Summary
In diesem Bericht beschreiben wir, wie Oberflächen-Plasmon-Resonanz verwendet wird, um Toxin Einreise in den Aufnahmemitgliedstaat Zytosol zu erkennen. Dieser hochempfindliche Methode lassen sich quantitative Daten über die Höhe der zytosolischen Toxin geben, und es kann zu einer Reihe von Toxinen eingesetzt werden.
Abstract
AB Toxine bestehen aus einer enzymatischen A-Untereinheit und einer Zell-bindenden B-Untereinheit 1. Diese Toxine sind in das extrazelluläre Milieu ausgeschieden, aber sie wirken auf Ziele innerhalb der eukaryotischen Cytosol. Einige AB Toxine Reise durch Vesikel Träger von der Zelloberfläche zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) vor dem Eintritt in das Zytosol 2-4. In der Notaufnahme, um die katalytische A-Kette distanziert sich von dem Rest des Toxins und bewegt sich durch ein Protein-leitenden Kanals erreichen ihren zytosolischen Ziel 5. Die transloziert, cytosolische Eine Kette ist nur schwer zu erkennen, weil Toxin Menschenhandel, die ER ist ein sehr ineffizienter Prozess: Die meisten verinnerlicht Toxin wird zu den Lysosomen zum Abbau geführt, so dass nur ein kleiner Bruchteil der Oberflächen-gebundenen Toxin gelangt der Golgi-Apparat und ER 6 -12.
Zur Überwachung Toxin Translokation aus dem ER ins Zytosol in kultivierten Zellen, kombinierten wir eine subzelluläre Fraktionierung-Protokoll mit den highly empfindliche Nachweismethode der Surface Plasmon Resonance (SPR) 13-15. Die Plasmamembran der Toxin-behandelten Zellen selektiv mit Digitonin permeabilisiert, wodurch Sammlung eines zytosolischen Fraktion, die anschließend über einen SPR-Sensor mit einer Anti-Toxin A-Antikörper beschichtet ist, perfundiert. Die Antikörper-beschichteten Sensor kann erfassen und erkennen pg / mL Mengen von zytosolischen Toxin. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kinetik der Toxin-Eintrag in das Zytosol zu folgen und hemmende Wirkung auf die Translokation Ereignis zu charakterisieren. Die Konzentration der zytosolischen Toxin kann auch aus einer Standardkurve mit bekannten Mengen von A-Kette Standards, die über den Sensor wurden perfundiert, festgesetzt werden. Unsere Methode stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Nachweis-System, das keine radioaktiven Markierung oder andere Änderungen an der Ziel-Toxin.
Protocol
1. Vorbereitung der Digitonin
- Add 500 mL 100% Ethanol zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in einem Heizblock bei 80 ° C für 10 min eingestellt.
- Lösen von 2,5 mg Digitonin in 250 ul der beheizten Ethanol bis zu einer 1% Stammlösung von Digitonin zu produzieren.
- So generieren Sie eine funktionierende Lösung von 0,04% Digitonin, dann werden 40 ul der Digitonin-Stammlösung zu 960 ul der HCN-Puffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-Ethylmaleimid, und ein Protease-Inhibitor Cocktail).
2. Zell-Rausch und Permeabilisierung
Unsere Translokation Test kann auf eine Reihe von Toxinen und Zelllinien verwendet werden. Im Folgenden stellen wir ein detailliertes Protokoll für den Nachweis von Cholera-Toxin (CT). Eine Übersicht über die Vorgehensweise ist in Abbildung 1 dargestellt.
- HeLa-Zellen werden in 6-well-Platten mit 1 ml DMEM ausgesät ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika-Antimykotikumzu erreichen, 1x10 6 Zellen / Well nach einer Inkubation über Nacht bei 37 ° C. So generieren Sie genug zytosolische Toxin für reproduzierbare Detektion werden dreifachen Wells für jede Bedingung erforderlich.
- Nach einer Inkubation über Nacht, ersetzen Sie das Kulturmedium mit 1 mL DMEM mit 100 ng / mL Gangliosid GM1. Dadurch erhöht sich die Anzahl der Bindungsstellen für CT, da die GM1-Rezeptor von CT in der Plasmamembran von Zellen, die eine Lösung von GM1 einlagern wird.
- Nach einer 1 Std. Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die GM1-haltigem Medium und die Zellen zweimal mit DMEM. Legen Sie dann die Zellen bei 4 ° C für 30 min in 1 ml DMEM mit 1 ug / ml CT.
- Entfernen Sie das Toxin-haltigem Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit DMEM und inkubieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM bei 37 ° C für das gewünschte Zeitintervall (s).
- Am Ende jeder Periode jagen, waschen Sie die Zellen mit PBS und Inkubation jede Vertiefung mit 250 ul 0,5 mM EDTA in PBS. Lassen Sie die Zellen sitzen für 10 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie sie aus der 6-Well-Platte durch kräftiges Reiben mit einem p1000 Pipetman. Nach einem gut von Zellen gesammelt worden ist, kombinieren Sie es mit der zweiten und dann die dritte und aus dem gleichen Zustand. Zellschaber kann auch verwendet werden, um die Zellen zu sammeln.
