Summary
В этом докладе мы описываем, как поверхностного плазменного резонанса используется для обнаружения токсина вступления в хост цитозоле. Этот высокочувствительный метод может обеспечить количественные данные о количестве цитозольного токсин, и он может быть применен к различным токсинам.
Abstract
AB токсины состоят из ферментативной субъединицы и клетка-связывающий B субъединицы 1. Эти токсины секретируются во внеклеточную среду, но они действуют на цели в пределах эукариотической цитозоле. Некоторые туристические AB токсинов пузырьков носителей от поверхности клетки, чтобы эндоплазматический ретикулум (ER), перед входом в цитозоле 2-4. В ER, каталитический диссоциирует цепь от остальной токсина и движется через белок-проводящий канал, чтобы достичь своей целевой цитозольного 5. Перемещаться, цитозольного цепи трудно обнаружить, поскольку токсин торговли людьми ER является крайне неэффективный процесс: большинство внутренним токсин направляется лизосом для деградации, так что только небольшая часть поверхности связанного токсина достигает аппарат Гольджи и ОР 6 -12.
Для контроля перемещения токсинов из ЭР в цитозоле в культуре клеток, мы объединили субклеточных протокол фракционирования с highlу чувствительный метод обнаружения поверхностного плазменного резонанса (SPR) 13-15. Плазматической мембраны токсин-обработанных клеток избирательно проницаемыми с дигитонин, позволяя коллекция цитозольного фракцию, которая впоследствии перфузии за датчик SPR покрыты анти-токсин цепи антитела. Покрытых антителами датчик может захватить и выявления пг / мл количество цитозольного токсина. С этим протоколом, то можно проследить кинетику токсин вступления в цитозоле и охарактеризовать тормозящее действие на транслокацию события. Концентрация цитозольного токсин может быть вычислена по стандартной кривой, полученной с известными количествами цепочке стандартов, которые были перфузии по датчику. Наш метод представляет собой быстрый, чувствительный и количественного определения системы, которая не требует радиоактивной метки или другие изменения целевой токсин.
Protocol
1. Подготовка дигитонин
- Добавить 500 мкл 100% этанола микроцентрифужных трубки и поместить его в тепло блок установлен на уровне 80 ° С в течение 10 мин.
- Растворите 2,5 мг дигитонин в 250 мкл этанола подогревом для производства 1% исходного раствора дигитонин.
- Для создания рабочего раствора 0,04% дигитонин, добавить 40 мкл исходного раствора дигитонин до 960 мкл HCN буфера (50 мМ Hepes рН 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ N-ethylmaleimide, и ингибитор протеазы коктейль).
2. Интоксикация клеток и пермеабилизации
Наши транслокации анализа может быть применена к целому ряду токсинов и клеточных линий. Ниже мы приводим подробный протокол для обнаружения холерного токсина (CT). Обзор процедура предусмотрена на рисунке 1.
- HeLa клетки высевают в 6-луночных планшетах, содержащих 1 мл DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков противогрибковыхдля достижения 1x10 6 клеток / лунку после инкубации в течение ночи при температуре 37 ° C. Для создания достаточно цитозольного токсина для воспроизводимых обнаружения, трех экземплярах скважин, необходимых для каждого состояния.
- После инкубации в течение ночи заменить культуральной среде с 1 мл DMEM, содержащей 100 нг / мл ганглиозида GM1. Это увеличивает число сайтов связывания КТ, как GM1 рецепторов СТ будет прибавлять в плазматической мембране клетки подвергаются решение GM1.
- После 1 часа инкубации при 37 ° С, удалить GM1 среде, содержащей и промыть клетки дважды DMEM. Затем поместите клетки при температуре 4 ° С в течение 30 мин в 1 мл DMEM, содержащей 1 мкг / мл КТ.
- Удалить токсин среде, содержащей, мыть клетки дважды DMEM, и инкубировать клеток в 1 мл DMEM при 37 ° C для желаемого интервала времени (ы).
- В конце каждого периода погони, мыть клетки с PBS и инкубировать в каждую лунку по 250 мкл 0,5 мМ ЭДТА в PBS. Пусть клетках сидят в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем удалить их с 6-луночный планшет энергичным растиранием с P1000 pipetman. После одной скважины клеток была собрана, объединить его со вторым, а затем третий и из того же состояния. Сотовые скребки также может быть использована для сбора клеток.
- Место комбинированной суспензии клеток из трех одинаковых скважин (750 мкл общего объема), в одной трубке микроцентрифужных, и раскручивать ее в настольный микроцентрифужных в течение 5 мин при 5000 х g. Сотовые гранул примерно соответствует размеру должен быть получен на любых условиях.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,04% рабочего раствора дигитонин. Место клеточной суспензии на льду в течение 10 мин.
- Спиновые дигитонин-проницаемыми клеток на 16 000 мкг в течение 10 мин в настольной микроцентрифужных. Передача цитозоле содержащих надосадочной фракции новую пробирку микроцентрифужных и сохранить органелл, содержащих гранулы фракции.
- Цитозоля содержащих надосадочной фракции разводят в буфере HCN до конечного объема 1 мл. Пример объемами не менее 1 мл, необходимые для обеспечения воздухом удаляется из 500 мкл цикла образца до инъекции.
