Summary
Het chromium afgifte assay, een gemeenschappelijke test voor het detecteren cytotoxische T-celactiviteit, heeft verschillende beperkingen. Gebruikmakende van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen en humane borsttumor lijn, SKBR3, in dit artikel is een impedantie-gebaseerde aanpak onderzocht kan detecteren celdoding.
Abstract
Cytotoxische CD8 T-cellen vormen een subgroep van T-cellen die in staat zijn tot het induceren de dood van geïnfecteerde of kwaadaardige gastheercellen 1. Deze cellen brengen een speciale receptor, genaamd de T-celreceptor (TCR), die een specifieke antigene peptide gebonden aan HLA klasse I moleculen 2 kan herkennen. Betrokkenheid van geïnfecteerde cellen of tumorcellen door hun HLA klasse I molecule resulteert in productie van lytische moleculen zoals granzymen en perforin resulteert in target celdood. Hoewel het nuttig om frequenties van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen met assays zoals de ELIspot of flowcytometrie bepalen is ook nuttig om de sterkte van CD8 T celresponsen cytotoxiciteitstests 3 bepalen. De meest herkenbare assay voor de beoordeling cytotoxische functie is Chromium-afgifte assay (CRA), die als standaard test 4. Het RB heeft verschillende beperkingen, waaronder blootstelling van cellen aan gammastraling, lack reproduceerbaarheid en een vereiste voor grote aantallen cellen. In het afgelopen decennium is er belangstelling voor de vaststelling van nieuwe strategieën om deze beperkingen te overwinnen. Nieuwere benaderingen omvatten die die maatregel caspase versie 4, BLT esterase activiteit 5 en oppervlakte-expressie van CD107 6. De impedantie gebaseerde assay, met de Roche xCELLigence systeem, werd onderzocht in dit document voor zijn potentieel als een alternatief voor de CRA. Impedantie of verzet tegen een elektrische stroom ontstaat wanneer hechtende tumorcellen binden aan elektrode platen. Tumorcellen los na doden en elektrische impedantie verminderd kan worden gemeten door de xCELLigence systeem. De mogelijkheid om de impedantie benadering aan cel-gemedieerde doding beoordelen berust op de waarneming dat T-cellen niet goed hechten aan de meeste oppervlakken en lijken niet veel invloed op de impedantie dus zwakker wordt zorg van directe interferentie van de T-cellen metde meting. Resultaten tonen aan dat de impedantie gebaseerde assay kan detecteren veranderingen in de niveaus van antigeen-specifieke cytotoxische CD8 T-cellen met verhoogde gevoeligheid ten opzichte van de standaard CRA. Gebaseerd op deze resultaten, kan impedantie-gebaseerde benaderingen goede alternatieven voor RB of andere benaderingen die gericht zijn op cytotoxische CD8 T-cel functies te meten.
Protocol
1. Generatie van korte termijn Menselijke Antigeen-specifieke CD8 T cel lijnen 7
- Afzonderlijke perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit bloed van normale gezonde HLA-A2 positieve donoren middels Ficoll-Paque plus.
- Voeg 2 ml / putje van PBMC op 6-putjes platen bij 2 x 10 6 cellen / ml.
- Voeg HLA-A2-bindende HER-2/neu p369-377 peptide (aminozuursequentie KIFGSLAFL) of HLA-A2-bindende influenza p58-66 peptide (GILGFVFTL) direct aan de putjes bij een eindconcentratie van 10 ug / ml en plaats in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Te helpen stimuleren en vergroten T-cellen, voeg, om de 2 dagen, 250 pl / putje vers medium aangevuld met humaan recombinant IL-2 (voorraad: 50 eenheden / pl) tot een eindconcentratie van 50 eenheden / ml in het kweekmedium bereiken.
- Opnieuw stimuleren van de kweekcellen met 2 x 10 6 cellen / ml bestraalde autologe PBMC gepulst gedurende 2 uur met 10 ug / ml van dezelfde peptiden gebruikend in stap 1.3 en voeg deze cellen te kweken bij 1 ml / putje een week na de eerste peptide stimulatie.
- Voeg menselijke recombinant IL-2 en vers medium, zoals beschreven in stap 1.4, in de bestaande culturen elke 2 dagen.