- Legen Sie der kombinierten Zellsuspension aus den drei replizieren Brunnen (750 ul Gesamtvolumen) in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen, und drehen Sie es in eine Tischplatte Mikrozentrifuge für 5 min bei 5.000 x g. Die Zellpellets der entspricht in etwa Größe sollte für alle Bedingungen erhalten werden.
- Überstand verwerfen und Zellpellet in 100 ul des 0,04% funktionierende Lösung von Digitonin. Legen Sie die Zellsuspension auf Eis für 10 min.
- Drehen Sie das Digitonin-permeabilisierten Zellen bei 16.000 xg für 10 min in eine Tischplatte Mikrozentrifuge. Übertragen Sie die Cytosol-haltigen Überstandsfraktion eine frische Mikrozentrifugenröhrchen, und behalten die Organellen-Pellet-Fraktion.
- Cytosol-haltige Überstand-Fraktionen werden in HCN-Puffer auf ein Endvolumen von 1 mL verdünnt. Probenvolumina von mindestens 1 mL sind notwendig, um sicherzustellen, Luft aus dem 500 mL-Probenschleife vor der Injektion gespült wird.
- Organellen-Pellet-Fraktionen werden in 1 ml HCN-Puffer mit 1% Triton X-100 resuspendiert. Der Zusatz von Waschmittel ist notwendig, um die Membran-umhüllten Pool Freisetzung von Toxinen.
- Toxin-Standards in Konzentrationen von 100, 10, 1 und 0,1 ng / mL sind in HCN-Puffer hergestellt.
- Parallel setzt der cytosolischen und Organellen-Fraktionen werden für einen Kontroll-Versuch bereit, die Treue der Fraktionierung Verfahren zu bestätigen. Fraktionen erzeugt, wie in Abschnitt 2 beschrieben sind, in 20 ul 4x Probenpuffer (cytosolische Fraktion) oder 120 ul 1x Probenpuffer (Organell-Fraktion) resuspendiert. Äquivalente Volumina der einzelnen Fraktionen werden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgelöst und sondiert by Western-Blot-Analyse zeigen, die Partitionierung einer zytosolischen Protein im Überstand-Fraktion und eine lösliche, wohnhaft ER-Protein in der Pelletfraktion 16-19.
4. SPR Präparat
- Die Reichert SR7000 SPR Refraktometer ist für SPR-Experimenten verwendet.
- Legen Sie eine vergoldete Glasträger mit einer selbstorganisierten Monoschicht in die SPR Instrument. So aktivieren Sie den Sensor schieben, perfuse einer 1:1 (v: v) Lösung von 0,4 M EDC und 0,1 M NHS über die Rutsche für 10 min bei einer Flussrate von 41 ul / min. Alle nachfolgenden Infusionen wird die gleiche Durchflussmenge.
- Zum Entfernen des EDC: NHS-Aktivierung Puffer, waschen Sie die Platte für 5 min mit PBS mit 0,05% Tween 20 (PBST). Die Platte enthält jetzt reaktiven Amid Anbindehaltung durch Entdeckeln durch die EDC: NHS-Lösung.
- Perfundieren ein Anti-CTA-Antikörper über den aktivierten Sensor gleiten bei einer Verdünnung von 1:20.000 in 20 mM Natriumacetat (pH 5,5) für 15 min. Ein erster Tropfen auf den refraktiven index-Einheit (RIU) wird aufgrund der pH-Änderung zu sehen. Dies wird durch eine Erhöhung der RIU gefolgt werden, da die Antikörper durch die Amid-reaktive Anbindehaltung auf den Sensor schieben erfasst wird.
- Entfernen ungebundener Antikörper aus dem Sensor Folie mit einem 5 Minuten PBST waschen. Die RIU-Signal durch das aufgenommene Antikörper produziert werden Plateau und zu stabilisieren, die Bereitstellung einer neuen Baseline-Signal.
- Perfundieren 1 M Ethanolamin (pH 8,5) über den Sensor schieben für 5 min. Diese Kappen und inaktiviert alle ungebundenen Anbindehaltung auf den Sensor gleiten gelassen.
5. SPR-Analyse von Proben
- Um eine Baseline Lesen, perfuse PBST über den Antikörper-beschichteten Sensor für 5 min.
- Perfundieren einer experimentellen Probe oder Toxin-Standard über den Sensor für 300 Sekunden. Entfernen Sie die Liganden aus dem Puffer und perfuse PBST über den Sensor für weitere 200 sek.
- Nach jeder Perfusion, gebunden ist Toxin vom Sensor durch eine 100 sec waschen mit PBST bei pH 5,0 entfernt. Damit wird das Signalseine ursprüngliche Grundlinie Lesen, so dass eine weitere Probe auf dem gleichen Sensor verarbeitet werden.
- Vor dem Laden einer neuen Probe, drücken Sie eine kleine Menge Luft durch die Probenschleife, um restliche Flüssigkeit aus dem Stand der Probe zu vertreiben. Unter Verwendung des Verfahrens in 5,2-5,4 dargelegt, haben wir bis zu 12 Proben auf einer Folie laufen ohne wesentlichen Verlust der Baseline-Signal.