- Органелл, содержащих гранулы фракции ресуспендировали в 1 мл HCN буфер, содержащий 1% Тритон Х-100. Добавление моющих средств необходимо освободить мембраной заключенная пул токсина.
- Токсин стандартов в концентрациях 100, 10, 1 и 0,1 нг / мл готовят в буфер HCN.
- Параллельные наборы цитозольного и органелл фракций готовы к контрольным экспериментом для подтверждения верности фракционирования процедуры. Фракции порожденных, как описано в разделе 2 ресуспендируют в 20 мкл буфера 4x образца (цитозольного фракции) или 120 мкл 1x образца буфера (органелл фракция). Эквивалентный объема каждой фракции решаются натрия додецилсульфата электрофореза в полиакриламидном геле сульфата и исследовали бу Вестерн-блот анализ, чтобы продемонстрировать разбиения цитозольного белка в надосадочной фракции и растворимый, житель белка ЭР во фракции гранул 16-19.
4. SPR слайд подготовки
- Reichert SR7000 SPR Рефрактометр используется для экспериментов SPR.
- Установить позолоченные стекло с самоорганизующихся монослоя в инструмент SPR. Чтобы активировать датчик слайдов, заливать 1:1 (по объему) раствор 0.4 М EDC и 0,1 М NHS за слайд течение 10 мин при расходе 41 мкл / мин. Все последующие перфузии будет использовать те же скорости потока.
- Для удаления EDC: NHS активации буфера, вымыть пластины в течение 5 мин с PBS, содержащем 0,05% Твин 20 (PBST). Пластину в настоящее время содержит реактивную тросов амида из-за uncapping от EDC: NHS решение.
- Заливать анти-CTA антител через активированный датчик слайдов в разведении 1:20,000 в 20 мМ ацетата натрия (рН 5,5) в течение 15 мин. Начальное падение показателя преломленияDEX единицы (РИУ) будет видно из-за изменения рН. Это будет сопровождаться увеличением RIU как антитело захватывается амид-реактивного тросов на датчике слайда.
- Удаление несвязанных антител от датчика слайд с 5 минут PBST стирки. Сигнал RIU производства захватили антитело плато и стабилизации, обеспечивая новый сигнал базовой линии.
- Заливать 1 М этаноламина (рН 8,5) над датчиком слайд в течение 5 мин. Это колпачки и инактивирует любые несвязанные тросов налево на датчик слайдов.
5. SPR анализа проб
- Чтобы установить базовые чтение, заливать PBST над антителами датчика в течение 5 мин.
- Заливать опытного образца или токсина в течение стандартного датчика на 300 сек. Удалить лиганд из буфера и заливать PBST над датчиком для еще 200 сек.
- После каждого перфузии, связанные токсины удаляются из датчика 100 сек промыть PBST при рН 5,0. Это вернет сигналав первоначальное чтение базового уровня, что позволяет другим образцом для обработки на одном датчике.
- Перед загрузкой нового образца, нажмите небольшое количество воздуха через образец петля исключить любой остаточной жидкости по сравнению с предыдущим образцом. Использование процедуры, описанной в 5.2-5.4, у нас работать до 12 образцов на одном слайде без существенной потери базового сигнала.
- Анализ данных осуществляется с помощью 2 Поломоечные программного обеспечения и программного обеспечения Игорь используется для фигурного подготовки.
6. Представитель Результаты
Коклюш токсина (РТ) является токсином AB, который перемещается от поверхности клеток к ER до его цепи (PTS1) входит в цитозоле 3, 12. Как показано на рисунке 2, наши SPR основе транслокации анализ может обнаружить PTS1 в цитозоле клеток СНО опьянения. Сигнал не был создан из цитозоле unintoxicated клетки, которые подтвердили анти-PTS1 антител не перекрестно реагируют с компонентом принимающей цитозоле.цитозольного фракции из клетки опьянения в присутствии brefeldin (BFA) также не привели к позитивным сигналом. BfA предотвращает токсин транспорте к месту ER транслокации 6-8, 12, 20-25 и, таким образом, цепочка доставки цитозоле. В конце каждого запуска, связаны токсинов удаляются от датчика слайдов. Это позволило несколько образцов, чтобы пройти обследование на одном слайде датчика и тем самым обеспечил прямое сравнение результатов, полученных при различных экспериментальных условиях.
КТ другой АВ-типа, ER-translocating токсин 4. На рисунке 3А, CTA1 был обнаружен в цитозольного фракции CT-обработанных клеток HeLa. Это подчеркнул, что наша методика работает с несколькими типами клеток и может быть применен к любой токсин, для которых анти-цепи антитела доступна. Сигнал не был обнаружен, когда цитозольного фракции CT-обработанных клеток было перфузии за датчик SPR покрыты анти-CTB антител (рис. 3В), тем самым демонстрируя, что CTA1субъединицы, но не клетка-связывающий CTB пентамера входит в цитозоле. Рис 3C показывает сигнал от фракции органелл выключен масштабах по сравнению с более слабым сигналом от цитозольного фракции. Это согласуется с известным неэффективности КТ транспорта ER сайта транслокации 6, 7, которая в свою очередь ограничивает количество токсинов, которые могут достигать цитозоле. Кроме того, фракция органелл содержит КТ holotoxin а также ER-локализованных CTA1, так что результирующий сигнал SPR для фракции органелл надувается от дополнительных масс holotoxin связанных CTB пентамера. Таким образом, это не практично для построения данных из органелл и цитоплазмы фракций на том же sensorgram.