- Opnieuw stimuleren van de cellen met peptide en bestraalde autologe PBMC zoals beschreven in stap 1.5 een week na de tweede peptide stimulatie.
- Bereid cellen gebruiken zes dagen na de laatste herstimulatie op zijn vroegst.
2. Voorbereiding van borstkankercellen
- Plaats de xCELLigence impedantie meetstation (xCELLigence station) in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Harvest humane tumorcellen (SKBR3, BT20, MCF7 of HCC1419) die 75% confluent met 0,25% trypsine en centrifugatie (1000 rpm gedurende 5 minuten).
- Telling tumorcellen met behulp van een hemocytometer en ze langs tumor RPMI medium (aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 500 eenheden / mlIFN-gamma) in een concentratie van 7,5 x 10 3 tumor cells/100 pl.
- Programma de xCELLigence software door het opzetten van de lay-out pagina om goed layout te bepalen en door het opzetten van het schema pagina naar impedantie metingen te nemen om de 5 minuten gedurende een periode van 40 uur. Voor de eerste 18 uur wordt de xCELLigence netimpedanties lezingen van alleen de tumorcellen nemen.
- Voeg 100 ul van RPMI medium om de tumor xCELLigence E-borden en een achtergrondsynchronisatie lezing door het meten impedantie in afwezigheid van cellen.
- Voeg tumorcellen aan de E-platen bij 100 ul per putje en plaats in de xCELLigence station.
- Druk op de startknop van de xCELLigence software om te beginnen met het nemen van impedantie metingen van de tumorcellen, die onmiddellijk beginnen met vast te houden aan de E-platen.
3. Co-cultuur van de Tumor met CD8-T-cellen
- Nadat de tumorcellen 4 x 10 tumorcellen per putje (onge hebben gehecht en verdubbeld tot 1,5veer 18 uur na aanvankelijk zijn verguld), oogst T-cellen bereid in afdeling 1 door zachte schrapen en agitatie
- Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten en tel T-cellen met een hemocytometer en ze langs RPMI medium met 10% FBS bij verschillende verhoudingen, vanaf een maximale verhouding van 1 tumorcel 40 T-cellen en verdun 2-voudig tot een verhouding van 1 tumorcel 1,25 T-cellen wordt bereikt. Zo zijn er 1,5 x 10 4 tumorcellen per putje. Een 01:40-verhouding te bereiken, voeg 6 x 10 5 T-cellen per putje en verdun de T-cellen 2-voudig tot een verhouding van 1,5 x 10 4 tumorcellen tot 1,875 x 10 4 T-cellen per putje (1:1,25 verhouding) wordt bereikt.
- Pauzeren xCELLigence station en verwijder de e-plaat.
- Verwijder het medium in de putjes met een pipet en voeg 200 ul alleen media of de geschikte verhouding van T-cellen aan de putjes.
- Plaats de E-plaat terug in de xCELLigence station en blijven de xCELLigence software program dus impedantie metingen worden elke 5 minuten voor ongeveer 20 uur na de T-cel toevoeging genomen.
- Normaliseren van de resultaten aan het einde van de assay.
4. Chroom release Assay (CRA) 7
- Volg institutionele straling veiligheidsprocedures bij het werken met 51 Cr en 51 Cr-gelabelde doelcellen. Gebruik altijd de juiste afscherming om blootstelling aan straling te verminderen.
- Pulse tumorcellen gedurende 2 uur bij 1 x 10 6 tumorcellen / ml met 10 ul / ml vers 51 Cr (0.005 Ci / ml).
- Wassen tumorcellen in 10 ml RPMI medium met 10% FBS en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Voeg tumorcellen een 96-well rondbodem plaat bij 1 x 10 5 tumorcellen in 100 ul / well.
- Do cellen bij verschillende verhoudingen van 1 af tumorcel 40 T-cellen en verdun 2-voudig tot een verhouding van 1 tumorcel 1,25 T-cellen wordt bereikt. Zo zijn er 1 x 10 5 tumorcellen per putje. Een 01:40 verhouding te, voeg 4 x 10 6 T cellen per well en verdun de T-cellen 2-voudig tot een verhouding van 1 x 10 5 tumorcellen tot 1,25 x 10 5 T-cellen per putje (1:1,25 verhouding) wordt bereikt.