- Datenanalyse mit dem Scrubber 2-Software durchgeführt, und die Igor-Software ist für Abbildung der Herstellung verwendet.
6. Repräsentative Ergebnisse
Pertussis-Toxin (PT) ist ein AB-Toxin, das von der Zelloberfläche bewegt sich die ER vor der A-Kette (PTS1) tritt das Zytosol 3, 12. Wie in Abbildung 2 dargestellt, könnten unsere SPR-basierter Assay Translokation PTS1 im Cytosol berauscht CHO-Zellen zu erkennen. Es wurde kein Signal aus dem Cytosol von unintoxicated Zellen, die die anti-PTS1 Antikörper nicht mit einer Komponente des Host-Cytosol Kreuzreaktion bestätigt generiert. Diecytosolische Fraktion aus Zellen berauscht in Gegenwart von Brefeldin A (BfA) auch nicht, ein positives Signal zu erzeugen. BfA verhindert Toxin Transport zum ER-Translokation Seite 6-8, 12, 20-25 und damit eine Kette Auslieferung an das Cytosol. Am Ende eines jeden Versuchs, gebunden ist Toxin vom Sensor schieben beraubt. Dies erlaubt mehrere Proben auf einem einzigen Sensor gleiten zu sehen sein und dadurch zur Verfügung gestellt direkten Vergleich zwischen den Ergebnissen mit verschiedenen experimentellen Bedingungen.
CT ist ein weiterer AB-Typ, ER-Translokation Toxin 4. In Abbildung 3A, wurde CTA1 in der cytosolischen Fraktion aus CT-behandelte HeLa-Zellen nachgewiesen. Dieser betonte, dass unsere Methodik mit mehreren Zelltypen funktioniert und kann an jeden Toxin, für die eine anti-A-Antikörper zur Verfügung angewendet werden. Es wurde kein Signal erkannt wird, wenn die cytosolische Fraktion von CT-behandelten Zellen über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTB-Antikörper (Abb. 3B) beschichtet perfundiert wurde und bewiesen damit, dass die CTA1Untereinheit, nicht aber die Zell-Bindung CTB Pentamer betritt das Cytosol. 3C zeigt das Signal vom Organell-Fraktion wird off-Skala im Vergleich zu den schwächeren Signal von der cytosolischen Fraktion. Dies stand im Einklang mit den bekannten Ineffizienz der CT Transport zum ER-Translokation Seite 6, 7, die wiederum begrenzt die Menge des Toxins, das Cytosol erreichen können. Darüber hinaus enthält der Organellen Bruchteil CT Holotoxins sowie ER-lokalisierte CTA1, so dass die resultierende SPR-Signal für die Organellen-Fraktion wird durch die zusätzliche Masse des Holotoxins-assoziierten CTB Pentamer aufgeblasen. So ist es nicht sinnvoll, Daten aus der Organellen und cytosolischen Fraktionen auf der gleichen Sensorgramm Grundstück.
Unser Test kann überwachen die zeitabhängige Akkumulation von transloziert, zytosolische Toxin (Abb. 4). Die Zellen wurden nach CT bei 4 ° C ausgesetzt, eine Temperatur, die Toxin-Bindung an die Plasmamembran ermöglicht, sondern verhindert, dass die Internalisierung der Zell-assoziierten Toxins. Nach dem removal des ungebundenen Toxin, wurden die Zellen auf 37 ° C erwärmt Beide Toxin Transport zum ER und eine Kette Translokation in das Cytosol kann bei dieser Temperatur auftreten. Kein Toxin wurde im Cytosol 15 Minuten nach dem Erwärmen auf 37 ° C festgestellt Dies spiegelt die Verzögerungszeit für (i) Holotoxins Menschenhandel zum ER erforderlich; (ii) A / B-Untereinheit Dissoziation in der Notaufnahme, und (iii) Eine Kette Export in das Zytosol. Ein kleiner Pool von zytosolischen Toxin wurde nach 30 Minuten bei 37 ° C nachgewiesen, und nach und nach größere Mengen an zytosolische Toxin wurden nach dem 45 und 60 Minuten jagen Abständen erfasst. Selbst ein höheres Maß an zytosolische Toxin wurden nach einer 5-stündigen Verfolgungsjagd Intervall 17 erfasst und bewiesen damit, eine kontinuierliche, langfristige Lieferung von Zell-assoziierten Toxins an die Host-Cytosol.
Unser Test kann auch erkennen, die Hemmung des Toxins Translokation in das Cytosol (Abb. 5). Zellen mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), ein chemisches Chaperon, dass die thermische Disord verhindert behandeltEring der isolierten CTA1 Untereinheit (T. Banerjee und K. Teter, unveröffentlichte Beobachtungen) zeigten niedrige cytosolische CTA1 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen. Entfaltung des Toxin A-Kette eine Voraussetzung für die Translokation in das Cytosol 16-18, so dass die DMSO-induzierte Stabilisierung von CTA1 entsprechend verhindert die Bewegung aus dem ER ins Zytosol.