Наш анализ может контролировать время-зависимое накопление перемещаться, цитозольного токсина (рис. 4). Клетки подвергались КТ при 4 ° С, температуры, что позволяет токсин привязки к мембране, но и предотвращает интернализации клеточно-ассоциированных токсина. После РемоВал несвязанного токсина, клетки нагревают до 37 ° C. Оба токсина транспорта в ЭР и цепи транслокации в цитозоль может произойти при этой температуре. Нет токсин был обнаружен в цитозоле через 15 минут после нагревания до 37 ° C. Это отражало лаг времени, необходимого для (я) holotoxin торговли в ЭР, (II) / B субъединицы диссоциации в ER, и (III) цепочки экспорта в цитозоле. Незначительных пул цитозольного токсин был обнаружен через 30 минут при температуре 37 ° С, и постепенно большего количества цитозольного токсина были выявлены после 45 и 60-минутными интервалами погони. Даже более высокие уровни цитозольного токсина были выявлены после 5 часов погони интервал 17, что свидетельствует о постоянной, долгосрочной доставки клеточно-ассоциированных токсина хост цитозоле.
Наш анализ также может обнаруживать ингибирование транслокации токсинов в цитозоле (рис. 5). Клетки обрабатывают 10% диметилсульфоксида (ДМСО), химических шаперонов, который предотвращает тепловое disordering выделенных CTA1 субъединицы (Т. и К. Банерджи Тетер, неопубликованные данные), выставлены низкие уровни цитозольного CTA1 по сравнению с необработанными клетками контроля. Происходящий из токсина цепи является необходимым условием для транслокации в цитозоле 16-18, так что ДМСО-индуцированной стабилизации CTA1 соответственно предотвратить его движение от ER к цитозоле.
Скорость константа ассоциации (к), рассчитанные из эксперимента SPR прямо пропорциональна концентрации лиганда в перфузии буфера 14, 15, 26. Таким образом, можно определить концентрацию цитозольного токсина из графика, участков к значениям для токсина стандартов в зависимости от концентрации токсина. Эта процедура используется для количественной ДМСО-индуцированной блок транслокации токсинов представлена на рисунке 5: стандартный кривой, полученной от известных концентраций токсин используется для расчета цитозольного CTA1 concentratион 0,3 нг / мл для необработанных клетках и 0,1 нг / мл для ДМСО-обработанных клеток (рис. 6). Ингибирование CTA1 разворачивается на ДМСО тем самым оказались в 3-кратное снижение ЭР-на-цитозоле транслокации CTA1.
Рисунок 1. Обзор протокола. (А) Клетки инкубировали с токсином АБ при температуре 4 ° С, температуры, что позволяет токсин связывания с клеточной поверхности, но и предотвращает токсин эндоцитоза. И В субъединицы токсинов представлены красные и синие круги, соответственно. (B) Unbound токсин удаляется из среды, и клетки нагревают до 37 ° С в целях содействия эндоцитоза и ретроградного транспорта holotoxin в РП. Holotoxin диссоциации происходит в ЭР, что позволяет изолированной цепи, чтобы войти в цитозоле, проходя через белок-проводящий канал (ы) в мембране ЭР. (C) клетки обрабатывают дигитонин для того, чтобы выборочно permeabilize плазмымембрану. (D) Центрифугирование используется для разделения клеток в отдельных органелл цитоплазмы и фракций. Цитозоле выдавливается из клетки через дигитонин генерируемых пор и находится в супернатант. Нетронутыми, мембраносвязанных органеллы находятся во фракции гранул. (Е) Для обнаружения транслоцируется бассейн токсина цепи в принимающей цитозоле, надосадочной фракции перфузии за датчик SPR покрыты анти-цепи антитела.
Рисунок 2. Обнаружение PTS1 транслокации в принимающее цитозоле. СНО клетки импульсно-меченых при 4 ° С в течение 30 мин с 1 мкг / мл PT. Клетки затем преследовали в течение 3 ч при температуре 37 ° С в токсина среде без, не содержащие добавок (опьянения) или 5 мкг BfA / мл (+ BfA состоянии опьянения). Пермеабилизации плазменной мембраны с дигитонин был использован для экстракты раздела клетки в отдельных органелл и цитоплазмы fractiдополнений. Датчик SPR покрыты анти-PTS1 антител был использован для обнаружения цитозольного пул PTS1 из необработанных или БФА-обработанных клеток. PTS1 стандарты перфузии над датчиком как положительного контроля, в то время цитозольного фракции из unintoxicated клеток перфузии над датчиком слайдов в качестве отрицательного контроля. В конце каждого запуска, связанного образец был лишен от датчика слайдов.
