Summary
Die Chromfreisetzungsassay eine gemeinsame Assay zum Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität, hat einige Einschränkungen. Mit Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen und menschlichen Mammakarzinom Tumorzelllinie, SKBR3, die in diesem Artikel wurde ein Impedanz-Ansatz für die Fähigkeit des Erfassens Zelltötung untersucht.
Abstract
Zytotoxische CD8 T-Zellen stellen eine Untergruppe von T-Zellen, die zur Induktion der Tod von infizierten oder malignen Wirtszellen 1 sind. Diese Zellen exprimieren einen speziellen Rezeptor, den sogenannten T-Zell-Rezeptor (TCR), der eine spezifische antigene Peptid gebunden an HLA-Klasse-I-Moleküle 2 erkennen kann. Der Eingriff der infizierten Zellen oder Tumorzellen durch ihre HLA Klasse I-Molekül resultiert in der Herstellung von lytischen Moleküle wie Granzymen und Perforin was Ziel Zelltod. Obwohl es nützlich ist, um Frequenzen von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen unter Verwendung von Assays, wie die ELIspot oder Durchflusszytometrie bestimmen, ist es auch nützlich, um die Stärke der CD8 T-Zell-Antworten mit Zytotoxizitätsassays 3 ermitteln. Die bekanntesten Assay zur Beurteilung zytotoxische Funktion ist die Chromfreisetzungsassay (CRA), die als ein Standard-Test 4 ist. Die CRA hat einige Einschränkungen, einschließlich Exposition von Zellen gegenüber Gammastrahlung, lack Reproduzierbarkeit und eine Anforderung für eine große Anzahl von Zellen. Im vergangenen Jahrzehnt hat es Interesse an der Einführung neuer Strategien, um diese Einschränkungen zu überwinden. Neuere Ansätze sind diejenigen, die Maßnahme Caspase Release 4, BLT Esteraseaktivität 5 und Oberflächenexpression von CD107 6. Die Impedanz-Assay, mit dem Roche XCELLIGENCE-System wurde in der vorliegenden Arbeit auf sein Potential als Alternative zu der CRA untersucht. Impedanz oder Widerstand gegen elektrischen Strom erfolgt, wenn adhärenten Tumorzellen Elektrodenplatten binden. Tumor-Zellen nach Tötung lösen und elektrische Impedanz verringert, was durch die XCELLIGENCE gemessen werden. Die Fähigkeit, die Impedanz-basierte Ansatz anzupassen Zell-vermittelte Tötung beurteilen beruht auf der Beobachtung, dass T-Zellen nicht fest haften auf den meisten Oberflächen und scheinen nicht zu viel Einfluss auf die Impedanz wodurch sich jede Sorge der direkten Beeinflussung der T-Zellen haben beidie Messung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Impedanz-basierten Assay kann Veränderungen der Konzentrationen von Antigen-spezifischen zytotoxischen CD8-T-Zellen mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber dem Standard CRA erkennen. Basierend auf diesen Ergebnissen kann Impedanz-basierte Ansätze gute Alternativen zu Ratingagenturen oder andere Ansätze, die zytotoxische CD8 T-Zell-Funktionalität messen Ziel sein.
Protocol
1. Generierung von kurzfristigen humanen Antigen-spezifischen CD8 T-Zell-Linien 7
- Separate peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus dem Blut von gesunden HLA-A2-positiven Spendern mit Ficoll-paque Plus.
- 2 ml / Vertiefung von PBMCs zu 6-Well-Platten bei 2 × 10 6 Zellen / ml.
- In HLA-A2-bindenden HER-2/neu p369-377-Peptid (Aminosäuresequenz KIFGSLAFL) oder HLA-A2-bindenden Influenza p58-66-Peptid (GILGFVFTL) direkt in die Vertiefungen in einer Endkonzentration von 10 ug / ml und Ort im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Um Ihnen zu helfen zu stimulieren und zu erweitern T-Zellen, zu ergänzen, alle 2 Tage, 250 ul / Vertiefung frisches Medium mit humanen rekombinanten IL-2 (Bestand: 50 Einheiten / ul) ergänzt werden, um eine Endkonzentration von 50 Einheiten / ml im Kulturmedium zu erreichen.