Der Verein Geschwindigkeitskonstante (k a) von SPR Experimenten berechnet ist direkt proportional zur Konzentration des Liganden in der Perfusionspuffer 14, 15, 26. So ist es möglich, die Konzentration der cytosolischen Toxin aus einem Graphen bestimmen, dass Grundstücke der k-Werte für die Toxin-Standards als eine Funktion der Toxin-Konzentration. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die DMSO-induzierte Block des Toxins Translokation in Abbildung 5 dargestellt quantifizieren: die Standardkurve aus bekannten Konzentrationen des Toxins erzeugt wurde verwendet, um eine cytosolische CTA1 konzen berechnenion von 0,3 ng / mL für unbehandelte Zellen und 0,1 ng / mL für DMSO-behandelten Zellen (Abb. 6). Die Hemmung der CTA1 Entfaltung von DMSO so erzeugte eine 3-fache Reduktion der ER-to-Cytosol Translokation von CTA1.
Abbildung 1. Protocol Überblick. (A) Zellen werden mit dem AB-Toxin bei 4 ° C, eine Temperatur, die Toxin-Bindung an die Zelloberfläche ermöglicht, sondern verhindert Toxin Endozytose. Die A-und B-Untereinheiten des Toxins durch rote und blaue Kreise dargestellt, jeweils. (B) Unbound Toxin wird aus dem Medium entfernt und die Zellen werden auf 37 ° C erwärmt, um Endozytose und retrograden Transport des Holotoxins die ER zu fördern. Holotoxin Dissoziation erfolgt in der Notaufnahme, die den isolierten A-Kette ins Zytosol, indem sie durch ein Protein-leitenden Kanals (s) in der ER-Membran eingeben können. (C) werden die Zellen mit Digitonin behandelt, um selektiv permeabilisieren das PlasmaMembran. (D) ist die Zentrifugation zur Partitionierung der Zellen in verschiedene cytosolische und Organellen Fraktionen verwendet. Das Cytosol ist aus der Zelle durch die Digitonin-generated Poren gepresst und ist in der Überstand entfernt. Die intakte, membrangebundenen Organellen sind in der Pellet-Fraktion gefunden. (E) Um die transloziert Pool von Toxin A-Kette in den Host-Cytosol zu detektieren, wird die überstehende Fraktion über einen SPR-Sensor mit einem Anti-A-Antikörper beschichtet perfundiert.
Abbildung 2. Erkennung von PTS1 Translokation in den Host-Cytosol. CHO-Zellen wurden Puls-markierten bei 4 ° C für 30 min mit 1 ug / ml PT. Die Zellen wurden dann für 3 Stunden bei 37 ° C verfolgt in Toxin-freiem Medium enthält keine Zusätze (betrunken) oder 5 ug BfA / mL (+ BfA berauscht). Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin wurde Partition Zellextrakten in einzelne Organellen und Cytosol fracti verwendetons. Ein SPR-Sensor mit einer Anti-PTS1 Antikörper beschichtet wurde verwendet, um die cytosolische Pool von PTS1 aus unbehandelten oder BfA-behandelten Zellen zu erkennen. PTS1 Standards wurden über den Sensor als positive Kontrollen perfundiert, während die cytosolische Fraktion von unintoxicated Zellen über den Sensor schieben als negative Kontrolle perfundiert wurde. Am Ende eines jeden Versuchs, mußte Probe vom Sensor schieben beraubt.
Abbildung 3. Erkennung von CTA1 Translokation in den Host-Cytosol. HeLa-Zellen Puls-markierten bei 4 ° C mit 1 ug / ml CT wurden für 2 Stunden bei 37 ° C verfolgt in Toxin-freiem Medium enthält keine Zusätze (betrunken) oder 5 ug BfA / mL (+ BfA berauscht). Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin wurde Partition Zellextrakten in einzelne Organellen und cytosolischen Fraktionen verwendet. (A) Die cytosolische Fraktionen wurden über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet perfundiert. BekanntMengen von CTA wurden als positive Kontrollen verwendet, während das Cytosol von unintoxicated Zellen als negative Kontrolle verwendet wurde. (B) Die cytosolische Fraktion aus Zellen berauscht in der Abwesenheit von BfA wurde über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTB Antikörper beschichtet perfundiert. Ein gereinigter CTB Pentamer wurde über die Folie als eine positive Kontrolle perfundiert. (C) Die Organellen-Fraktion wurde mit solubilisierten 1% Triton X-100 vor Perfusion über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet. Zum Zwecke der Vergleichbarkeit wurden die cytosolische Fraktion (1 ml Endvolumen) aus dem gleichen Zellextrakt und ein CTA-Standard auch über den Sensor durchströmt. Für alle Platten, mußte Probe aus dem Sensor am Ende eines jeden Laufs beraubt.
Abbildung 4. Kinetik der CTA1 Eintrag in das Zytosol. HeLa-Zellen Puls-markierten bei 4 ° C mit 1 ug / ml CT wurden für 15, 30, 45 gejagt, oder 60 min bei 37 ° C in giftfrei mediuMeter Zum Nachweis der Translokation Pool des Toxins wurden zytosolischen Fraktionen aus Digitonin-permeabilisierten Zellen über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet perfundiert. CTA-Standards wurden über den Sensor durchströmt als auch. Am Ende eines jeden Versuchs, mußte Probe vom Sensor schieben beraubt.
