En helt automatiserad och Mycket mångsidig system för att testa flera kognitiva funktioner och spela in neurala Aktiviteter i Gnagare

Summary

I denna rapport presenterar vi en helt automatiserad och mycket mångsidigt system som samtidigt kan testa flera kognitiva beteenden och inspelning neuronala aktiviteter för gnagare.

Abstract

Vi har utvecklat ett helt automatiserat system för operant beteende testning och neuronal aktivitet inspelning genom vilken flera kognitiva hjärnfunktioner kan undersökas i ett enda uppgift sekvens. Det unika med detta system är en skräddarsydd, akustiskt transparent kammare som eliminerar många av de frågor som är förknippade med hörsel cue kontroll i de flesta kommersiellt tillgängliga kammare. Den lätthet med vilken operanta enheter kan läggas till eller bytas ut gör systemet mycket flexibla, vilket möjliggör genomförandet av en rad olika hörsel-, syn och luktsinne beteendemässiga uppgifter. Automatisering av systemet tillåter fina temporal (10 ms) och exakt tid stämpling för varje händelse i en fördefinierad beteende sekvens. I kombination med ett flerkanaligt elektrofysiologi registreringssystem, flera kognitiva funktioner i hjärnan, såsom motivation, uppmärksamhet, beslutsfattande, tålamod och belöningar, kan undersökas sekventiellt eller oberoende.

Protocol

Systemöversikt

Systemet består av tre huvudkomponenter: (1) en dubbelväggig ljudisolerade rum (Industrial Akustisk Company, Bronx, New York), (2) en multipel kanaler elektrofysiologiska registreringssystem (Neuralynx, Bozeman, MT), och (3) en helautomatiska, anpassade beteende testsystem från Med Associates Inc. (St Albans, VT).

Såsom visas i figur 1A är den operanta kammaren belägen inuti den ljudisolerande rum. En kommutator (modell SL-36, trollslända forskning och utveckling, Inc., Ridgeley, West Virginia) för att koppla kablar från huvudsteg till elektrofysiologiska registreringssystem (Figure1A-a), och en videokamera för övervakning och registrering djur beteenden är monterade ovanför den operanta kammaren (Figure1A-b).

Skräddarsydda Operant avdelningen

Den skräddarsydda, akustiskt transparent Operant kammare (Figure1A-d) består av tre akustiskt transparenta väggar och en modulär-operation (Figur 1B). Tre högtalare (Bur Tweeter, ENV_224BM, Med Associates) monterad på toppen av den mellersta och två sidopaneler används för emitterande auditiva signaler. Auditiva ledtrådar genereras av en kalibrerad, programmerbar audio generator (ANL-926). En stimulusgenerator ljus (ENV_221M) och två trippel-stimulus lysdioder (ENV_222M) är belägna på mitten och sidopaneler, respektive. Dessa stimulansåtgärder lampor kan användas för hörsel-visuella flera sensoriska beteende tester. En näsa säcken anordning med tre LED färgbelysning (ENV_114M) är monterad vid botten av den mellersta panelen. En infraröd detektor installeras i näsan poke enheten används för att signalera näsan peta och hålla period. De LED-lampor i näsan poke enheten kan användas för utbildning näsan-hold inne i hålet. En rörlig som svar hävarm (ENV_112CM) är monterad på varje sida av den operanta panelen. Den mobility på dessa spakar möjliggör flexibel kontroll av förekomst av spakarna, som effektivt kan användas för både grundläggande utbildning för särskilda uppgifter och studier av flera viktiga kognitiva funktioner i hjärnan (se nedan). Fyra par av infraröda strålar källor och detektorer (EVN_253SD) styrs av en fyra kanals IR-controller (ENV_253) placeras i botten av kammaren att både ange positionerna för djuret och styra andra enheter baserat på ett djur position (Figur 1A- e). Två pellets dispensrar vardera med en inbyggd infraröd vaktpost (ENV_203M-45IR) används för dispensering belöningar i pelleten behållarna (Figur 1A-C). Den infraröda Sentry är används för att övervaka fel pellets dispenser och ge varningssignaler.