- Re-Stimulation der Zellkulturen mit 2 x 10 6 Zellen / ml autologen PBMCs für 2 Stunden mit 10 ug / ml der gleichen Peptiden gepulst verwendend in Schritt 1.3 und fügen diese Zellen zu Kulturen bei 1 ml / well einer Woche nach dem ersten Peptid Stimulation.
- In humanen rekombinanten IL-2 und frisches Medium, wie in Schritt 1.4 beschrieben, in die bestehenden Kulturen alle 2 Tage.
- Re-Stimulierung der Zellen mit Peptid und autologen PBMCs wie in Schritt 1.5 eine Woche nach der zweiten Peptid-Stimulation.
- Bereiten Sie sich darauf Zellen sechs Tage nach der letzten Restimulation frühestens verwenden.
2. Vorbereitung von Brustkrebszellen
- Legen Sie die XCELLIGENCE Impedanz Messstation (XCELLIGENCE station) in einem Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Ernte humane Tumorzellen (SKBR3, BT20, MCF7 oder HCC1419), die 75% Konfluenz unter Verwendung von 0,25% Trypsin und Zentrifugation (1000 rpm für 5 Minuten) sind.
- Zählen Tumorzellen mit einer Zählkammer und rekonstruieren sie in RPMI Tumor Medium (ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 500 Einheiten / mlIFN-gamma) in einer Konzentration von 7,5 x 10 3 Tumor Zellen/100 ul.
- Programmieren Sie die XCELLIGENCE Software durch die Einrichtung der Layout-Seite gut zu bestimmen Layout und durch die Einrichtung der Seite Zeitplan zu nehmen Impedanz Lesungen alle 5 Minuten für eine 40-Stunden-Zeitraum. Für die ersten 18 Stunden wird das System zu übernehmen XCELLIGENCE Impedanz Lesungen der Tumorzellen nur.
- In 100 ul RPMI Tumor Medien auf die XCELLIGENCE E-Platten, und führen Sie einen Hintergrund Lesen durch Messung der Impedanz in Abwesenheit von Zellen.
- In Tumorzellen zu den E-Platten mit 100 ul pro Well und in den XCELLIGENCE Station.
- Drücken Sie die Start-Taste auf der XCELLIGENCE Software beginnen, die Impedanz Lesungen der Tumorzellen, die sofort die Einhaltung der E-Platten.
3. Co-Kultur der Tumor mit CD8-T-Zellen
- Nachdem die Tumorzellen angebracht und verdoppelt bis 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung Tumor (ungefähremately 18 Stunden nach anfänglich vernickelt), Ernte-T-Zellen in Abschnitt 1 durch vorsichtiges Schaben und Agitation vorbereitet
- Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 Minuten und Zählung T-Zellen mit einer Zählkammer und rekonstruieren sie in RPMI-Medium mit 10% FBS in verschiedenen Verhältnissen, beginnend bei einem maximalen Verhältnis von 1 Tumorzelle zu 40 T-Zellen und 2-fach verdünnt, bis ein Verhältnis von 1 Tumorzelle bis 1,25 T-Zellen erreicht wird. Zum Beispiel gibt es 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung Tumor. Um eine 1.40-Verhältnis zu erreichen, fügen 6 x 10 5 T-Zellen pro well eingebracht und verdünnt den T-Zellen 2-fach, bis ein Verhältnis von 1,5 x 10 4 Tumorzellen 1,875 x 10 4 T-Zellen pro Well (1:1,25 Verhältnis) erreicht wird.
- Hält das XCELLIGENCE Station und entfernen Sie die E-Platte.
- Entfernen Sie die Medien in den Vertiefungen mit einer Pipette und 200 ul Medium allein oder das angemessene Verhältnis von T-Zellen in die Vertiefungen.
- Legen Sie die E-Platte wieder in den XCELLIGENCE Station und setzen Sie die Software pro XCELLIGENCEgram so Impedanzmessungen werden alle 5 Minuten für etwa 20 Stunden nach der T-Zell-Zusatz zu betrachten.
- Normalisieren der Ergebnisse am Ende des Tests.