- Voeg spontane en maximale tumorcel controles aan de plaat. Om de spontane afgifte van 51 Cr berekenen van de tumorcellen, voeg zes putjes die elk 1 x 10 5 tumorcellen in 100 ul tot 100 ul van RPMI medium met 10% FBS. Om maximale afgifte van 51Cr berekenen van de tumorcellen, voeg zes putjes die elk 1 x 10 5 tumorcellen in 100 ul tot 100 ul 0,1% Triton X-100 in PBS, waarin alle cellen lyseert.
- Incubeer de platen gedurende 5 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Na incubatie, verwijder 50 ul van de supernatant uit elk putje en voeg deze toe aan een Luma plaat.
- Droog de platen gedurende de nacht en meet met behulp van een CPM Gamma Counter.
- Impedantie test: Neem de impedantie lezen, gerapporteerd als de cel index (CI), op verschillende tijdstippen en gebruik de volgende formule om procent lysis bepalen: (CI tumor alleen - (CI tumor + T-cellen)) / (CI alleen tumor) * 100.
- CRA: Gebruik de volgende formule om procent lysis te bepalen: (CPM experimenteel - CPM spontaan) / (CPM maximaal - CPM spontane) * 100.
6. Representatieve resultaten
T-cellen alleen niet verhogen impedantie
T-cellen, in het algemeen, zich niet houdt aan de meeste vaste oppervlakken en geen hechting voor activering en proliferatie niet nodig. Derhalve werd verondersteld dat T-cellen niet bijdraagt aan de impedantie xCELLigence E-platen. Om dit te testen, werden putten geladen met ofwel SKBR3 borstkankercellen of vers gezuiverde humane CD8 T-cellen. Impedantie werd gemeten in de loop van 40 uur en een representatief voorbeeld demonstreizigers wezen weinig effect van T-cellen is getoond in figuur 1A. In tegenstelling, zou men kunnen stellen dat de T-cellen achtergrond impedantie kan afnemen, zij het slechts licht. Desondanks co-cultuur bleek dat het toevoegen van T-cellen op 18 uur na de start van impedantiemetingen resulteerde in een impedantie ontwrichting (Figuur 1B). Andere studies toonden aan dat verstoringen waren mede het hanteren omdat de vermindering van signaal kan worden verminderd door ervoor te zorgen dat de temperatuur van de T-cel-bevattende oplossing werd hetzelfde als het interieur van de incubator.
Verlagingen van de impedantie gemedieerd door T-cellen zijn dosis-afhankelijk.
Het nut van een impedantie-gebaseerde test monsters Vergelijk cytotoxische T cel activiteit vereist het onderscheiden tussen verschillende concentraties van antigen-specifieke T-cellen. Om te testen of dit mogelijk is, SKBR3 cellen werden samen gekweekt met verschillende concentratiesties van T-cellen afkomstig van een HER-2/neu p369-specifieke T-cellijn. Zoals getoond in figuur 2A, vermindering impedantie waren afhankelijk van de dosis van T-cellen. Figuur 2B toont dat de celindices op 10 uur volgen een eenvoudige tweede orde polynoom over het bereik van T-cellen. Dus de xCELLigence station bewaakt CD8 T cel gemedieerde dood van SKBR3 tumoren in real time als een daling celindex.