Systemkonfiguration

Översikten av systemet anslutningar och hårdvarukomponenter illustreras i figur 2. Funktionellt finns två parallella, interaktivadelsystem: en för beteende utbildning och den andra för elektrofysiologiska inspelning. De två delsystem är synkroniserade via MED-PC IV Programvaruplattform (SOF-735). Datorn skickar kommandon till beteendemässiga anordningar och TTL pulser till neurala registrerande systemet (signalflöden som anges av de röda pilarna i figur 2), och mottar signaler som alstras av djurets svar och neurala aktiviteter (signalflöden som anges av de gröna och blå pilar, respektive, i figur 2). Dessa parallella, interaktiva system att inspelningar av synkroniserade beteenden / neuronal data och tillåter manipulering av djurets beteende bygger på neural aktivitet, eller vice versa.

Beteende utbildning sub-system A SmartCtrl anslutningspanel (SG-716b) fungerar som en två-vägs kommunikation panel, dvs sänder styrsignaler (röd pil i figur 2) från datorn till beteendemässiga enheter (som anges i röda rutan) och transmit djurets svarssignaler (grön pil i figur 2) tillbaka till datorn. Utgångarna på fyra kanals IR-controller (ENV_253) är också dirigeras till anslutningspanelen. Ett gränssnitt kort (SmartCtrl gränssnittskort, DIG-716b) och ett avkodning kort (DIG-700F) meddela signalerna från anslutningen panelen till ett PCI-kort (DIG-704PCI) installerad i datorn. De auditiva signaler genereras av stimulusgeneratorn (ANL-926), som också styrs av MED-PC IV programvara genom avkodning kortet (DIG-700F). Såsom illustreras i figur 2, är alla gränssnittskort värd i en bordsskiva gränssnitt skåp (SG-6080D). Skåpet levererar också befogenheter för alla beteenden enheter.

Elektrofysiologisk registrering delsystem djurets svar mottas av datorn skall momentant sänds till den neurala registrerande systemet via SuperPort TTL-kortet (DIG-726) och Cheetah Digital Interface Box (Neuralynx, Bozeman, MT) (Figur 2). Dessa beteenden händelser tid stämplas och registreras samtidigt med neurala aktiviteter. Neurala spikar upptäcks online från Neuralynx inspelningen systemet kan användas som insignaler till beteendekontroll sub-system för att manipulera eller störa djurs beteende. Omvänt kan djurets svarssignaler användas som utlösare för att manipulera eller interfererande neuronala aktiviteter när de kombineras med elektriska eller optogenetic stimulering tekniker. Dessa synsätt kommer att vara värdefull för att belysa orsakssammanhang mellan neuronala aktiviteter och beteenden.

Programmering och databehandling Beteendeindikatorer kontrollprogram är skrivna med Trans IV programmet (Thomas A. Tatham och MED Associates) och kompilerat med Pascal kompilator. Automatisering av varje träning steg realiseras genom att ladda Trans IV-programmet i MED-PC IV Software. Utbildning parametrar kan också justeras på nätet genom att lärare Wedan MED-PC IV program körs. De Trans IV koderna måste vara specifik för både systeminställningarna och beteendemässiga uppgift. Standard utbildningsprogram är dock fritt tillgänglig från MED Associates och ändras för att möta enskilda laboratoriets specifika behov. Utbildningsprogram som används i våra installationer är också fritt tillgängliga på begäran.

Beteendemässiga data sparas automatiskt av MED-PC IV Software. De sparade data kan översättas till Microsoft Excel-filer genom att använda MED-PC till Excel-programmet (MPC2XL, Thomas A. Tatham och MED Associates). De översatta Excel-filer kan sedan importeras och analyseras i en MATLAB miljö (MathWorks, Natick, MA). De neurala data tillsammans med beteendemässiga evenemanget tidsstämplar som spelats in med Cheetah programvara (Cheetah 5, Neuralynx, Bozeman, MT) kan också importeras till MATLAB för analys.