4. Chromfreisetzungsassay (CRA) 7
- Folgen institutionellen Strahlung Sicherheitsvorkehrungen bei der Arbeit mit 51 Cr und 51 Cr-markierten Zielzellen. Verwenden Sie immer geeignete Abschirmung, die Strahlenbelastung zu reduzieren.
- Pulse Tumorzellen für 2 Stunden bei 1 x 10 6 Tumorzellen / ml mit 10 ul / ml frisches 51 Cr (0.005 Ci / ml).
- Waschen Tumorzellen in 10 ml RPMI-Medium mit 10% FBS und Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 Minuten. In Tumorzellen auf eine 96-well Rundboden-Platte bei 1 × 10 5 Tumorzellen in 100 ul / Vertiefung.
- In T-Zellen in verschiedenen Verhältnissen, beginnend mit 1 Tumorzelle zu 40 T-Zellen und 2-fach verdünnt, bis ein Verhältnis von 1 bis 1,25 Tumorzelle T-Zellen erreicht wird. Zum Beispiel gibt es 1 x 10 5 Tumorzellen pro Vertiefung. Um eine 1.40-Verhältnis zu erreichen, die Ziffer 4 x 10 6 T-Zellen pro well eingebracht und verdünnt den T-Zellen 2-fach, bis ein Verhältnis von 1 x 10 5 Tumorzellen auf 1,25 × 10 5 T-Zellen pro Well (1:1,25 Verhältnis) erreicht wird.
- In spontanen und maximalen Tumorzelle Kontrollen auf den Teller. Um die spontane Freisetzung von 51 Cr aus den Tumorzellen zu berechnen, fügen sechs Bohrungen mit jeweils 1 x 10 5 Tumorzellen in 100 ul und 100 ul RPMI-Medium mit 10% FBS. Um eine maximale Freisetzung von 51 Cr aus den Tumorzellen zu berechnen, fügen sechs Bohrungen mit jeweils 1 x 10 5 Tumorzellen in 100 ul und 100 ul 0,1% Triton X-100 in PBS, das alle Zellen lysiert.
- Die Inkubation für 5 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Nach der Inkubation entfernen 50 ul der Überstand aus jeder Vertiefung und fügen Sie es zu einem Luma Platte.
- Trocknen Sie die Platten über Nacht und messen CPM mit einem Gamma-Zähler.
- Impedanz-Test: Nehmen Sie die Impedanz Lesen, wie die Zelle Index (CI) berichtet, zu verschiedenen Zeitpunkten und verwenden Sie die folgende Formel, um die prozentuale Lyse zu bestimmen: (CI Tumor nur - (CI + Tumor T-Zellen)) / (CI Tumor nur) * 100.
- CRA: Verwenden Sie die folgende Formel, um die prozentuale Lyse zu bestimmen: (CPM experimentell - CPM spontan) / (CPM maximal - CPM spontane) * 100.
6. Repräsentative Ergebnisse
T-Zellen allein nicht erhöhen Impedanz
T-Zellen im allgemeinen nicht für die meisten festen Oberflächen anhaften und erfordern keine Haftung für die Aktivierung und Proliferation. Daher wurde angenommen, dass T-Zellen nicht zu tragen Impedanz auf der XCELLIGENCE E-Platten. Um dies zu testen, wurden die Vertiefungen mit entweder SKBR3 Brustkrebszellen oder frisch gereinigte menschliche CD8 T-Zellen geladen. Impedanz wurde im Laufe von 40 Stunden und ein repräsentatives Beispiel Demo-und gemessenBewertung im Wesentlichen geringe Wirkung von T-Zellen ist in 1A gezeigt. Im Gegensatz dazu könnte man argumentieren, dass T-Zellen können Hintergrund Impedanz zu verringern, wenn auch nur leicht werden. Trotzdem zeigte Co-Kultur, die das Verfahren zum Hinzufügen von T-Zellen bei 18 Stunden nach Beginn der Impedanzmessungen in einer Impedanz Unterbrechung (1B) geführt. Weitere Studien zeigten, dass Störungen zum Teil aufgrund der Handhabung, da die Verminderung Signal könnte, indem sichergestellt wird, dass die Temperatur des T-Zell-enthaltenden Lösung reduziert waren wurde das gleiche ist wie das Innere des Inkubators.