Рисунок 3. Обнаружение CTA1 транслокации в принимающее цитозоле. HeLa клетки импульсно-меченых при 4 ° С с 1 мкг / мл КТ были изгнаны в течение 2 часов при температуре 37 ° С в токсин-среде, свободной, не содержащие добавок (опьянения) или 5 мкг BfA / мл (+ BfA состоянии опьянения). Пермеабилизации плазменной мембраны с дигитонин был использован для экстракты раздела клетки в отдельных органелл и цитоплазмы фракций. (А) цитозольного фракции перфузии за датчик SPR покрыты анти-CTA антител. Известныйколичества CTA были использованы в качестве положительного контроля, в то время цитозоле из unintoxicated клетки был использован в качестве отрицательного контроля. (B) цитозольного фракции из клетки опьянения при отсутствии BfA был перфузии за датчик SPR покрыты анти-CTB антител. Очищенный CTB пентамера был перфузии более слайд в качестве положительного контроля. (C) фракция органелл был солюбилизированного с 1% Тритон Х-100 до перфузии за датчик SPR покрыты анти-CTA антител. Для сравнения, цитозольного дробь (1 мл конечного объема) из того же экстракта клеток и CTA стандартный также перфузии над датчиком. Для всех панелей, связанный образец был лишен от датчика в конце каждого запуска.
Рисунок 4. Кинетика CTA1 вступления в цитозоле. HeLa клетки импульсно-меченых при 4 ° С с 1 мкг / мл КТ были изгнаны на 15, 30, 45, или 60 мин при 37 ° С в токсина без mediuметр Для обнаружения транслоцируется пул токсин, цитозольного фракций из дигитонин-проницаемыми клетки перфузии за датчик SPR покрыты анти-CTA антител. CTA стандарты перфузии на сенсор, а также. В конце каждого запуска, связанного образец был лишен от датчика слайдов.
Рисунок 5. Ингибирование CTA1 транслокации по ДМСО. HeLa клетки импульсно-меченых при 4 ° С с 1 мкг / мл КТ были изгнаны в течение 2 часов при температуре 37 ° С в токсин-среде, свободной, не содержащие добавок (опьянения) или 10% ДМСО (+ ДМСО состоянии опьянения). Для обнаружения транслоцируется пул токсин, цитозольного фракций из дигитонин-проницаемыми клетки перфузии за датчик SPR покрыты анти-CTA антител. CTA стандартов (100, 10, 1 и 0,1 нг / мл) перфузии над датчиком как положительного контроля, и только 1 и 0,1 нг / мл стандартов показаны для масштабирования целей. Цитозоле из unintoxicateг клетки был использован в качестве отрицательного контроля. В конце каждого запуска, связанного образец был лишен от датчика слайдов.
Рисунок 6. Расчет цитозольного CTA1. А значения стандартов CTA на рисунке 5 были построены в зависимости от концентрации токсина. В результате стандартной кривой был использован для определения, на основе к значениям экспериментальных образцов на рисунке 5, концентрация цитозольного CTA1 в необработанных и обработанных ДМСО клеток. Токсин стандарты представлены в виде кружки, необработанной цитозоле представлена как открытая площадь, и ДМСО обработанных цитозоле представлена как открытая круг. Средние ± диапазонов двух независимых экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сравнение с существующей методологии
Наши SPR основе анализа транслокации представляет быстрый, чувствительный и количественный метод для обнаружения токсина доставку в принимающее цитозоле. Техника не требует радиоактивной метки или другие изменения токсин, и он может быть применен к любой токсин, для которых антитоксин цепи антитела доступна. Существующие методы мониторинга токсин проход в цитозоле также полагаться на субклеточном протокол фракционирования для разделения клеточных экстрактов на отдельные цитозоле и мембранные фракции 11, 23, 27, 28. Эти методы используют иммуноблоттинг или радиоактивные метки для выявления цитозольного пул токсина. Первый подход полуколичественного в лучшем случае и страдает от относительно бедных чувствительности. Даже радиоактивной протоколов может занять несколько недель для получения результата, в связи с низким уровнем токсинов, которые достигают цитозоле. Хотя количественный анализ с радиоактивным токсин может определить процентное соотношениеклеточных связанных токсин, который входит в цитозоле, этот подход не может непосредственно определить точное число цитозольного молекул токсина. Сравнение чувствительности обнаружения токсина SPR для обнаружения радиоактивно токсин, следовательно, проблематично, так как количество цитозольного токсин может быть вычислена по SPR, но не радиоактивной метки.
Другие анализы транслокации обход шагов вверх по течению торговли токсин и доставить токсин цепи непосредственно к ER с помощью либо плазмиды основе выражения системах или в пробирке транскрипции / перевод системы 29-38. Для любого из этих методов, амино-концевой сигнальной последовательности целей цепи для совместного поступательного ввоз в ЭР просвет. Экспорт синтезировали цепи от ER затем обнаружен субклеточного фракционирования, дифференциального центрифугирования, токсин активности в цитозоле, протеасомной деградации транслоцируется токсин, и / или цитозольного конкретного токсина модификации. Подмножества из этих подходов длякли только на транслокацию событие, может быть использован для экспериментов в пробирке восстановления, и производить повышенный уровень токсина для обнаружения и со-иммунопреципитации исследований. Тем не менее, методологии не может определить, кинетика и эффективность доставки токсина с клеточной поверхности в цитозоле. Возможно также, что перемещаются цепи не входит ER в том же состоянии, как конформационные holotoxin доставки цепи. Другие аспекты хост-токсин взаимодействия отсутствуют эти процедуры, такие как A / B акте диссоциации. Таким образом, Есть сильные и слабые стороны для мониторинга перемещения с цепями, которые синтезируются непосредственно в ER.