De impedantie gebaseerde assay detecteert antigeen-specifieke T-cellen
Om te bepalen of vermindering impedantie van SKBR3, een HER-2/neu en HLA-A2 positieve borsttumor cellijn, met HER-2/neu p369-specifieke T cellen antigen specifieke afzonderlijke putjes bevattende SKBR3 werden geïncubeerd met T cellen afkomstig van een influenza (FLU)-specifieke T-cellijn. De FLU-specifieke T-cellen dienden als een niet-specifieke controle, die HLA-A2 positief, maar niet met een vermogen HER-2/neu te herkennen. Zoals weergegeven in Fi-guur 3, is er een significant verschil tussen de lytische activiteit van HER-2/neu p369-specifieke T-cellen in vergelijking met FLU-specifieke T-cellen (p <0,0001). In sommige gevallen, T-cellen niet specifiek zijn voor tumor (bijv. FLU-specifieke of anti-CD3/anti-CD28 gestimuleerde) toonde een lage lytische activiteit (Figuren 3A-B). T-cellen kunnen doden op twee manieren, hetzij niet-specifiek door Fas: Fas ligand interacties of antigeen-specifiek door het vrijkomen van granzymen en perforins. Om verder te bevestigen het idee dat HER-2/neu-specific T-cellen werden gedood in een antigeen-specifieke manier, we opgenomen een blokkerend antilichaam tegen Fas-ligand. Zoals getoond in fig. 3B, heeft het antilichaam niet de lytische activiteit van het HER-2/neu p369-specifieke T-cellen te verminderen. Het antilichaam kan wisselwerkingen tussen Fas en Fas Ligand, zoals aangetoond met T-cellen die waren niet-specifiek geactiveerd met anti-CD3/CD28 kralen remmen. Deze resultaten suggereren dat, wanneertumor-specifieke T-cellen worden getest met niet-tumor-specifieke T-cellen kunnen Fas ligand blokkade vereist om niet-TCR gemedieerde interacties tot een minimum. Als alternatief, bij gebruik op korte termijn gekweekte T-cellijnen waarin slechts een fractie van de T-cellen specifiek voor het antigeen voor ex vivo generatie, zou de mogelijkheid van MHC mismatch-gemedieerde T cel activatie raken en daardoor niet-specifieke lysis. In dit geval kan de toevoeging van antilichamen die de irrelevante HLAs blokkeren gerechtvaardigd. Om te bepalen of de p369-specifieke T-cellen doden van tumorcellen in een HLA klasse I afhankelijke wijze, hetzij anti-HLA-klasse I antilichaam of isotype controle antilichaam werden aan het co-culturen. Zoals getoond in figuur 3C, lysis door p369-specifieke T-cellen werd onderdrukt door toevoeging van antilichaam aantonen HLA klasse I restrictie. Tenslotte, aangezien de ontwikkeling van deze assay grotendeels uitgevoerd met SKBR3 was het belangrijk vast te stellen of andere hechtende HLA-A2 en HER-2/neu tot expressie tumorcellen konden worden gedood door p369-specifieke T-cellen. Zo werden T-cellen bereid en toegevoegd in een 01:05 verhouding van de HLA-A2 en HER-2/neu-expressing tumorcellen SKBR3, MCF-7 en HCC1419 cellen. De HLA-A2 negatieve tumor cellijn, BT20 werd gebruikt als een negatieve controle. Zoals getoond in figuur 3D, al deze extra tumorcellen behalve BT20 werden gedood zoals beoordeeld door impedantie. Aldus wordt de werkwijze bruikbaar voor meerdere doel hechtende tumorcellen zijn.
De impedantie-gebaseerde test is gevoeliger dan de standaard chromium-afgifte assay detectie cytotoxische T-celactiviteit
Het chroom (51 Cr) afgifte test (CRA) dat cytolytische activiteit meet is al lange tijd de gouden standaard voor het CD8 T-cel responsen te controleren. In deze assay worden doelwitcellen (bijv. tumorcellen) gelabeld met 51Cr. In de meeste gevallen kan gezonde doelcellen de meeste behoudenradiolabel in de loop van de test. CD8 T-cellen worden toegevoegd aan de doelcellen, gewoonlijk bij variërende concentraties, en het doden van de doelwitcellen wordt gedetecteerd door de afgifte van 51Cr in het medium. Afgezien van het feit dat het gebruikt gevaarlijke straling, twee grote problemen de CRA een gebrek aan gevoeligheid en de test vereist normaliter grote hoeveelheden CD8 T-cellen beperkt de bruikbaarheid. Om te bepalen of de impedantie gebaseerde assay gevoeliger was dan de CRA, HER-2/neu p369-specifieke T-cellen werden in vitro gegenereerd en toegepast, in verschillende hoeveelheden, ofwel E-platen met gemerkte tumorcellen of standaard polypropyleen platen die 51 Cr-gemerkte doelcellen. Metingen, hetzij impedantie of gratis chroom, werden gemeten bij 5 uur na T cel toevoeging. Figuur 4, een representatief voorbeeld, toont de impedantie test beter presteert dan de chroom release.