Abbildung 5. Hemmung der CTA1 Translokation von DMSO. HeLa-Zellen Puls-markierten bei 4 ° C mit 1 ug / ml CT wurden für 2 Stunden bei 37 ° C verfolgt in Toxin-freiem Medium enthält keine Zusätze (betrunken) oder 10% DMSO (+ DMSO berauscht). Zum Nachweis der Translokation Pool des Toxins wurden zytosolischen Fraktionen aus Digitonin-permeabilisierten Zellen über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet perfundiert. CTA-Standards (100, 10, 1 und 0,1 ng / ml) wurden über den Sensor als positive Kontrollen perfundiert, nur die 1 und 0,1 ng / mL Standards sind für die Skalierung Zwecke gezeigt. Das Cytosol aus unintoxicated-Zellen wurde als negative Kontrolle verwendet. Am Ende eines jeden Versuchs, mußte Probe vom Sensor schieben beraubt.
Abbildung 6. Berechnung der zytosolischen CTA1. K-Werten für die CTA-Standards aus Abbildung 5 wurden als Funktion des Toxins Konzentration aufgetragen. Die daraus resultierende Standardkurve wurde verwendet, um festzustellen, basierend auf den k-Werten der experimentellen Proben aus Abbildung 5, die Konzentration der zytosolischen CTA1 in unbehandelten und DMSO-behandelten Zellen. Toxin-Standards sind als ausgefüllte Kreise dargestellt; der unbehandelten Cytosol ist als offenes Quadrat dargestellt, und die DMSO-behandelten Cytosol ist als offener Kreis vorgestellt. Die Mittelwerte ± reicht von zwei unabhängigen Experimenten gezeigt.
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Discussion
Vergleich zu bestehenden Methoden
Unsere SPR-basierter Assay Translokation stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Methode zur Toxin Lieferung in die Host-Cytosol zu erkennen. Die Technik erfordert keine radioaktiven Markierung oder sonstige Änderungen, um das Toxin, und es kann auf jeden Toxin, für die eine anti-Toxin A-Antikörper zur Verfügung angewendet werden. Bestehende Methoden zur Toxin Passage in das Zytosol Monitor beruhen auch auf eine subzelluläre Fraktionierung Protokoll zu partitionieren Zellextrakten in separate Cytosol-und Membranfraktionen 11, 23, 27, 28. Diese Methoden verwenden Western-Blot-oder radioaktive Marker, um die cytosolische Pool von Toxin zu erkennen. Der erste Ansatz ist semi-quantitative am besten und leidet an relativ geringe Empfindlichkeit. Auch Radiomarkierung Protokolle kann Wochen dauern, um ein Ergebnis zu erzeugen, wegen der niedrigen Toxin, das Cytosol erreichen. Während die quantitative Analyse mit einer radioaktiv markierten Toxin kann bestimmen, der relative Anteilvon Zell-assoziierten Toxin, das Cytosol eintritt, kann dieser Ansatz nicht direkt bestimmen die genaue Anzahl der zytosolischen Toxin-Moleküle. Vergleicht man die Empfindlichkeit des SPR-Toxin-Erkennung, um die Detektion von radioaktiv markiertem Toxin ist deshalb problematisch, da die Menge der cytosolischen Toxin von SPR, aber nicht durch radioaktive Markierung kann berechnet werden.
Andere Translokation Assays Bypass den vorgelagerten Toxin Menschenhandel Schritte und den gewünschten Toxin A-Kette direkt an die ER entweder Plasmid-basierte Expressionssysteme oder in vitro Transkription / Translation-Systeme 29-38. Für beide Methoden, Ziele für eine Amino-terminalen Signalsequenz der A-Kette für cotranslationale Import in das ER-Lumen. Export der synthetisierten Eine Kette aus dem ER wird dann durch subzelluläre Fraktionierung, differentielle Zentrifugation, Aktivität des Toxins in das Zytosol, proteasomalen Abbau der transloziert Toxin und / oder eine cytosolische-spezifische Toxin Modifikation erkannt. Subsets dieser Ansätze fürKunden ausschließlich auf die Translokation Fall kann für die in vitro Rekonstitution Experimente genutzt werden, und produzieren erhöhte Toxin für die Detektion und Co-Immunopräzipitation Studien. Allerdings können die Methoden nicht bestimmen, die Kinetik oder die Effizienz des Toxins Lieferung von der Zelloberfläche ins Zytosol. Es ist auch möglich, dass die Translokation Eine Kette nicht in die ER in der gleichen Konformation wie die Holotoxins-gelieferten A-Kette. Andere Aspekte der Wirt-Toxin-Wechselwirkungen sind von diesen Verfahren, wie die A / B Dissoziation Event fehlen. So gibt es sowohl Stärken und Schwächen der Überwachung Translokation mit A-Ketten, die direkt in die ER synthetisiert.