Utbildning

För att illustrera funktionen av detta system, beskriver vi här enTvå alternativa val Pitch Diskriminering uppgift, för att undersöka tröskeln frekvensen diskriminering av en råtta. En schematisk illustration av den uppgift visas i figur 3.

1. Pre-utbildning

1. Börja med naiva vuxen man, Sprague-Dawley, råttor, ålder ~ 60 dagar.
2. Före träning, begränsa födointag tills djurets vikt är ~ 90% av baslinjen ad libidum vikt.

2. Buren Acklimatisering

1. För att framställa den kammare för acklimatisering, dras armarna och blockera hålet näsan säcken med en gummipropp (tillverkad av kolven i en 60 cc spruta) för att förhindra djuret från att aktivera den näsa-säcken anordning.
2. Placera ~ 20 fullt näringsbehov pellets (45 mg, Produkt # F0021, BioServ, Frenchtown, NJ) i varje pellet kärl (mat kopp).
3. Placera en naiva djur i kammaren för acklimatisering. Råttan kommer snart att börja utforska mat kopparna och äta pellets.
4. Tvinga råttan att flytta till båda sidor av kammaren genom dispensering pellets slumpmässigt i varje mat kopp. En 30 minuters session brukar räcka för att fastställa den mat-cup förening. I en 30 minuters session, erhåller råtta vanligen 200 - 300 pellets som är tillräckligt för att bibehålla kroppsvikten vid en konstant nivå av ~ 90% av baslinjen.

3. Lever-push utbildning

1. I en ny session, sträcker sig båda spakarna in i kammaren och lämna maten koppen tom.
2. Därefter placerar en acklimatiserade råtta in i kammaren. När djuret kommer in i närheten av en spak, dosera en pellet manuellt via Med-PC IV program. Också belöningar när råttan visar intresse i spaken, såsom sniffning, beröring eller klättring. En oavsiktlig spaken tryck bör också utlösa en belöning autommatiskt i programmet.
3. För att uppmuntra spaken trycka och för att tvinga utforskning av båda spakarna, låt djuret för att trycka varje spak i följd ett begränsat antal gånger. När denna gräns nås, dra spaken. När båda spakarna har indragen, utvidga dem till att upprepa proceduren.
4. Gradvis minska begränsningen tills spaken dras varje gång den trycks in. En till två 30 minuters sessioner är oftast tillräckligt för att fastställa spaken push - mat belöning förening.

4. Näsa-poke utbildning

1. I en ny session, dra spakarna och ta bort gummiproppen från näsan säcken. Placera flera pellets inne i näsan säcken för att uppmuntra råttans intresse för att utforska näsan-säcken enhet.
2. Återinföra djuret in i kammaren. Sträcker ena av de två hävarmarna slumpmässigt när råttan nosar näsan-säcken hål för livsmedel pelletar.
3. Se förlängd spak kommer råttan närma sig och spaken för att få ett livsmedel peluthyrda. Efter att spaken trycks in och belöningen fördelas, dra tillbaka spaken för att uppmuntra råttan att utforska enheten näsan säcken. Det brukar ta ungefär 20 till 30 minuter att lära sig uppgiften sekvensen: Nose-säcken → Lever förlängning → ​​Spak tryckknappar → Rewards.

5. Cue Utbildning

1. I en ny session, spela auditiva ledtrådar efter en nos-säcken event med en kort fördröjning (100 till 250 ms). Utöka både vänster och höger spakarna inom kort (100 ms) efter varje hörsel kö presentation.
2. Belöna råtta endast när den skjuter armen som indikeras av den auditiva kö. Djuret kommer successivt lära sig att associera en viss auditiv Cue med en spak. Djuret är då fri att börja ett nytt försök med sekvensen: Nose-säcken → Cue → Spak tryck → Belöning / Nej belöning (Figur 3). På grund av hög falska takt under de inledande lärande sessioner, kompletterande foOD bör ges för att upprätthålla kroppsvikten efter varje träningspass.
3. I de närmaste 30 minuters sessioner, låt råttan praktiken nyligen lärt sig uppgiften tills en enhetlig prestandanivå har uppnåtts (se figur 3A för en typisk inlärningskurva). När uppgiften behärskas, kan en råtta erhållande av ca 200 - 300 pellets i varje 30 minuters session, som är tillräckligt för att bibehålla sin kroppsvikt.