De intra-assay variatievan de impedantie gebaseerde assay meestal onder 20%.
Intra-assay variatie onderzocht, aangezien toenemende gebruik van deze assay wordt grotendeels bepaald door de reproduceerbaar en variatie (figuur 5). Twee p369-specifieke T-cellijnen werden onafhankelijk 30 dagen apart gegenereerd en in drievoud toegevoegd over een reeks tumorcel T cel verhoudingen. De inzet grafiek in figuur 5 laat zien dat de lijnen waren grotendeels gelijkwaardig qua lyseren SKBR3 cellen. De variatiecoëfficiënt% is berekend op het moment celverhouding en uitgezet. Zoals getoond in figuur 5, 1:40-01:05 ratio% de variatiecoëfficiënten (CV) was dan 15%. Op 1:2,5 en 1:1,25, maar de CV kon hoog of onvoorspelbaar. Door uitgebreide biologische variatie is het niet mogelijk om inter-assay variatie meten primaire T cellijnen.
Figuur 1. Impedantie moet worden genormaliseerd na toevoeging van de T-cellen. Paneel A: toont aan dat tumorcellen (rode lijn) en geen T-cellen (blauwe lijn) zijn verantwoordelijk voor de impedantie. Getoond zijn de impedantie traces meer dan 40 uur voor of tumor of T-cellen alleen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen uit een tweede experiment. Merk op dat het signaal verstoring ongeveer 20 uur vertegenwoordigt het punt van toevoeging van T-cellen in de putjes zonder tumorcellen Paneel B:. Blijkt dat impedantiemetingen tijdelijk verstoord met de toevoeging van T-cellen om tumorcellen. Dit vereist normalisering op een tijdstip na toevoeging van T-cellen (zie bijzondere normalisatie gemarkeerd grafiek). Sporen zijn samengesteld uit dubbele gegevens punten. Het trace voor de tumorcellen alleen wordt getoond in het rood. De andere sporen vormen tumorcellen samen gekweekt met HER-2/neu p369-specifieke T-cellen (blauw: verhouding van 1,25 T cellen / tumorcel Green:verhouding van 40 T cellen / tumorcel). Elk spoor wordt berekend uit dubbele datapunten elke 5 minuten verzameld via de duur van de kweek. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Vermindering impedantie gemedieerd door T-cellen is dosisafhankelijk. Paneel A: Getoond zijn de impedantie sporen van SKBR3 tumorcellen alleen of met verschillende concentraties van tumor-specifieke T-cellen geïncubeerd. Elk spoor wordt berekend uit drievoudige datapunten elke 5 minuten verzameld via de duur van de kweek. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten Paneel B:. Getoond zijn celindices op 10 uur voor alle T cel / tumorcel-concentraties. De stippellijn geeft de cel index voor tumorcellen al.een. Elk symbool is de gemiddelde (± SEM) van drievoudige bepalingen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. De impedantie gebaseerde assay detecteert antigeen-specifieke cytotoxische T-cel responsen. Panel A toont de mate van lysis van SKBR3 cellen door HER-2/neu p369-specifieke T-cellen (rood) en FLU-specifieke T-cellen (blauw) en 5, 10 en 15 uur na de co-cultuur. Elk gegevenspunt is het gemiddelde (± SEM) van drievoudige metingen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. Paneel B toont lysis van SKBR3 door p369-specifieke T-cellen of niet-specifiek geactiveerde T-cellen, hetgeen aantoont dat antigeen-specifieke lysis niet door Fas Fas-ligand interacties. Zwarte balken vertegenwoordigen co-culturen diebevatte een Fas ligand antilichaam. Elke balk is de gemiddelde (± SEM) lysis in drievoud 5 uur na toevoeging van T-cellen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. Paneel C toont lysis 10 uur na toevoeging van T-cel SKBR3 door p369-specifieke T cellen HLA-klasse I afhankelijk. Ofwel HLA-klasse I blokkeringen of isotypecontrole werd tijdens co-cultuur toegevoegd. Elke bar is de gemiddelde (± SEM) lysis in drievoud. Dit experiment werd twee keer herhaald met vergelijkbare resultaten. Paneel D toont% lysis 10 uur na T cel toevoeging van verscheidene HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing tumorcellijnen door p369-specifieke T-cellen. BT20, werd een HLA-A2-negatieve borstkanker cellijn gebruikt als een negatieve controle. Elke plek is een uniek experiment berekend uit triplobepalingen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. De impedantie gebaseerde test is gevoeliger dan het chromium afgifte assay voor de detectie van tumor antigen-specifieke T-cellen. Vermeld zijn% lysis van SKBR3 in reactie op variërende concentraties p369-specifieke T-cellen zoals gemeten 5 uur na tumor en T- mixen met zowel de impedantie gebaseerde assay en chromium-afgifte assay. Elk symbool is de gemiddelde (± SEM) van de drie herhalingen. De resultaten zijn representatief voor 3 afzonderlijke experimenten.