Reduktionen der Impedanz vermittelt durch T-Zellen sind dosisabhängig.
Die Nützlichkeit einer Impedanz-basierten Assays, um Proben für die zytotoxischen T-Zell-Aktivität zu vergleichen erfordert die Fähigkeit, zwischen verschiedenen Konzentrationen von Antigen-spezifischen T-Zellen zu unterscheiden. Um zu testen, ob dies möglich ist, waren SKBR3 Zellen co-kultiviert mit unterschiedlichen Konzentrationengen von T-Zellen aus einer HER-2/neu p369-spezifischen T-Zelllinie. Wie in 2A gezeigt ist, ergaben sich durch die Impedanz in Abhängigkeit von der Dosis von T-Zellen. 2B zeigt, dass die Zelle Indizes 10 Stunden einfaches Polynom zweiter Ordnung folgen über den Bereich von T-Zellen. So überwacht der XCELLIGENCE Station CD8 T-Zell-vermittelten Tod SKBR3 Tumoren in Echtzeit wie ein Tropfen in Zelle index.
Die Impedanz-Assay detektiert Antigen-spezifischen T-Zellen
Um festzustellen, ob Verringerung der Impedanz SKBR3, die eine HER-2/neu und HLA-A2-positiven Brustkrebs-Zelllinie ist, von HER-2/neu p369-spezifischen T-Zellen antigenspezifische, separate Vertiefungen mit SKBR3 wurden inkubiert mit T-Zellen aus einem Influenza (Grippe)-spezifischen T-Zelllinie. Die Grippe-spezifische T-Zellen diente als unspezifische Kontrolle, wobei HLA-A2-positiven, aber nicht mit einer Fähigkeit, HER-2/neu erkennen. Wie in Fi gezeigtAbbildung 3 gibt es einen signifikanten Unterschied zwischen der lytischen Aktivität von HER-2/neu p369-spezifischen T-Zellen zu FLU-spezifischen T-Zellen (p <0,0001) verglichen. In einigen Fällen, T-Zellen nicht spezifisch für Tumor (zB FLU-spezifischen oder anti-CD3/anti-CD28 stimuliert) zeigten eine geringe lytische Aktivität (3A-B). T-Zellen können in einem von zwei Wegen zu töten, entweder unspezifisch durch Fas: Fas-Ligand-Wechselwirkungen oder Antigen-spezifisch durch die Freisetzung von Granzymen und Perforine. Zur weiteren bestätigen die Annahme, dass HER-2/neu-spezifischen T-Zellen wurden in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu töten, wir eine blockierende Antikörper gegen den Fas-Liganden enthalten. Wie in 3B gezeigt ist, hat der Antikörper keine Verringerung der lytischen Aktivität des HER-2/neu p369-spezifischen T-Zellen. Der Antikörper hemmen könnten Wechselwirkungen zwischen Fas und Fas-Ligand, wie T-Zellen, die unspezifisch aktiviert mit anti-CD3/CD28 Kügelchen wurden demonstriert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass, wennTumor-spezifischen T-Zellen, die mit Nicht-Tumor-spezifischen T-Zellen getestet werden, können Fas-Ligand-Blockade erforderlich sind, um nicht-TCR-vermittelte Wechselwirkungen auf ein Minimum zu reduzieren. Alternativ kann, wenn die kurz-kultivierten T-Zelllinien, in denen nur ein Teil der T-Zellen, die spezifisch für das Antigen für die ex vivo-Erzeugung verwendet werden, könnte die Möglichkeit der MHC Mismatch-vermittelten T-Zell-Aktivierung auftreten, die zu nicht-spezifische Lyse. In diesem Fall kann die Zugabe von Antikörpern, die irrelevant HLAs blockieren gewährleistet sein. Um festzustellen, ob die p369-spezifischen T-Zellen wurden Abtöten von Tumorzellen in einem HLA-Klasse I-abhängige Weise, entweder anti-HLA-Klasse-I-Antikörper oder Isotypkontrollantikörper den Co-Kulturen zugesetzt wurden. Wie in 3C, Lyse durch p369-spezifischen T-Zellen gezeigt wurde durch Einschluss von Antikörper demonstriert HLA-Klasse-I-Restriktionsstelle unterdrückt. Schließlich, da die Entwicklung dieses Tests weitgehend getan wurde mit SKBR3, war es wichtig, festzustellen, ob andere Anhänger HLA-A2 und HER-2/neu exprimierenden Tumorzellen konnte durch p369-spezifischen T-Zellen getötet werden. Somit wurden T-Zellen hergestellt und in einem Verhältnis von 1:5 zu dem HLA-A2 und HER-2/neu-expressing Tumorzellen SKBR3, MCF-7 und HCC1419 Zellen. Die HLA-A2 negativen Zellinie wurde BT20 als negative Kontrolle verwendet. Wie in 3D, alle diese zusätzlichen Tumorzellen, außer BT20 gezeigt wurden getötet durch Impedanz beurteilt. Somit wird das Verfahren als nützlich für mehrere Ziel-adhärenten Tumorzellen.