Toxin Translokation ist häufig durch Intoxikation Assays erkannt werden. Die zytotoxische oder zytopathischen Effekt von exogen applizierten Toxin erzeugt demonstriert das Toxin A-Kette ihren zytosolischen Ziel erreicht hat. Offensichtlich ist dies ein indirektes Maß für die Translokation, dass Toxin A-Monitorenctivity im Cytosol statt der physischen Präsenz der zytosolischen Toxin. So kann die Technik weder quantifizieren das Niveau der zytosolischen Toxin noch direkt erkennen veränderten Verarbeitung der transloziert Toxin. Es gibt auch Szenarien, in denen eine direkte Korrelation zwischen cytosolischen Toxingehalt und Aktivität des Toxins, die nicht existieren, wie die mögliche Notwendigkeit einer Schwellenkonzentration von zytosolischen Toxins an eine zelluläre Antwort oder wenn Toxin Aktivität erzeugt einen gesättigten zelluläre Reaktion zu entlocken. Dennoch kann Rausch-Assays eine funktionelle Korrelation zu Assays, die direkt dokumentieren die Translokation Veranstaltung. Wir haben bereits diese Strategie verwendet, um eine Hemmung der A-Kette Translokation entspricht einer Hemmung der zellulären Rausch 17-19 demonstrieren.
Zusammenfassend gibt es mehrere Methoden, um Toxin Lieferung an das Cytosol zu erkennen. Unsere SPR-basierter Ansatz hat den Vorteil, dass schnell, empfindlich und quantitative Ergebnisse. Die data kann auch mit Experimenten unter Verwendung einer der vorgenannten älteren Strategien, um eine stärkere Abschluss generieren ergänzt werden.
Zukünftige Anwendungen
Unser Label-freie Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von zytosolischen Toxin bietet Forschern die Flexibilität, viele offene Fragen in Bezug auf die Zellbiologie des Rausches Adresse. Zum Beispiel ist es möglich, die Effizienz der A-Kette Auslieferung an das Cytosol zu etablieren, indem der Berechnung des Oberflächen-gebundenen Toxin, das Zytosol erreicht. Es ist auch möglich, den Gesamtbetrag der zytosolischen Toxin zu quantifizieren und durch Erweiterung der Anzahl der zytosolischen Toxin-Moleküle pro Zelle. Es wird angenommen, dass ein Molekül cytosolische Diphtherietoxin ausreichend, um eine komplette zytopathischen / zytotoxische Wirkung 39 zu entlocken ist, kann dieses Modell jetzt mit anderen Toxinen mit unserem Translokation Assay und korrelative Rausch-Assays getestet werden. So, unsere SPR-basierter Assay should in der Lage sein zu bestimmen, wie viele Moleküle der cytosolischen Toxin für den produktiven Rausch erforderlich. Unsere Technik kann auch verfolgen, die Persistenz von zytosolischen Toxin. Deutliche Verschlechterung der transloziert Eine Kette einschränken würde und möglicherweise reduzieren ihre zytosolische Konzentration über die Zeit, was die Auswirkungen der Vergiftung haben könnte umgekehrt werden, wenn eine Kette Zugang zum Cytosol nach der ersten Toxin Exposition beschränkt war. Darüber hinaus kann das extrazelluläre Medium und Membran-Pellet aus berauscht Zellen verwendet werden, um die Menge der abgesonderten Gift oder Toxin mit Wohnsitz in den Endomembransystem, bzw. zu verfolgen. Vergleichende Untersuchungen der extrazellulären, Endomembransystem-lokalisiert und zytosolische Toxin kann verwendet werden, um zu prüfen, wie die Zellbiologie des Rausches für die verschiedenen ER-Translokation Toxine variiert werden. Unser Test kann auch verwendet werden, um das Toxin-spezifische zelluläre Faktoren für die Translokation 19 erforderlich sezieren werden. Es sollte möglich sein, unsere Methodik anpassen zu verfolgenEndosom-to-Cytosol-Translokation anderer AB Toxine wie Anthrax Letalfaktor und Diphtherie-Toxin. Schließlich könnte das Eindringen des Virus in die Wirtszelle Cytosol möglicherweise mit einem ähnlichen experimentellen Verfahren überwacht werden.
Einschränkungen
Bedingungen, die Toxin-Handel hemmen die ER wird auch verhindert, Toxin Lieferung an das Cytosol. Dies wurde durch das Fehlen von zytosolischen Toxin in BfA-behandelten Zellen (Abb. 2, 3A) nachgewiesen. So sind zusätzliche Kontrolle Experimente erforderlich, wenn mit dieser Methode, um potenzielle Bausteine des Toxins Translokation zu untersuchen. Für einige AB Toxine, Reduktion einer Disulfidbrücke, die Anbindehaltung der katalytischen Untereinheit seiner Holotoxins in die ER 6, 40-43 auftritt. Die Redox-Status der A-Kette kann somit als ein Maß für die Toxin-Transport zum ER 16, 18 verwendet werden. Rekombinante Giftstoffe enthalten, die Konsensus-Sequenz für N-Glykosylierung ist eine Modifikation, die in der Notaufnahme eingeleitet wird, wurden ebenfallsverwendet werden, um Toxin Einstieg in die ER 12, 23, 44-46 zu erkennen. Schließlich, wie oben, alternative Protokolle, die ko-translationale Insertion des Toxins A-Kette in das ER-Lumen eine hemmende Wirkung auf die Translokation überprüfen können, diskutiert. So zeigte unser SPR-basierter Assay Translokation eine funktionelle Rolle für Hsp90 in CTA1 Translokation, die mit einem Plasmid-basierte System, das CTA1 Ausdruck direkt in das ER Lumen 19 bestätigt wurde.