Токсин транслокации часто обнаруживается через интоксикации анализов. Цитотоксические или цитопатический эффект порожденных экзогенно применяется токсин демонстрирует токсин цепи достигла своего цитозольного цели. Очевидно, что это косвенным показателем, который отслеживает перемещение токсиновctivity в цитозоле, а не физическое присутствие цитозольного токсина. Таким образом, техника не может ни количественно уровни цитозольного токсин, ни непосредственно обнаружить изменена обработка транслокации токсина. Есть также ситуации, в которых прямая корреляция между уровнями цитозольного токсина и токсина деятельности не существует, например, возможная необходимость в пороговой концентрации цитозольного токсина, чтобы вызвать клеточный ответ, или когда токсин деятельности производит насыщенный клеточный ответ. Тем не менее, интоксикации анализов могут обеспечить функциональное соотношение для анализов, которые непосредственно документе транслокации события. Ранее мы уже использовали эту стратегию, чтобы продемонстрировать торможение цепи транслокации соответствует торможению клеточной интоксикации 17-19.
Таким образом, Есть несколько методов для обнаружения токсина доставки цитозоле. Наши SPR подход, основанный на преимуществах предоставления быстрых, чувствительных и количественных результатов. Гата также могут быть дополнены экспериментов с использованием одной из вышеупомянутых старше стратегии для создания более сильной заключение.
Будущие приложения
Наш лейбл, свободной метод обнаружения и количественного определения цитозольного токсина обеспечивает исследователей с гибкостью для решения многих нерешенных вопросов в отношении клеточной биологии опьянения. Например, можно установить эффективность цепочки доставки цитозоле, вычисляя процент поверхностных связанного токсин, который достигает цитозоле. Кроме того, можно количественно оценить общий объем цитозольного токсинов и, как следствие, число цитозольного молекул токсина в клетку. Считается, что одна молекула токсина дифтерии цитозольного достаточно, чтобы вызвать полную цитопатического / цитотоксическое действие 39; эта модель теперь может быть протестирована с другими токсинами с помощью нашего анализа транслокации и корреляционного анализов опьянения. Таким образом, наши SPR основе анализа шоULD быть в состоянии определить, сколько молекул цитозольного токсина, необходимых для продуктивной опьянения. Наша методика может также отслеживать сохранение цитозольного токсина. Существенное ухудшение транслоцируется цепь будет ограничивать и, возможно, снизить его концентрацию цитозольного с течением времени, которое означало бы последствия интоксикации может быть обращена вспять, если цепь доступ к цитозоле был ограничен после первоначального воздействия токсина. Кроме того, внеклеточной средой и мембраны гранул из опьянения клетки могут быть использованы для отслеживания количества выделяется токсин или токсин, проживающих в endomembrane системы, соответственно. Сравнительные исследования внеклеточной, endomembrane локализованных и цитозольного токсин может быть использована для изучения того, как клеточная биология интоксикации варьирует для разных ER-translocating токсинов. Наш анализ также может быть использован для рассекать токсин-специфических клеточных факторов, необходимых для перемещения событие 19. Должна быть возможность адаптировать нашу методологию для отслеживанияэндосом к цитозоле транслокации других токсинов AB таких как сибирская язва и летального фактора токсина дифтерии. Наконец, вирусные вступления в хост цитозоле могли быть проверены с аналогичной экспериментальной процедуры.
Недостатки
Условия, которые препятствуют торговле токсина в ЭР, а также предотвратит токсин доставки цитозоле. Это было продемонстрировано отсутствие цитозольного токсина в БФА-обработанных клеток (рис. 2, 3A). Таким образом, дополнительные контрольные эксперименты необходимы при использовании этого метода для изучения потенциальных блоков токсин транслокации. Для некоторых AB токсинов, снижение дисульфидных связей, что тросов каталитической субъединицы его holotoxin происходит в ОР 6, стр. 40-43. Окислительно-восстановительный статус цепи поэтому может быть использован в качестве меры токсин транспорта ER 16, 18. Рекомбинантный токсинов содержащие консенсус последовательность для N-связанное гликозилирование, модификация, которая начинается в ER, также былииспользуется для обнаружения токсина вступления в ER 12, 23, 44-46. Наконец, как уже говорилось выше, альтернативных протоколов с участием со-поступательные вставки токсин цепи в ER просвет может проверить, тормозящее влияние на транслокацию события. Например, наши SPR основе транслокации анализа показали функциональную роль Hsp90 в CTA1 транслокации, что было подтверждено с плазмидой-системы, что выражается CTA1 непосредственно в просвет ЭР 19.