Die Impedanz-Assay ist empfindlicher als die Standard-Chrom-Freisetzungs-Assays beim Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität
Die Chrom (Cr 51) Release-Assay (CRA), die zytolytische Aktivität misst seit langem der Goldstandard durch die CD8 T-Zell-Reaktionen zu überwachen. In diesem Test werden die Zielzellen (zB Tumorzellen) mit 51 Cr markiert. In den meisten Fällen können gesund Zielzellen behalten die Mehrheit derRadiomarkierung im Verlauf des Assays. CD8-T-Zellen zu den Zielzellen, in der Regel in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben, und das Töten der Zielzellen durch Freisetzung des 51 Cr in das Medium detektiert. Abgesehen von der Tatsache, dass sie gefährliche Strahlung verwendet, sind zwei große Probleme mit der CRA ein Mangel an Empfindlichkeit und dass der Assay erfordert in der Regel große Mengen von CD8-T-Zellen, was seine Nützlichkeit. Um festzustellen, ob die Impedanz-Assay empfindlicher war als die CRA, HER-2/neu p369-spezifischen T-Zellen in vitro und angewandte erzeugt, in variierenden Mengen enthalten, entweder E-Platten, die nicht markierten Tumorzellen oder Standard-Polypropylen-Platten, enthaltend 51 Cr-markierten Zielzellen. Messungen, entweder Impedanz oder kostenlos Chrom, wurden bei 5 Stunden nach der T-Zell-Zugabe gemessen. Abbildung 4 ist ein repräsentatives Beispiel zeigt die Impedanz-Test übertrifft die Chrom-Release.
Die Intra-Assay-Variationder Impedanz-Assay ist in der Regel unter 20%.
Intra-Assay-Varianz wurde untersucht, da breitere Anwendung dieses Assays wird weitgehend durch seine Variation reproduzierbar und (5) ermittelt werden. Zwei p369-spezifischen T-Zelllinien wurden unabhängig Abstand von 30 Tagen aufgenommen erzeugt und in dreifacher Ausführung in einem Bereich von Tumorzellen von T-Zellen-Verhältnissen. Die eingesetzte Grafik in Abbildung 5 zeigt, dass die Linien weitgehend gleichwertig in Bezug auf die Lyse SKBR3 Zellen waren. Die% Variationskoeffizient bei jeder Zelle Verhältnis berechnet und aufgetragen. Wie in Abbildung 5, 1.40 bis 01.05 Uhr die Verhältnisse dargestellt% Variationskoeffizienten (CV) waren unter 15%. Am 1:2,5 und 1:1,25, jedoch waren die Lebensläufe hoch oder unberechenbar. Aufgrund der umfangreichen biologischen Variation ist es nicht möglich, Inter-Assay-Variabilität mit primären T-Zell-Linien zu messen.