Figuur 5. % Intra-assay coëfficiënt van variatie van de impedantie gebaseerde T cel cytotoxiciteit assay. Vermeld zijn gemiddelden (± SD)% intra-assay coëfficiënt van variatie in lysis van SKBR3 over een bereik van concentraties van antigeen-specifieke T cellen. Elk symbool is het gemiddelde van drie herhalingen. Cijfers aangegeven in de grafiek zijn thij bedoelt% CV. Inzet paneel toont de gemiddelde (± SEM, n = 3)% lysis van SKBR3, bij variërende concentraties van p369-377-specifieke T-cellen. Twee onafhankelijk gegenereerde p369-specifieke T-cellijnen met T-cellen van twee verschillende donoren zijn getoond.
Discussion
CD8 T cellen zijn belangrijk voor de adaptieve immuunrespons kunnen direct doden geïnfecteerde of kwaadaardige cellen 4. Hoewel er verschillende manieren om het aantal antigeen-specifieke CD8 T-cellen (bijv. ELIspot, tetrameer, flowcytometrie) te meten, is het vaak nuttig om te weten of deze cellen functioneel cytotoxisch 3. De meest herkenbare assay voor de beoordeling cytotoxische functie de CRA, die wordt beschouwd als de gouden standaard test 4. Belangrijke beperkingen van de CRA zijn (1) het vereiste van radioactiviteit, (2) het gebrek aan gevoeligheid, (3) het ontbreken van mechanistische informatie (4) vereiste grote hoeveelheden cellen, en (5) moeizaam set up. Zo is de afgelopen tien jaar, is er belangstelling voor de vaststelling van nieuwe strategieën om deze beperkingen te minimaliseren. Nieuwere benaderingen omvatten die die maatregel caspase versie 4, BLT esterase activity5, en oppervlakte-expressie van CD107 6. De huidige manuscript suggereert datde impedantie-gebaseerde test, uitgevoerd op het Roche xCELLigence systeem kan ook nuttig zijn als alternatief voor de CRA. De mogelijkheid om de impedantie-gebaseerde benadering passen berust op de waarneming dat T-cellen die niet goed kan hechten aan oppervlakken, lijken niet veel invloed hebben op de impedantie dus zwakker wordt zorg van directe interferentie van de T-cellen met de meting. De arbeid die nodig is voor het gebruik van de impedantie bepalingssysteem verwachting aanzienlijk minder hoofdzakelijk te wijten aan de verwijdering van het regulerende bezorgdheid over het gebruik van radioactiviteit. Het enige opvallende nadeel van de impedantie-gebaseerd systeem is dat een uitgave van $ 50.000 tot $ 60.000 is nodig voor de aankoop van de xCELLigence eenheid. De xCELLigence unit elimineert de noodzaak van een straling teller en is veelzijdiger, die nuttig is om cellulaire respons op drugs en migratie naast T-cel cytotoxiciteit 8.