6. Representativa resultat

Efter ovanstående protokoll, att vi tränade råttor igen två olika mönster av ren ton pulståg som består av sex ton punkter med antingen samma frekvens (F, F, F, F, F, F) eller olika frekvenser (F, F-Af , F, F-AF, F, F-AF) ^1-5. Varje ton pip är 200 ms i längd och tonen pip intervallet är 400 ms. I den föreliggande studien F inställd till att vara 10 kHz och AF sträckte sig från 1 till 50% av F (figur 3, överst). Typiskt har AF somvid relativt stort värde under träning: 5 kHz, 4 kHz, 3 kHz, 2 kHz och 1 kHz, för att underlätta utbildningen. Varje ren ton pulståg med olika AF värdet presenterades slumpmässigt i en given session.

Two-alternativt val Pitch Diskriminering uppgift illustreras i figur 3. Råttor tränas att peta näsan i näsan hålet (Figur 1B och figur 3, nederst) att starta en rättegång. Näsan säcken utlöser sändningen av auditiva signaler. Vid erkännande av de signaler, råttorna måste springa till rätt sida av kammaren, närmar sig spaken vänta på spaken för att sträcka sig in i kammaren, och tryck sedan spaken inom en viss tid fönster (spaken aktiv tid, från 1 till 2 sekunder) så att en belöning (figur 3). Träffen beräknades för varje AF värde som antalet drabbade försök dividerat med det totala antalet försök för varje enskild AF värde. Ett kriterium på 75%träffsäkerhet användes för att indikera att råttan hade lärt sig uppgiften. En typisk inlärningskurva av en råtta visas i figur 4A. Varje färgad linje visar inlärningsframsteg för varje pulståg med olika Af (ΔF0 representerar konstanten pulståget). I genomsnitt tog det ungefär sju sessioner av träning (från det första mötet i hörsel kö presentation, steg 5 Cue Training) för att nå 75%-kriteriet träffsäkerhet.

Detta system gör det också möjligt kvantitativ bedömning av djurets beteende i att utföra den uppgift designad av praktiker. Tre mätningar som ofta används i djurförsök beteendestudier visas i Figur 4 B - D Reaktionstiden, främst till följd av ett djurs uppmärksamhet för uppgiften, mättes som förflyter tiden mellan debut av hörsel kö och hävstång push.. Inter-rättegången intervall, vilket återspeglar hur engagerad ett djur var för uppgiften där djuret initieras varje försökoch inte straffas med time-out i falsk rättegång, avsattes i figur 4C. Den tidsmässiga variationen av prestanda inom en session, som representerar de dynamiska mönster av ett djurs totala prestanda och reflektera förbättring / anpassning som kan inträffa inom en enda session, avsattes i figur 4D. Varje session var indelad i början, mitten och sent (10 minuter per steg). Ackumulerade antal belöningar i varje steg användes i denna mätning.

Den neurala grunden för flera kognitiva beteenden (figur 5A och se diskussion) kan också behandlas med detta system genom att spela in de neurala aktiviteter djur som utför en uppgift. Exempel på neural aktivitet registreras samtidigt i nucleus basalis (NB) och ventrala tegmentala området (VTA) av en råtthjärna visas i figur 5B och C. De avfyrningar av neuroner är tidmärkta att relatera till varje händelse av försöket (exempel som näsa-poke,spaken push, hörsel cue presentation och erkännande och faktiska mottagande av belöning) och analyseras i förhållande till dessa beteenden uppgift händelser. Resultaten av kombinerad beteendemässiga och neurala aktiviteten inspelning med detta system kommer att vara givande att belysa den neurala grunden för en mängd kognitiva beteenden.

