंकि व्यापक जीवविज्ञान भिन्नता की, यह प्राथमिक टी सेल लाइनों के साथ अंतर - परख परिवर्तनशीलता को मापने के लिए संभव नहीं है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रतिबाधा टी कोशिकाओं के अलावा निम्नलिखित सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. पैनल: ट्यूमर कोशिकाओं (लाल रेखा) और नहीं टी कोशिकाओं (ब्लू लाइन) प्रतिबाधा के लिए जिम्मेदार हैं, यह दर्शाता है कि. अकेले ट्यूमर या टी या तो कोशिकाओं के लिए 40 घंटे से अधिक प्रतिबाधा ट्रेसिंग हैं दिखाया. इसी तरह के परिणाम एक दूसरे प्रयोग से प्राप्त किया गया. . लगभग 20 घंटे में संकेत गड़बड़ी ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त नहीं कुओं के लिए टी कोशिकाओं के अलावा के बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है कि पैनल बी नोट: प्रतिबाधा माप transiently ट्यूमर कोशिकाओं टी कोशिकाओं के अलावा के साथ बाधित कर रहे हैं कि पता चलता है. यह टी कोशिकाओं के अलावा के बाद कुछ समय बिंदु (ग्राफ में चिह्नित सामान्य बनाने की बात देखें) को सामान्य बनाने की आवश्यकता है. निशान डुप्लिकेट डेटा बिंदु से बना रहे हैं. अकेले ट्यूमर कोशिकाओं के लिए ट्रेस लाल रंग में दिखाया गया है. 1.25 टी कोशिकाओं / ग्रीन ट्यूमर सेल के अनुपात: अन्य निशान ट्यूमर कोशिकाओं HER-2/neu p369 विशेष टी कोशिकाओं (ब्लू के साथ सह सुसंस्कृत प्रतिनिधित्व करते हैं:) / सेल ट्यूमर 40 टी कोशिकाओं का अनुपात. प्रत्येक ट्रेस संस्कृति की अवधि के माध्यम से हर 5 मिनट एकत्र डुप्लिकेट डेटा बिंदु से गणना की है. परिणाम 3 अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. टी कोशिकाओं द्वारा प्रतिबाधा मध्यस्थता में कमी खुराक निर्भर है. पैनल: दिखाया SKBR3 ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिबाधा निशान अकेले या ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं के अलग सांद्रता के साथ incubated हैं. प्रत्येक ट्रेस संस्कृति की अवधि के माध्यम से हर 5 मिनट एकत्र तीन प्रतियों डेटा बिंदुओं से गणना की है. परिणाम 3 अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं कक्ष बी:. / सेल ट्यूमर सेल सांद्रता सभी टी भर में 10 घंटे में सेल सूचकांक हैं दिखाया. धराशायी लाइन ट्यूमर कोशिकाओं अल लिए सेल सूचकांक का प्रतिनिधित्व करता हैएक. प्रत्येक प्रतीक तीन प्रतियों निर्धारण का मतलब (± SEM) है. परिणाम 3 अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिबाधा आधारित परख प्रतिजन विशेष साइटोटोक्सिक टी सेल प्रतिक्रिया का पता लगाता है. पैनल एक HER-2/neu सह संस्कृति का अनुसरण p369 विशेष टी कोशिकाओं (लाल) या फ्लू विशेष टी 5, 10 में कोशिकाओं (ब्लू), और 15 घंटे से SKBR3 कोशिकाओं के सेल के स्तर को दर्शाता है. प्रत्येक डेटा बिंदु तीन प्रतियों माप का मतलब (± SEM) है. परिणाम 3 अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. पैनल बी कि प्रतिजन विशेष सेल फैस फैस ligand बातचीत की वजह से नहीं है, प्रदर्शन p369 विशेष टी कोशिकाओं या गैर विशेष रूप से सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा SKBR3 की सेल से पता चलता है. काले सलाखों सह संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैंएक फैस ligand एंटीबॉडी निहित. प्रत्येक बार टी कोशिकाओं के अलावा निम्नलिखित 5 घंटे में तीन प्रतियों में मतलब (± SEM) सेल है. परिणाम 3 अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. पैनल सी 10 घंटे p369 विशेष टी कोशिकाओं द्वारा SKBR3 की टी सेल इसके बाद सेल से पता चलता है एचएलए वर्ग मैं निर्भर है. एचएलए वर्ग मैं अवरुद्ध या निर्धारण नियंत्रण या तो सह संस्कृति के दौरान जोड़ा गया था. प्रत्येक बार तीन प्रतियों में मतलब (± SEM) सेल है. इस प्रयोग से इसी तरह के परिणाम के साथ दो बार दोहराया गया था. पैनल डी 10 घंटे p369 विशेष टी कोशिकाओं द्वारा कई एचएलए-A2 + HER-2/neu-expressing ट्यूमर सेल लाइनों के टी सेल इसके बाद% सेल से पता चलता है. BT20, एक एचएलए-A2 नकारात्मक स्तन कैंसर कोशिका लाइन एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. हर जगह तीन प्रतियों निर्धारण से गणना एक अनूठा प्रयोग का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