Abbildung 1. Impedanz benötigt, um nach der Zugabe der T-Zellen normalisiert. Panel A: zeigt, dass Tumorzellen (rote Linie) und nicht T-Zellen (blaue Linie), die für die Impedanz sind. Dargestellt sind die Impedanz-Kurs über 40 Stunden für entweder Tumor-oder T-Zellen allein. Ähnliche Ergebnisse wurden bei einem zweiten Versuch erhalten. Beachten Sie, dass das Signal Störung an ungefähr 20 Stunden der Zeitpunkt der Zugabe von T-Zellen in die Vertiefungen nicht die Tumorzellen für Feld B:. Zeigt, dass Impedanzmessungen transient mit der Zugabe von T-Zellen an Tumorzellen zerstört. Dies erfordert eine Normalisierung zu irgendeinem Zeitpunkt nach der Zugabe von T-Zellen (siehe Punkt der Normalisierung in Diagramm gekennzeichnet). Spuren von doppelten Daten Punkten zusammen. Die Spur für Tumorzellen allein ist in rot dargestellt. Die anderen Spuren repräsentieren Tumorzellen mit HER-2/neu p369-spezifischen T-Zellen (blau co-kultiviert: von 1,25 T Zellen / Tumorzelle, Grün:T-Verhältnis von 40 Zellen / Tumorzelle). Jede Spur wird von doppelten Datenpunkte gesammelt alle 5 Minuten über die Dauer der Kultur berechnet. Die Ergebnisse sind repräsentativ aus 3 separaten Experimenten. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Reduzierung der Impedanz vermittelt durch T-Zellen ist dosisabhängig. Panel A: Dargestellt sind die Impedanz Spuren SKBR3 Tumorzellen inkubiert allein oder zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von Tumor-spezifischen T-Zellen. Jede Spur ist aus dreifach erfassten Datenpunkte alle 5 Minuten über die Dauer der Kultur berechnet. Ergebnisse sind repräsentativ für 3 separate Experimente Feld B:. Dargestellt sind die Zellindizes bei 10 Stunden in ganz alle T-Zell / Tumorzelle Konzentrationen. Die gestrichelte Linie stellt die Zelle Index für Tumorzellen aleins. Jedes Symbol ist der Mittelwert (± SEM) der dreifachen Bestimmungen. Die Ergebnisse sind repräsentativ aus 3 separaten Experimenten. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Die Impedanz Assay detektiert Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Zell-Reaktionen. Tafel A zeigt die Höhe der Lyse der Zellen durch SKBR3 HER-2/neu p369-spezifischen T-Zellen (rot) oder Grippe-spezifischen T-Zellen (blau) bei 5, 10 und 15 Stunden nach der Co-Kultur. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert (± SEM) von drei Messungen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 3 getrennten Experimenten. Tafel B zeigt die Lyse von SKBR3 von p369-spezifischen T-Zellen oder nicht-spezifisch aktivierte T-Zellen, was zeigt, dass Antigen-spezifische Lyse ist nicht auf Fas-Fas-Ligand-Wechselwirkungen. Schwarze Balken repräsentieren Co-Kulturen, dassenthielt eine Fas-Ligand-Antikörper. Jeder Balken ist der Mittelwert (± SEM) Lyse in dreifacher Ausfertigung nach 5 Stunden nach der Zugabe von T-Zellen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 3 getrennten Experimenten. Tafel C zeigt Lyse 10 Stunden nach Zugabe von T-Zell-SKBR3 von p369-spezifischen T-Zellen HLA-Klasse I-abhängige. Entweder HLA-Klasse-I-Blockierung oder Isotyp-Kontrolle wurde bei einer Co-Kultur zugegeben. Jeder Balken ist der Mittelwert (± SEM) Lyse in dreifacher Ausfertigung. Dieses Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Tafel D zeigt% Lyse von 10 Stunden nach Zugabe von T-Zellen mehrere HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing Tumorzelllinien p369-spezifischen T-Zellen. BT20 wurde ein HLA-A2-negative Brustkrebs-Zelllinie als negative Kontrolle verwendet. Jeder Punkt steht für ein einzigartiges Experiment aus dreifachen Bestimmungen berechnet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. Die Impedanz Assay empfindlicher ist als der Chrom-Freisetzungs-Assay für den Nachweis von Tumor-Antigen-spezifischen T-Zellen. Zeigen% Lyse von SKBR3 in Reaktion auf verschiedene Konzentrationen von p369-spezifischen T-Zellen nach 5 Stunden nach Tumor-und T-Zellen gemessen Mischen sowohl mit der Impedanz-basierte Assays und die Chromfreisetzungsassay. Jedes Symbol ist der Mittelwert (± SEM) von drei Wiederholungen. Die Ergebnisse sind repräsentativ aus 3 separaten Experimenten.