Figur 1. De viktigaste komponenterna i systemet (A) och en schematisk ritning av skräddarsydd hörsel operant kammare (B). A. operant Kammaren ligger i en dubbelväggig ljudisolerade rum. Ekofria skum kilar är monterade hela väggarna i rummet för att eliminera ljud spridning och avböjning en. Kommutator för att dirigera kablar till nervaktivitet registreringssystemet b: Video-kamera för övervakning och registrering djurens beteende, c: Pellet automater, d: Operant kammaren . E:Infraröd mottagare. B. operant Kammaren består av tre akustiskt transparenta väggar och en modulär-kontrollpanelen. Se text för detaljerade beskrivningar.

Figur 2. Schematisk översikt av systemet. Systemet består av två delsystem: beteende utbildning och neural aktivitet registreringssystem. De två delsystem kommunicera interaktivt med varandra via TTL pulser (se Systemkonfiguration för detaljer). De röda pilarna representerar kommandon och / eller beteendemässiga händelser som skickas ut från datorn, de gröna pilarna betecknar signaler djur svar matar tillbaka till datorn, och den blå pilen representerar signalingångar av neurala spika händelser som upptäcks online med Neuralynx registreringssystem.

Figur 3. Två Alternativ ChOICE Frekvens Diskriminering aktivitet. Top, blockdiagram, som visar den grundläggande uppgiften sekvensen. Bottom, Schematisk bild av största beteendemässiga åtgärder. Gröna pilarna indikerar den sekventiella flödet av uppgiften.

Figur 4 Representativa resultat från två alternativa val Frekvens Diskriminering Task A. Learning kurvorna. Varje färgad linje representerar den lärande utvecklingen av en råtta på diskriminering varje frekvens variation (ΔFs). Den mörka linjen representerar den genomsnittliga inlärningskurva för frekvensvariationer. B. Fördelning av reaktionstid mätt som tid varv från början av kön för att spaken push. C. Fördelning av inter-rättegången intervall. D. Temporala dynamik av prestanda inom en uppmätt session med ackumulerade belöningar som erhållits i början, mitten och senare skede av ett session. Enll data i B - D var erhölls i det sista steget när råttan prestanda var över 75% träffrekvens.

Figur 5. Exempel på kognitiva beteenden och hjärnfunktioner som kan undersökas med hjälp av systemet. A. Kognitiva beteenden. De bästa bildtexter beskriver varje åtgärd i en sekvens av en rättegång. De nedre bildtexter indikerar kognitiva beteenden som kan studeras. Observera att båda spakarna extraherades i alla bilderna, förutom i d där hävarmen är i behandlingen av sträcker sig in i kammaren. B. Firing mönster av ett neuron registreras i Anm av en råtta som utför två val auditiva uppgift. Början, rasterbild tomt på avfyra över varje försök. Varje färgad rektangel representerar avfyrning av cellen och eldhastigheten kodas av färgen. Bottom, Peri, ävent histogram över eldhastighet. Notera att bygga upp den bränningen innan talan (trycka spaken vid tiden noll mikrosekunder, markerade med röda streckade vertikala linjen) och gradvis spridning av bränningen efter det att talan. C. Firing mönster av en neuron registreras i VTA för en råtta som utför två-val hörsel uppgift. Top, Raster bild plot av bränning av en enda VTA neuron över varje försök. Varje färgad rektangel representerar bränning av VTA neuron och dess eldhastighet kodas av färg. Bottom, Peri-event histogram över eldhastighet som visas i raster bilden. Notera den glesa bränningen omedelbart före verkan av att trycka spaken (vid tiden noll mikrosekunder, markerade med den vertikala röda streckade linjen) och stark bränning under den tidsperiod när råttan är få belöningen. Aktiviteten i detta neuron är praktiskt taget ljudlös mellan dessa två åtgärder. Volfram stereotrodes implanterade i hjärnan användes för att record neurala aktiviteter samtidigt från NB och VTA medan råttan utför uppgiften. Spike-sortering utfördes off-line med SpikeSort 3D Software (Neuralynx, Bozeman, MT).