"चित्रा 4 चित्रा. प्रतिबाधा आधारित परख ट्यूमर प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए क्रोमियम रिहाई परख की तुलना में अधिक संवेदनशील है. दिखाया ट्यूमर और टी सेल के बाद 5 घंटे में मापा p369 विशेष टी कोशिकाओं के अलग सांद्रता के जवाब में SKBR3 का% सेल हैं प्रतिबाधा आधारित परख और क्रोमियम रिहाई परख दोनों का उपयोग कर मिश्रण. प्रत्येक प्रतीक तीन का मतलब (± SEM) replicates है. परिणाम 3 अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिबाधा आधारित टी सेल cytotoxicity परख की भिन्नता का% अंतर परख गुणांक. दिखाया प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की सांद्रता का एक सीमा से अधिक SKBR3 की सेल में भिन्नता का मतलब (± एसडी)% अंतर परख गुणांक हैं. प्रत्येक प्रतीक replicates तीन का मतलब है. ग्राफ में दिखाया नंबर टी रहे हैंवह% सीवी मतलब है. इनसेट पैनल (± SEM n = 3) p369-377 विशेष टी कोशिकाओं की सांद्रता में अलग SKBR3 का% सेल, इसका मतलब यह पता चलता है. दो अलग दाताओं से टी कोशिकाओं का उपयोग कर दो स्वतंत्र रूप से उत्पन्न p369 विशेष टी सेल लाइनों दिखाए जाते हैं.

Discussion

CD8 टी कोशिकाओं को सीधे संक्रमित या घातक कोशिकाओं 4 मार करने में सक्षम किया जा रहा है, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं. प्रतिजन विशेष CD8 टी कोशिकाओं (जैसे ELISPOT, tetramer, प्रवाह cytometry) की संख्या को मापने के लिए कई तरीके हैं, अक्सर यह है कि इन कोशिकाओं 3 कार्यात्मक साइटोटोक्सिक हैं कि क्या पता करने के लिए उपयोगी है. साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन करने के लिए सबसे पहचानने परख स्वर्ण मानक परख 4 माना जाता है जो सीआरए, है. सीआरए के प्रमुख सीमाओं रेडियोधर्मिता की (1) की आवश्यकता है, संवेदनशीलता की (2) कमी, यंत्रवत जानकारी की (3) अभाव, कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के लिए (4) की आवश्यकता है, और (5) श्रमसाध्य सेट अप कर रहे हैं. इस प्रकार, पिछले एक दशक में, इन सीमाओं को कम करने के लिए नई रणनीति अपनाने में रुचि रही है. नए दृष्टिकोण शामिल उन कि उपाय कस्पासे रिहाई 4, बीएलटी esterase activity5, और CD107 6 की सतह अभिव्यक्ति. वर्तमान पांडुलिपि से पता चलता है किरॉश xCELLigence सिस्टम पर प्रदर्शन प्रतिबाधा आधारित परख,, भी सीआरए के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोगी हो सकता है. प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण के लिए अनुकूल करने की क्षमता सतहों कस पालन नहीं है जो टी कोशिकाओं, इस प्रकार की माप के साथ टी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष हस्तक्षेप की किसी भी चिंता को कम प्रतिबाधा पर ज्यादा प्रभाव नहीं दिखाई देते हैं कि अवलोकन पर टिकी हुई है. प्रतिबाधा परख प्रणाली के उपयोग के लिए आवश्यक श्रम काफी कम मुख्य रूप से रेडियोधर्मिता के उपयोग के लिए विनियामक चिंताओं के उन्मूलन की वजह से होने की उम्मीद है. प्रतिबाधा आधारित प्रणाली का ही उल्लेखनीय दोष $ 50,000 से 60,000 डॉलर की एक परिव्यय xCELLigence इकाई की खरीद के लिए आवश्यक है. हालांकि, xCELLigence इकाई एक विकिरण काउंटर के लिए समाप्त की जरूरत है और टी सेल cytotoxicity 8 के अलावा दवाओं और प्रवास के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए उपयोगी किया जा रहा है, कहीं अधिक बहुमुखी है.