Abbildung 5. % Intra-assay Variationskoeffizienten der Impedanz-Basis-T-Zell Zytotoxizitätsassay. Sind Mittelwerte (± SD)% intra-assay Variationskoeffizienten in Lyse SKBR3 über einen Bereich von Konzentrationen von Antigen-spezifischen T-Zellen. Jedes Symbol ist der Mittelwert von drei Wiederholungen. Die Zahlen in der Grafik dargestellt sind ter bedeuten% Lebensläufe. Inset Panel zeigt den Mittelwert (± SEM, n = 3)% Lyse SKBR3, bei verschiedenen Konzentrationen von p369-377-spezifischen T-Zellen. Zwei unabhängig erzeugten p369-spezifischen T-Zelllinien unter Verwendung von T-Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt.
Discussion
CD8-T-Zellen sind wichtig für die adaptive Immunantwort, die Möglichkeit, direkt zu töten infizierte oder maligne Zellen 4. Zwar gibt es mehrere Möglichkeiten, um die Zahl von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen (zB ELIspot, Tetramer, Durchflusszytometrie) messen sind, ist es oft hilfreich zu wissen, ob diese Zellen funktionell zytotoxischen 3 sind. Die bekanntesten Assay zur Beurteilung zytotoxische Funktion ist die CRA, die als Goldstandard Assay 4. Wesentliche Einschränkungen der CRA sind (1) das Erfordernis der Radioaktivität, (2) mangelnde Sensibilität, (3) Mangel an mechanistische Informationen, (4) Voraussetzung für große Mengen von Zellen, und (5) aufwändige Einrichtung. So im letzten Jahrzehnt hat es Interesse an der Einführung neuer Strategien, um diese Einschränkungen zu minimieren. Neuere Ansätze sind diejenigen, die Maßnahme Caspase Release 4, BLT Esterase activity5 und Oberflächenexpression von CD107 6. Die vorliegende Manuskript darauf hin, dassdie Impedanz-basierten Assays, auf der Roche XCELLIGENCE System durchgeführt wird, kann auch nützlich sein, als Alternative zu der CRA. Die Fähigkeit, die Impedanz-basierte Ansatz anzupassen beruht auf der Beobachtung, dass T-Zellen, die nicht beachtet dicht an Oberflächen, scheinen nicht viel Einfluss auf die Impedanz wodurch sich jede Sorge der direkten Beeinflussung der T-Zellen bei der Messung haben. Die Arbeit für die Verwendung der Impedanz-Assay-System benötigt wird erwartet, dass deutlich weniger erster Linie auf den Wegfall der regulatorischen betrifft die Verwendung von Radioaktivität. Die einzige nennenswerte Nachteil der Impedanz-basiertes System ist, dass ein Aufwand von $ 50.000 bis $ 60.000 für den Kauf des XCELLIGENCE Einheit erforderlich ist. Jedoch eliminiert die XCELLIGENCE Einheit die Notwendigkeit einer Strahlung Zähler und ist vielseitiger, nützlich ist für die Beurteilung der zellulären Antwort auf Drogen und Migration zusätzlich zu T-Zell-Zytotoxizität 8.