De waarnemingen diede vermindering van tumorcel impedantie is dosisafhankelijk, zoals weergegeven in figuur 2, met een redelijk steile helling op een eenvoudig tweede kwadratische functie stelt de assay kan worden gebruikt in assays beperkende verdunning (LDA) de frequentie van cytotoxische cellen 9 schatten . Een voordeel van de impedantie-gebaseerde benadering is dat het aantal T-cellen en tumorcellen minder is dan de CRA, waardoor LDA potentieel haalbaar. Bijvoorbeeld, in de CRA, een 01:40 verhouding, 1 x 10 5 tumorcellen per putje van verchroomd welke 4 x 10 6 totale T-cellen per putje vereist. In de impedantie gebaseerde assay slechts 1,5 x 10 4 tumorcellen per well nodig, die slechts 6 x 10 5 totale T-cellen per putje verbruikt. Zo de impedantie-gebaseerde test gebruikt 85% minder T-cellen en tumorcellen. Deze verlaging suggereert dat de impedantie-systeem kan worden aangepast om immunologische bewaking in klinische proeven waarbij tHij volumes bloedafname kan worden beperkt. Ook, terwijl de CRA is beperkt tot een tijdstip, de impedantie gebaseerde bepaling verzamelt continu real-time data, waardoor de gebruiker meerdere lysis tijdstippen vergelijken op hetzelfde experiment met minimale extra arbeid en cellen. Frequentie berekeningen zou kunnen worden gecombineerd met andere strategieën die niet meten functioneren zoals tetrameer analyse de verhouding van functionele cytotoxische T-cellen vast aan totale antigeen-specifieke CD8 + T-cellen 10. Een van de meest aantrekkelijke eigenschappen van de impedantie-gebaseerde benadering is dat, in tegenstelling tot andere assays cytotoxiciteit kan worden gevolgd in real time mogelijk waardoor het makkelijker om cellulaire interacties met het gebruik van remmers of antilichamen bestuderen. Een ander is dat de methode geschikt is voor tumorcellen labeling kan weerstaan. Tenslotte, aangezien de niet gedode tumorcellen niet gelabeld en steriel blijven verdere oogst en onderzoek van de T-cel-resistente cellen possible.
Samengevat, terwijl beide systemen tumor doden data in antwoord op specifieke T-cellen, de impedantie-gebaseerde test is gevoeliger dan de CRA en een meer flexibel platform.
Disclosures
Productie en gratis toegang van deze video-artikel wordt gesponsord door Roche Diagnostics.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan Keith L. Knutson van de Susan G. Komen for the Cure Foundation en NIH / NCI 9R01 CA152045 en P50-CA116201.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Used to isolate PBMCs from blood |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | Cell culture media |
| FBS | Denville Scientific | FB5001-H | Cell culture media |
| Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-81 | For stimulating growth of T cells |
| Human Interferon gamma | Cell Sciences | CR2026 | For stimulating MHC expression in tumor cells |
| HER-2/neu p369-377 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence KIFGSLAFL | Binds to HLA-A2 |
| Influenza p58-66 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence GILGFVFTL | Binds to HLA-A2 |
| Human CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | 111-61D | For non-specific T cell activation and expansion |
| Chromium-51 | MP Biomedicals | 62015 | CRA labeling reagent |
| E-plate |  Roche Group |
05469830001 | For xCelligence impedance unit |
| Luma plate 96 | PerkinElmer, Inc. | 6005630 | For measuring radioactivity in the Top Count NXT. |
| xCelligence RTCA DP Station | Roche Applied Science |
RTCA DP | Impedance unit |
| Top Count NXT | PerkinElmer, Inc. | C990601 | Scintillation & Luminescence Counter |
| Fas Ligand antibody | BD Biosciences | 556372 | For blocking Fas-Fas ligand interactions |
| HLA-A2 BB7.2 antibody | BD Biosciences | 551230 | For blocking HLA class I |
| Mouse IgG2b, κ | BD Biosciences | 555740 | Isotype control for HLA class I |
| SKBR3 tumor line | ATCC | HTB-30 | Adenocarcinoma |
| MCF7 tumor line | ATCC | HTB-22 | Adenocarcinoma |
| HCC1419 tumor line | ATCC | CRL-2326 | Primary ductal carcinoma |
| BT20 tumor line | ATCC | HTB-19 | Carcinoma |
References
- Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
- Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
- Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
- Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).
- Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).
- Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
- Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
- Gallimore, A. Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes. J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).