कि टिप्पणियोंट्यूमर कोशिका प्रतिबाधा में कमी खुराक पर निर्भर है, के रूप में एक सरल माध्यमिक द्विघात समारोह के बाद एक यथोचित खड़ी ढलान के साथ, चित्रा 2 में दिखाया गया परख 9 साइटोटोक्सिक कोशिकाओं की आवृत्ति का अनुमान लगाने के कमजोर पड़ने assays के (LDAs) को सीमित करने में इस्तेमाल किया जा सकता है, . प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण के साथ एक लाभ यह आवश्यक टी कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या झील प्राधिकरण संभवतः अधिक व्यावहारिक बनाने, सीआरए से भी कम है. उदाहरण के लिए, सीआरए में, एक 1:40 के अनुपात में, अच्छी तरह से प्रति 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति 4 एक्स 10 कुल 6 टी कोशिकाओं की आवश्यकता है जो चढ़ाया हैं. हालांकि, प्रतिबाधा आधारित परख में, अच्छी तरह से प्रति केवल 1.5 एक्स 10 4 ट्यूमर कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से केवल 6 एक्स 10 5 कुल टी कोशिकाओं की खपत है, जो आवश्यक हैं. इस प्रकार, प्रतिबाधा आधारित परख 85% कम टी कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करता है. यह कमी प्रतिबाधा आधारित प्रणाली मानव नैदानिक ​​परीक्षणों में immunologic निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है पता चलता है कि जहां टीरक्त की वह मात्रा में सीमित हो सकता है छोड़ता है. सीआरए एक ही समय बात करने के लिए सीमित है, जबकि इसके अलावा, प्रतिबाधा आधारित परख उपयोगकर्ता न्यूनतम अतिरिक्त श्रम और कोशिकाओं के साथ ही प्रयोग पर कई lysis समय अंक की तुलना करने की अनुमति देता है, निरंतर वास्तविक समय डाटा एकत्र करता है. आवृत्ति गणना संभावित 10 कुल प्रतिजन विशेष CD8 टी कोशिकाओं को कार्यात्मक साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं का अनुपात स्थापित करने के लिए इस तरह के tetramer विश्लेषण के रूप में समारोह उपाय नहीं है कि अन्य रणनीतियों के साथ जोड़ा जा सकता है. प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण का सबसे आकर्षक सुविधाओं में से एक सबसे अन्य assays के विपरीत, cytotoxicity संभवतः यह आसान inhibitors या एंटीबॉडी के उपयोग के साथ सेलुलर बातचीत का अध्ययन कर रही है, वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है, कि है. एक अन्य विधि लेबलिंग विरोध है कि ट्यूमर कोशिकाओं के लिए उपयुक्त हो सकता है. गैर मारे ट्यूमर कोशिकाओं लेबल और नहीं रह रहे हैं क्योंकि अन्त में, बाँझ, आगे फसल और टी सेल प्रतिरोधी कोशिकाओं का अध्ययन possib हैले.

दोनों प्रणालियों विशेष टी कोशिकाओं के जवाब में ट्यूमर को मारने के डेटा प्रदान करते हुए संक्षेप में, प्रतिबाधा आधारित परख सीआरए की तुलना में अधिक संवेदनशील है और एक अधिक लचीला मंच प्रदान करता है.

Disclosures

उत्पादन और इस वीडियो लेख के नि: शुल्क प्रवेश Roche Diagnostics द्वारा प्रायोजित है.

Acknowledgments

इस काम के इलाज फाउंडेशन और NIH / NCI, 9R01 CA152045 और P50-CA116201 के लिए सुसान जी Komen से कीथ एल Knutson को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03 Used to isolate PBMCs from blood
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV Cell culture media
FBS Denville Scientific FB5001-H Cell culture media
Human IL-2 eBioscience 14-8029-81 For stimulating growth of T cells
Human Interferon gamma Cell Sciences CR2026 For stimulating MHC expression in tumor cells
HER-2/neu p369-377 peptide Mayo Clinic peptide synthesis core amino acid sequence KIFGSLAFL Binds to HLA-A2
Influenza p58-66 peptide Mayo Clinic peptide synthesis core amino acid sequence GILGFVFTL Binds to HLA-A2
Human CD3/CD28 Dynabeads Invitrogen 111-61D For non-specific T cell activation and expansion
Chromium-51 MP Biomedicals 62015 CRA labeling reagent
E-plate Roche Group 05469830001 For xCelligence impedance unit
Luma plate 96 PerkinElmer, Inc. 6005630 For measuring radioactivity in the Top Count NXT.
xCelligence RTCA DP Station Roche Applied Science RTCA DP Impedance unit
Top Count NXT PerkinElmer, Inc. C990601 Scintillation & Luminescence Counter
Fas Ligand antibody BD Biosciences 556372 For blocking Fas-Fas ligand interactions
HLA-A2 BB7.2 antibody BD Biosciences 551230 For blocking HLA class I
Mouse IgG2b, κ BD Biosciences 555740 Isotype control for HLA class I
SKBR3 tumor line ATCC HTB-30 Adenocarcinoma
MCF7 tumor line ATCC HTB-22 Adenocarcinoma
HCC1419 tumor line ATCC CRL-2326 Primary ductal carcinoma
BT20 tumor line ATCC HTB-19 Carcinoma

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References

  1. Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
  2. Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
  3. Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
  4. Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
  5. Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
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  8. Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
  9. Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
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इम्यूनोलॉजी अंक 66 चिकित्सा कैंसर जीवविज्ञान टीका प्रतिरक्षा दत्तक टी सेल थेरेपी लिम्फोसाइट सीडी 8 टी कोशिकाओं
XCELLigence सिस्टम को Cr51 रिलीज परख तुलना द्वारा मानव Her2neu विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं के इष्टतम साइटोटोक्सिक गतिविधि निर्धारण
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Erskine, C. L., Henle, A. M.,… More

Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System. J. Vis. Exp. (66), e3683, doi:10.3791/3683 (2012).

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