Die A-Ketten von ER-Translokation Toxine zeigen eine starke Arginin-over-Lysin Aminosäure bias, dass die Translokation Toxins an Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau 47-50 entziehen können. Allerdings Abbau der cytosolischen Toxin noch geschieht durch eine relativ langsame, Ubiquitin-Proteasom-Mechanismus unabhängige 51, 52. Bedingungen, die proteasomalen Aktivität steigern könnte somit die Ergebnisse verzerren unserer Translokation Assay durch die Reduzierung der Pool von transloziert Toxin in der cytosolischen fraktion. Cells ausgesetzt zu einer Proteasom-Inhibitor kann verwendet werden, um diese Möglichkeit zu kontrollieren, eine Erhöhung der zytosolischen Toxin aus proteasomalen Hemmung würde bedeuten, das Toxin könnte in der Tat erreichen Cytosol wurde aber abgebaut, bevor Erkennung.
Es wird darauf hingewiesen, dass diese Überlegungen auf Teilmengen der genannten alternativen Ansätze gelten und sind nicht einzigartig für unsere Methode. Wie bereits erwähnt, ist die beste Strategie für die Charakterisierung der Translokation, eine Kombination aus gut kontrollierten Techniken verwenden.
Kritische Schritte und Trouble-Shooting
Chemische Vorbereitung ist ein wichtiger Schritt für den Test. Digitonin nicht leicht zu lösen, und es sollte frisch zubereitet werden für jedes Experiment. Ebenso sollten neue PBST für SPR-Analyse verwendet werden. Die EDC: NHS-Aktivierung Puffer sollte unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden, es wird nicht zu halten Tätigkeit, wenn nach dem Mischen der beiden Lösungen gespeichert. However, separate Aliquots von EDC und NHS kann bei -80 ° C gelagert werden und aufgetaut einmal vor dem Gebrauch. Alle Lösungen, einschließlich der Proben, sollte vor der Injektion entgast werden. Dadurch wird verhindert, Luft-induzierte Spitzen in der SPR-Signal.
Der Zelltyp, um für diesen Test verwendet werden muss auszudrücken genug Toxinrezeptoren zu einem nachweisbaren Pool von Toxin A-Kette ins Zytosol gelangen können. In einigen Fällen, wie zB die Vorbehandlung von HeLa-Zellen mit GM1 vor CT Herausforderung, zusätzliche Toxinrezeptoren an der Oberfläche der Zielzellen aufgenommen werden. Der Zelltyp ist auch anfällig für selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin. Das Protokoll beschriebenen wirksam ist mit HeLa-und CHO-Zellen, aber auch andere Zelltypen wird ein Schritt der Optimierung mittels Western-Blot-Analyse auf die saubere Trennung von Organellen und cytosolischen Fraktionen Monitor benötigen. Wir routinemäßig folgen die Verteilungen der Protein-Disulfid-Isomerase (ein lösliches Protein ER) und Hsp90 (eine cytosolische protein) für diesen Zweck 16-19. Das exklusive Aufteilung von Protein-Disulfid-Isomerase in die Pelletfraktion 16-19 auch sicher, dass die Organellen in der Membran Pellet gesammelt intakt sind. Dies ist ein entscheidender Aspekt unserer Methode, wie die ungewollte Abbruch der intrazellulären Organellen würden Fehler in das System einzuführen, durch die Freigabe Endomembransystem-restricted-Toxin in die cytosolische Fraktion. SPR-basierte Experimente können auch verwendet werden, um nachzuweisen, dass der cytosolischen Pool des Toxins resultiert aus einer Translokation und nicht von der Lyse von intrazellulären Organellen. Zum Beispiel war kein Toxin im Zytosol von BfA-behandelten Zellen (Abb. 2, 3A) oder Zellen, die Toxin für nur 15 Minuten (Abb. 4) festgestellt. Ebenso wurde die B-Untereinheit von CT nicht in die cytosolische Fraktion nach einem 2 Stunden Toxinen ausgesetzt ist (Abb. 3B) festgestellt. Unser Protokoll geführt hatte in der Permeabilisierung der inneren Membranen, würden wir einen cytosolischen Pool des Toxins für jeden der oben erkannt habengenannten Bedingungen. Gründung der richtige Protokoll für reproduzierbare, selektive Permeabilisierung der Plasmamembran ist wahrscheinlich der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Assay-Umsetzung darstellen. Weitere Optionen für Plasma Membranpermeabilisierung zur Verfügung stehen, aber wir fanden, dass Digitonin Behandlung konsistentere Ergebnisse als andere Methoden wie die Behandlung mit Streptolysin O. zur Verfügung gestellt
Die Qualität des Antikörpers wird auch die Empfindlichkeit des Tests, die mit seriellen Verdünnungen von einem Toxin-Standard hergestellt werden kann. Zum Beispiel können wir reproduzierbar erkennt nur 0,1 ng / ml entweder PTS1 oder CTA-Standard (Abb. 2-6). Die anti-A-Antikörper nicht erkennen das Toxin B-Untereinheit, und unintoxicated Zellen sollten immer als Kontrolle verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Antikörper nicht mit Proteinen in der Wirtszelle kreuzreagieren. Vorläufige Experimente müssen die Bedingungen für stripping gebunden Toxin aus den Antikörper zu optimieren, da diese unterschiedlich sein kannfür verschiedene Anti-Toxin-Antikörper.