Цепи ER-translocating токсинов демонстрируют сильную аргинин-по-лизин аминокислоты смещения кислоту, которая позволяет перемещаться токсина, чтобы избежать убиквитин-зависимой протеасомной деградации 47-50. Тем не менее, деградация цитозольного токсина до сих пор происходит за счет относительно медленно, убиквитин-независимой протеасомной механизм 51, 52. Условия, которые повышают протеасомной активности может таким образом исказить результаты нашего анализа транслокации путем уменьшения пула транслокации токсина в цитозольного фраction. Клетки подвергаются протеасомы ингибитора может быть использована для контроля за эту возможность; увеличение цитозольного токсин в результате протеасомной торможение будет означать токсин действительно может достичь цитозоле но деградировали до обнаружения.
Следует отметить, что эти рассуждения применимы и к подмножеств вышеупомянутых альтернативных подходов и не являются уникальными для нашего метода. Как упоминалось ранее, лучшая стратегия для характеристики транслокации событие является использование сочетания хорошо контролируемых технологий.
Критические шаги и устранения неисправностей
Химическая подготовка является важнейшим шагом для анализа. Дигитонин не растворяется легко, и он должен быть готовым свежим для каждого эксперимента. Кроме того, свежие PBST должны быть использованы для анализа SPR. EDC: NHS активации буфера следует готовить непосредственно перед употреблением, он не будет сохранять активность при хранении после смешивания двух решений. Howeveг, отдельные аликвоты EDC и NHS может храниться при -80 ° С и размораживать один раз перед использованием. Все решения, в том числе образцов, должны быть де-газом до инъекции. Это позволит предотвратить воздуха вызванного всплески сигнала SPR.
Тип клеток, который будет использоваться для этого анализа должны выразить рецепторов достаточно токсина, чтобы обнаружить бассейн токсина цепи для достижения цитозоле. В некоторых случаях, например, предварительная обработка клеток HeLa с GM1 до заражения CT, дополнительные рецепторы токсина могут быть добавлены к поверхности клетки-мишени. Типа клеток также должны быть восприимчивы к селективной пермеабилизации плазмы мембраны с дигитонин. Протокол, описанный в настоящем документе, эффективные с HeLa и СНО клетки, но и другие типы клеток потребует оптимизации шаг, используя Вестерн-блот анализе контролировать четкое разделение органелл и цитоплазмы фракций. Мы регулярно следить распределения белка изомеразы дисульфида (растворимого белка ЭР) и Hsp90 (цитозольного Proteв) для этой цели 16-19. Эксклюзивные перегородки белка дисульфида изомеразы во фракцию гранул 16-19 также гарантирует, что органеллы, собранных в мембраны гранул не повреждены. Это очень важный аспект нашего метода, как непреднамеренного разрыва внутриклеточных органелл внесет ошибки в системе, освободив endomembrane ограничением токсина в цитозольного фракции. SPR основе экспериментов также может быть использован, чтобы продемонстрировать, что цитозольного бассейн токсина результате транслокации событие, а не из лизис внутриклеточных органелл. Например, не токсин был обнаружен в цитозоле БФА-обработанных клеток (рис. 2, 3A) или клеток воздействию токсинов лишь 15 минут (рис. 4). Кроме того, B субъединицы CT не был обнаружен в цитозольного фракции после двухчасового воздействия токсина (рис. 3В). Если бы наш протокол привел к пермеабилизации внутренних мембран, мы бы обнаружили цитозольного бассейн токсина для каждой из вышеупомянутых условий. Создание надлежащих протоколов для воспроизводимых, селективные пермеабилизации из плазматической мембраны, вероятно, представляют собой ограничение скорости шаг для анализа реализации. Другие варианты пермеабилизации плазматической мембране имеются, но мы обнаружили, что дигитонин лечения, предоставляемого более надежные результаты, чем другие методы, такие как лечение стрептолизином О.
Качество антител также будет определять чувствительность теста, который может быть установлен с серийных разведений токсина стандарта. Например, мы можем обнаружить воспроизводимо всего 0,1 нг / мл или PTS1 или CTA стандарт (рис. 2-6). Анти-цепи антитела не должны признавать субъединица токсина В, а unintoxicated клетках всегда должна быть использована в качестве контроля для обеспечения антител не перекрестно реагируют с белками в клетке-хозяине. Предварительные эксперименты необходимо оптимизировать условия для зачистки связаны токсинов из антител, так как это может отличатьсядля различных анти-токсин антител.
При мониторинге токсин транслокации в изменившихся сотовой условиях, токсин стандартов и цитозольного фракции из необработанных клетках контроля должны быть дополнены в соответствии с условиями в опытный образец. Например, CTA стандартов и необработанной цитозольного фракции Рисунок 5 были с добавлением 1% ДМСО, чтобы соответствовать конечная концентрация препарата в цитозольного фракции из ДМСО-обработанных клеток. Это исключает возможные различия в сигналах SPR, которые могут возникнуть из-за различий в химическом составе собранных фракций. Сравнения между цитозольного и органелл фракции будет также требуют добавления 1% Тритон Х-100 для цитозольного фракции и стандартов, так как это моющее средство используется для выпуска мембранной заключенная токсинов из фракции органелл для обнаружения SPR. Предварительные эксперименты показали наличие цитозоле не изменяет ответа SPR, чтобы токсин стандартов,так что это не необходимо дополнить токсин стандарты цитозоле из unintoxicated клеток.