Die Beobachtungen, dassdie Verminderung in Tumorzellen Impedanz ist dosisabhängig schlägt, wie in 2 dargestellt ist, mit einer relativ steilen Steigung nach einem einfachen sekundären quadratischen Funktion, dass der Test in limitierender Verdünnung Assays (LDA), um die Frequenz von zytotoxischen Zellen 9 Abschätzen verwendet werden . Ein Vorteil, der mit der Impedanz-Ansatz ist, dass die Zahl der T-Zellen und Tumorzellen erforderlich kleiner als der CRA ist, so dass LDA potentiell durchführbar. Zum Beispiel in der CRA bei einer 1.40 Verhältnis, 1 x 10 5 Tumorzellen pro Vertiefung ausplattiert, welche benötigt 4 x 10 6 insgesamt T-Zellen pro Vertiefung. In der Impedanz-basierten Test werden nur 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung Tumor benötigt, die verbraucht nur 6 x 10 5 Gesamt-T-Zellen pro well. Somit verwendet die Impedanz-Assay 85% weniger T-Zellen und Tumorzellen. Diese Reduktion legt nahe, dass die Impedanz-basiertes System zur immunologischen Überwachung könnte in klinischen Studien am Menschen angepasst werden, wobei ter Mengen von Blutabnahmen kann begrenzt werden. Auch wenn das CRA zu einem einzigen Zeitpunkt begrenzt wird, sammelt sich die Impedanz-Assay kontinuierliche Echtzeit-Daten, so dass der Benutzer mehrere Lyse Zeitpunkten auf demselben Experiment mit minimaler zusätzlicher Arbeits-und Zellen zu vergleichen. Frequenzberechnungen möglicherweise mit anderen Strategien, die nicht messen Funktion wie Tetramer-Analysen, um das Verhältnis von funktionellen zytotoxische T-Zellen zur gesamten Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen 10 herzustellen kombiniert werden. Eines der attraktiven Merkmale des Impedanz-Ansatzes besteht darin, dass, im Gegensatz zu den meisten anderen Assays Zytotoxizität in Echtzeit überwacht werden, möglicherweise macht es einfacher, zelluläre Interaktionen mit der Verwendung von Inhibitoren oder Antikörpern zu studieren. Ein weiterer Grund ist, dass das Verfahren geeignet sein können Tumorzellen, die Kennzeichnung zu widerstehen. Schließlich, da die nicht abgetöteten Tumorzellen nicht beschriftet und steril bleiben weiter Ernte und Untersuchung der T-Zell-resistente Zellen possible.
Zusammenfassend, wenn beide Systeme Tumorabtötung Daten in Reaktion auf spezifische T-Zellen zu schaffen, ist die Impedanz-Assay empfindlicher als der CRA und bietet eine flexible Plattform.
Disclosures
Produktion und freien Zugang von diesem Video-Artikel wird von Roche Diagnostics gesponsert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu Keith L. Knutson von der Susan G. Komen for the Cure Foundation und NIH / NCI 9R01 CA152045 und P50-CA116201 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Used to isolate PBMCs from blood |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | Cell culture media |
| FBS | Denville Scientific | FB5001-H | Cell culture media |
| Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-81 | For stimulating growth of T cells |
| Human Interferon gamma | Cell Sciences | CR2026 | For stimulating MHC expression in tumor cells |
| HER-2/neu p369-377 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence KIFGSLAFL | Binds to HLA-A2 |
| Influenza p58-66 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence GILGFVFTL | Binds to HLA-A2 |
| Human CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | 111-61D | For non-specific T cell activation and expansion |
| Chromium-51 | MP Biomedicals | 62015 | CRA labeling reagent |
| E-plate |  Roche Group |
05469830001 | For xCelligence impedance unit |
| Luma plate 96 | PerkinElmer, Inc. | 6005630 | For measuring radioactivity in the Top Count NXT. |
| xCelligence RTCA DP Station | Roche Applied Science |
RTCA DP | Impedance unit |
| Top Count NXT | PerkinElmer, Inc. | C990601 | Scintillation & Luminescence Counter |
| Fas Ligand antibody | BD Biosciences | 556372 | For blocking Fas-Fas ligand interactions |
| HLA-A2 BB7.2 antibody | BD Biosciences | 551230 | For blocking HLA class I |
| Mouse IgG2b, κ | BD Biosciences | 555740 | Isotype control for HLA class I |
| SKBR3 tumor line | ATCC | HTB-30 | Adenocarcinoma |
| MCF7 tumor line | ATCC | HTB-22 | Adenocarcinoma |
| HCC1419 tumor line | ATCC | CRL-2326 | Primary ductal carcinoma |
| BT20 tumor line | ATCC | HTB-19 | Carcinoma |
References
- Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
- Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
- Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
- Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).
- Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).
- Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
- Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
- Gallimore, A. Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes. J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).