Bei der Überwachung Toxin Translokation unter veränderten zellulären Bedingungen, sollte das Toxin-Standards und cytosolische Fraktion aus unbehandelten Kontroll-Zellen ergänzt werden, um die Bedingungen in der experimentellen Probe angepasst werden. So wurden zum Beispiel CTA-Standards und den unbehandelten cytosolische Fraktion aus Abbildung 5 mit 1% DMSO ergänzt um die endgültige Wirkstoffkonzentration in der cytosolischen Fraktion aus DMSO-behandelten Zellen übereinstimmen. Dadurch können Unterschiede in der SPR-Signale, die aus Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung der gesammelten Fraktionen ergeben. Vergleiche zwischen cytosolischen und Organellen Fraktionen würden ebenfalls die Zugabe von 1% Triton X-100, um die cytosolische Fraktion und Standards, wie dieses Waschmittel verwendet wird, um die Membran-umhüllten Toxin aus dem Organell-Fraktion für die SPR-Erkennung veröffentlichen. Erste Experimente haben gezeigt, das Vorhandensein von Cytosol ändert nichts an der SPR Reaktion auf Toxin-Standards,so ist es nicht notwendig, um das Toxin-Standards mit Cytosol von unintoxicated Zellen zu ergänzen.
Antikörper-Bindung an den Sensor gleiten nicht, wenn die EDC auftreten: NHS-Aktivierung Lösung ist alt, oder wenn der Schlitten in das Instrument mit dem goldenen Seite nach unten eingelegt. NHS-Aktivierung und damit Antikörper zu erfassen: Da der Herstellungsprozess, wird es einige Platte zu Platte Variabilität, die richtige EDC verhindern können. Wenn Antikörper-Bindung an die Folie schlecht ist, wie von einem schwach erhöhten RIU angedeutet, kann eine zweite Injektion mehrere der Antikörper auf der Platte zu hinterlegen. Die RIU ist eine beliebige Einheit, die von einem Experiment zum anderen, je nachdem, wie viel anti-Toxin-Antikörper ist auf dem Sensor hinterlegt variiert. Allerdings wird die Ein-und Ausschalten Preise konstant bleiben.
Es wird vorzugsweise ein Refraktometer mit Dual-Channel-Perfusionskammern zu verwenden, da ein Kanal für die experimentelle Probe verwendet werden kann und der andere Kanal kann für Puffer alo verwendet werdenne, um für mögliche Basisliniendrift korrigieren. Bei Verwendung eines Zweikammer-Instrument, sicherzustellen, dass die anti-Toxin-Antikörper nur an einem der beiden Kanäle aufgenommen. Die Proben werden anschließend durch beide Kanäle betrieben werden. Mit einem einzigen Kanal Instrument, beinhaltet die Vergütung für Basisliniendrift Sammlung von Puffer allein Daten aus den Antikörper-beschichteten Objektträger vor Probenaufgabe.
Vor dem Beginn einer SPR Experiment, sicherzustellen, dass die Sensor-Rutsche fest im Gerät eingestellt und alle Armaturen sind sicher. Undichtigkeiten, die sich aus diesen Fragen generieren Luft Spikes in die gesammelten Daten. Undichtigkeiten können auch durch das Fehlen der Abfallströme, die immer vorhanden sein sollten erkannt werden. Ein Probenvolumen größer als das Volumen der Probenschleife ist notwendig, um Luft Spikes als auch zu vermeiden - zum Beispiel verwenden wir 1 mL Probenvolumen mit 500 ul Injektionsschleife. Eine unangemessene Höhe von Immersionsöl auf das Prisma wird verhindert, dass die Stabilisierung der Basislinie signal. Andere Fragen im Zusammenhang mit Betrieb des SPR Instrument im Users Guide und Technical Bulletins, die durch Reichert vorgesehen gerichtet.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 AI073783 K. Teter finanziert. Wir danken Dr. Shane Massey um Hilfe bei der Entwicklung der subzellulären Fraktionierung-Protokoll und Helen Burress für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Ganglioside GM1 | Sigma-Aldrich | G7641 | |
| CTA | Sigma-Aldrich | C2398 | |
| PTS1 | List | 182 | |
| NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce, Thermo Scientific | 24500 | |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22981 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135 | |
| PBST | Medicago | 09-8903-100 | |
| Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-80747 | |
| Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 | |
| Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-57639 | |
| Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC | |
| SPR sensor slides | Reichert | 13206060 | |
| Syringe pump | Cole-Parmer | 780200C |
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