Связывания антител к датчику слайд не произойдет, если EDC: NHS активации решение старых или, если слайд вставляется в прибор с золотым лицом вниз. С учетом производственного процесса, будут какие-то пластины к пластине изменчивости, которые могут препятствовать надлежащему EDC: NHS активации и, таким образом, антитела захвата. Если антитела к слайду плохое, о чем свидетельствует слабо повышенным RIU, второй инъекции может внести больше антител на тарелку. RIU произвольная единица, которая варьируется от одного эксперимента к другому в зависимости от того, сколько анти-токсин антител осаждается на датчике. Тем не менее, и выключается ставки будут оставаться постоянными.
Желательно использовать рефрактометр с двумя камерами перфузии канал, как один канал может быть использован для экспериментального образца и другой канал может быть использован для буфера алопе, чтобы исправить возможные дрейф базовой линии. При использовании двойной инструмент камеры, убедитесь, что анти-токсин антител добавляется только к одному из двух каналов. Образцы будут впоследствии работать по обоим каналам. С помощью одного инструмента канал, компенсации за базовой линии включает в себя коллекцию из буфера только данные из покрытых антителами слайд до образцов инъекций.
Перед началом эксперимента SPR, убедитесь, датчик слайд установлен жесткий в инструменте и все фитинги безопасным. Утечки в результате этих вопросов будут генерировать воздуха спайки в собранных данных. Утечка может быть обнаружена и отсутствие движения отходов, которые должны присутствовать всегда. Объем пробы больше, чем объем инъекции цикла необходимо, чтобы избежать воздушных шипами, а также - к примеру, мы используем 1 мл объема образца с 500 мкл цикл инъекций. Неуместным количество иммерсионного масла на призме будет препятствовать стабилизации базовой подписейл Другие вопросы, касающиеся работы прибора SPR, рассматриваются в Руководстве пользователя и технические бюллетени предоставляемые Reichert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH грант R01 AI073783 К. Тетер. Мы благодарим доктора Шейна Massey за помощь в развитии субклеточного фракционирования протокол и Хелен Burress за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Ganglioside GM1 | Sigma-Aldrich | G7641 | |
| CTA | Sigma-Aldrich | C2398 | |
| PTS1 | List | 182 | |
| NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce, Thermo Scientific | 24500 | |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22981 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135 | |
| PBST | Medicago | 09-8903-100 | |
| Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-80747 | |
| Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 | |
| Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-57639 | |
| Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC | |
| SPR sensor slides | Reichert | 13206060 | |
| Syringe pump | Cole-Parmer | 780200C |
References
- Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
- Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
- Carbonetti, N. H. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol. 5, 455-469 (2010).
- Wernick, N. L. B., Chinnapen, D. J. -F., Cho, J. A., Lencer, W. I. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins. 2, 310-325 (2010).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Lencer, W. I. Entry of protein toxins into mammalian cells by crossing the endoplasmic reticulum membrane: co-opting basic mechanisms of endoplasmic reticulum-associated degradation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 300, 149-168 (2005).
- Lencer, W. I. Entry of cholera toxin into polarized human intestinal epithelial cells. Identification of an early brefeldin A sensitive event required for A1-peptide generation. J. Clin. Invest. 92, 2941-2951 (1993).
- Orlandi, P. A., Curran, P. K., Fishman, P. H. Brefeldin A blocks the response of cultured cells to cholera toxin. Implications for intracellular trafficking in toxin action. J. Biol. Chem. 268, 12010-12016 (1993).
- Sandvig, K., Prydz, K., Hansen, S. H., van Deurs, B. Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. J. Cell. Biol. 115, 971-981 (1991).
- Sandvig, K., Prydz, K., Ryd, M., van Deurs, B. Endocytosis and intracellular transport of the glycolipid-binding ligand Shiga toxin in polarized MDCK cells. J. Cell Biol. 113, 553-562 (1991).
- van Deurs, B. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 106, 253-267 (1988).
- Tam, P. J., Lingwood, C. A. Membrane cytosolic translocation of verotoxin A1 subunit in target cells. Microbiology. 153, 2700-2710 (2007).
- Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cell. Microbiol. 10, 1130-1139 (2008).
- Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Medaglia, M. V., Fisher, R. J. Protein-Protein Interactions. Golemis, E. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 255-272 (2002).
- Banerjee, T. Contribution of subdomain structure to the thermal stability of the cholera toxin A1 subunit. Biochemistry. 49, 8839-8846 (2010).
- Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. J. Mol. Biol. 393, 1083-1096 (2009).
- Taylor, M. A therapeutic chemical chaperone inhibits cholera intoxication and unfolding/translocation of the cholera toxin A1 subunit. PLoS ONE. 6, e18825-e18825 (2011).
- Taylor, M. Hsp90 is required for transfer of the cholera toxin A1 subunit from the endoplasmic reticulum to the cytosol. J. Biol. Chem. 285, 31261-31267 (2010).
- Donta, S. T., Beristain, S., Tomicic, T. K. Inhibition of heat-labile cholera and Escherichia coli enterotoxins by brefeldin A. Infect. Immun. 61, 3282-3286 (1993).