Discussion

En kritisk aspekt i utformningen av alla hörsel beteende uppgift är eliminering av oönskade ljud som härrör från spridning och avböjning i testmiljön. Dåligt ljud kontroll kan ha en betydande effekt på beteendet som testas och kommer att producera vilseledande eller ens tolkningsbart resultat. Den beteendemässiga Kammaren används i systemet som beskrivs här är speciellt utformad för att bli akustiskt transparent för att undvika ljud avböjning från kammarens väggar. I själva verket, mätt från mitten av kammaren, var god nedböjning på ett effektivt sätt odetekterbar (data visas ej).

Även om vi utvecklat detta system främst för att studera hörselsystemet kan den lätt anpassas av andra forskare för att studera andra sensoriska system. Ändringar kan göras enkelt på både mjukvara och hårdvara för olika uppgifter utan att ändra den övergripande utformningen av systemet. Den modulära manöverpanel gör systemet speciellt versatile genom att för addition och / eller utbyte av olika enheter för nya beteenden uppgifter. Till exempel kan olfaktoriska beteendemässiga uppgifter skall implanteras genom att leverera olfaktoriska stimulus i näsan säcken anordningen. De fem Valet upplysta näsan poke väggen med lukt stimulans från MED Associates (ENV-115A-OF) kan lätt installeras på manöverpanelen för komplexa olfactory uppgifter. Dessutom kan alla de verksamma anordningar lätt kan ersättas med de som är konstruerade för möss utan att ändra konfigurationen av systemet.

Exakt temporal kontroll av varje operant enhet, samt med hög upplösning inspelning av enstaka händelser i ett visst försök, möjliggöra noggrann manipulation av de anordningar för att anpassa utformningen av beteendemässiga arbetsuppgifter att ta itu med olika kognitiva hjärnfunktioner (se nedan). I kombination med nervaktivitet inspelning kan ett rikt utbud av frågor inom området neurovetenskap studeras med detta system. Till exempel i den enuditory uppgift som beskrivs ovan kan följande frågor med anknytning till hjärnans kognitiva funktioner undersökas i en enda rättegång:

(1). Motivation: Eftersom varje försök initieras av djurets "driven" nos-poke åtgärder (figur 5A-a och figur 3) kan motivation således bedömas kvantitativt genom att mäta det totala antalet försök som utförs av ett djur i en viss session, eller antalet på varandra följande försök utförts ^6,7.

(2). Observera: Nyckeln för att få en belöning i en rättegång är att korrekt känna igen de auditiva signaler. I omkring 25% av råttor som inte kunde tränas att utföra uppgiften, brist på sköter de auditiva ledtrådar var den viktigaste faktorn. Däremot i råttorna som lärt uppgiften, var en tillfällig paus på beteenden synliga under auditiv kö presentationen (se figur 5A-B och figur 3). Genom att använda detta system är det sålunda möjligt att i) skärm råttor av "uppmärksamhet defipenningtransportföretag "och (ii) studera neurala mekanismer för uppmärksamhet i kombination med neuronala inspelningar medan djuret som sköter auditiva ledtrådar ^8-10.

(3). Beslut: Vid erkännande av auditiva ledtrådar måste djuret att bestämma vilken riktning att vända sig till närma rätt spaken inom en begränsad tid fönstret (Figur 5A-C). Det är således också en effektiv paradigm för undersökning beslutsfattande ^11,12.

(4). Tålamod: Tidpunkten för spaken förlängningen kan styras så att djuret har att vänta på spaken efter ankomsten till den plats där spaken kommer att utöka (Figur 5A-d). Genom att variera längden av väntar, kan omfattningen av ett djurs tålamod testas och kvantifieras ^13.

(5). Belöningar: Det slutliga målet med uppgiften är att få belöning (Figur 5A-e och figur 3). Behavioral uppgifter med detta system kan därmedenkelt utformade för att studera många aspekter av belöning-beslut frågor och funktion av värdet i hjärnan ^14-17.