- Donta, S. T., Tomicic, T. K., Donohue-Rolfe, A. Inhibition of Shiga-like toxins by brefeldin. A. J. Infect. Dis. 171, 721-724 (1995).
- Nambiar, M. P., Oda, T., Chen, C., Kuwazuru, Y., Wu, H. C. Involvement of the Golgi region in the intracellular trafficking of cholera toxin. J. Cell. Physiol. 154, 222-228 (1993).
- Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3783-3788 (1997).
- Xu, Y., Barbieri, J. T. Pertussis toxin-mediated ADP-ribosylation of target proteins in Chinese hamster ovary cells involves a vesicle trafficking mechanism. Infect. Immun. 63, 825-832 (1995).
- Yoshida, T., Chen, C. C., Zhang, M. S., Wu, H. C. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricin, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp. Cell Res. 192, 389-395 (1991).
- Godber, B. Direct quantification of analyte concentration by resonant acoustic profiling. Clin. Chem. 51, 1962-1972 (2005).
- Bernardi, K. M., Forster, M. L., Lencer, W. I., Tsai, B. Derlin-1 facilitates the retro-translocation of cholera toxin. Mol. Biol. Cell. 19, 877-884 (2008).
- Wernick, N. L., De Luca, H., Kam, W. R., Lencer, W. I. N-terminal Extension of the Cholera Toxin A1-chain Causes Rapid Degradation after Retrotranslocation from Endoplasmic Reticulum to Cytosol. J. Biol. Chem. 285, 6145-6152 (2010).
- Simpson, J. C. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS. Lett. 459, 80-84 (1999).
- Veithen, A., Raze, D., Locht, C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int. J. Med. Microbiol. 290, 409-413 (2000).
- Castro, M. G., McNamara, U., Carbonetti, N. H. Expression, activity and cytotoxicity of pertussis toxin S1 subunit in transfected mammalian cells. Cell. Microbiol. 3, 45-54 (2001).
- Schmitz, A., Herrgen, H., Winkeler, A., Herzog, V. Cholera toxin is exported from microsomes by the Sec61p complex. J. Cell Biol. 148, 1203-1212 (2000).
- Teter, K., Allyn, R. L., Jobling, M. G., Holmes, R. K. Transfer of the cholera toxin A1 polypeptide from the endoplasmic reticulum to the cytosol is a rapid process facilitated by the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Infect. Immun. 70, 6166-6171 (2002).
- Winkeler, A., Godderz, D., Herzog, V., Schmitz, A. BiP-dependent export of cholera toxin from endoplasmic reticulum-derived microsomes. FEBS Lett. 554, 439-442 (2003).
- Yu, M., Haslam, D. B. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect. Immun. 73, 2524-2532 (2005).
- LaPointe, P., Wei, X., Gariepy, J. A role for the protease-sensitive loop region of Shiga-like toxin 1 in the retrotranslocation of its A1 domain from the endoplasmic reticulum lumen. J. Biol. Chem. 280, 23310-23318 (2005).
- Teter, K., Jobling, M. G., Sentz, D., Holmes, R. K. The cholera toxin A13 subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect. Immun. 74, 2259-2267 (2006).
- Redmann, V. Dislocation of ricin toxin a chains in human cells utilizes selective cellular factors. J. Biol. Chem. 286, 21231-21238 (2011).
- Yamaizumi, M., Mekada, E., Uchida, T., Okada, Y. One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell. 15, 245-250 (1978).
- Bellisola, G. Reductive activation of ricin and ricin A-chain immunotoxins by protein disulfide isomerase and thioredoxin reductase. Biochem. Pharmacol. 67, 1721-1731 (2004).
- McKee, M. L., FitzGerald, D. J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Biochemistry. 38, 16507-16513 (1999).
- Orlandi, P. A. Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line. J. Biol. Chem. 272, 4591-4599 (1997).
- Spooner, R. A. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383, 285-293 (2004).
- Fujinaga, Y. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol. Biol. Cell. 14, 4783-4793 (2003).
- Guerra, L. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway. Cell. Microbiol. 7, 921-934 (2005).
- Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. J. Biol. Chem. 272, 19554-19561 (1997).
- Deeks, E. D. The low lysine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biochemistry. 41, 3405-3413 (2002).
- Hazes, B., Read, R. J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36, 11051-11054 (1997).
- Rodighiero, C., Tsai, B., Rapoport, T. A., Lencer, W. I. Role of ubiquitination in retro-translocation of cholera toxin and escape of cytosolic degradation. EMBO Rep. 3, 1222-1227 (2002).
- Worthington, Z. E., Carbonetti, N. H. Evading the proteasome: absence of lysine residues contributes to pertussis toxin activity by evasion of proteasome degradation. Infect. Immun. 75, 2946-2953 (2007).
- Pande, A. H., Moe, D., Jamnadas, M., Tatulian, S. A., Teter, K. The pertussis toxin S1 subunit is a thermally unstable protein susceptible to degradation by the 20S proteasome. Biochemistry. 45, 13734-13740 (2006).
- Pande, A. H. Conformational instability of the cholera toxin A1 polypeptide. J. Mol. Biol. 374, 1114-1128 (2007).
