Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning av giftstoffer translokasjon i Host cytosol ved Surface Plasmon Resonance

Published: January 3, 2012 doi: 10.3791/3686

Summary

I denne rapporten beskriver vi hvordan overflaten plasmon resonans blir brukt til å påvise toksin innreise til verten cytosol. Denne svært følsom metode kan gi kvantitative data om mengden av cytosoliske toksin, og den kan brukes til en rekke giftstoffer.

Abstract

AB giftstoffer består av en enzymatisk A subenhet og en celle-bindende B-subenhet 1. Disse giftstoffer skilles ut i ekstracellulære miljøet, men de handle på mål i eukaryote cytosol. Noen AB giftstoffer reise med vesicle bærere fra cellen overflate til det endoplasmatiske retikulum (ER) før vi går i cytosol 2-4. I ER, til katalytiske En kjede spaltes fra resten av toksinet og beveger seg gjennom et protein-ledende kanal nå sitt cytosoliske mål 5. Den translocated, cytosoliske En kjede er vanskelig å oppdage fordi toksinet trafficking til ER er en svært ineffektiv prosess: De fleste internalisert toksinet er rutet til lysosomer for degradering, så bare en liten brøkdel av overflate-bundet toksinet når Golgi-apparatet og ER 6 -12.

For å overvåke toksin translokasjon fra ER til cytosol i dyrkede celler, kombinerte vi en subcellular fraksjonering protokoll med highly sensitive deteksjonsmetode av overflaten plasmon resonans (SPR) 13-15. Plasma membran av toksin-behandlede cellene er selektivt permeabilized med digitonin, slik samling av en cytosoliske brøkdel som deretter perfused over en SPR sensor belagt med en anti-toksin En kjede antistoff. Antistoff-belagte sensor kan fange opp og oppdage pg / ml mengder cytosoliske toksin. Med denne protokollen, er det mulig å følge kinetikken av toksin oppføring i cytosol og å karakterisere hemmende effekter på translokasjon hendelsen. Konsentrasjonen av cytosoliske toksinet kan også beregnes fra en standard kurve generert med kjente mengder av en kjede standarder som har blitt perfused over sensoren. Vår metode representerer en rask, følsom, og kvantitative deteksjon system som ikke krever radiolabeling eller andre modifikasjoner til målet toxin.

Protocol

1. Utarbeidelse av digitonin

  1. Legg til 500 mL av 100% etanol til en mikrosentrifuge tube og legg den i en varme blokk innstilt på 80 ° C i 10 min.
  2. Løs 2,5 mg digitonin i 250 mL av det oppvarmede etanol å produsere en 1% stamløsning av digitonin.
  3. For å generere en fungerende løsning på 0,04% digitonin, tilsett 40 mL av digitonin stamløsning til 960 mL av HCN buffer (50 mM Hepes 7,5 pH, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, og en proteasehemmer cocktail).

2. Cell rus og permeabilization

Våre translokasjon analysen kan brukes til en rekke giftstoffer og cellelinjer. Nedenfor gir vi en detaljert protokoll for påvisning av koleratoksin (CT). En oversikt over prosedyren er gitt i Figur 1.

  1. Hela cellene er seedet i 6-brønn plater som inneholder 1 ml DMEM supplert med 10% føtal bovint serum og antibiotika-antimykotiskeå oppnå 1x10 6 celler / brønn etter en natts inkubering ved 37 ° C. For å generere nok cytosoliske toxin for reproduserbare deteksjon, er tre eksemplarer brønner som kreves for hver tilstand.
  2. Etter en overnatting inkubasjon, erstatte kultur medium med 1 mL DMEM inneholder 100 ng / ml ganglioside GM1. Dette øker antallet bindingssteder for CT, som GM1 reseptoren av CT vil intercalate i plasma membran av celler utsatt for en løsning av GM1.
  3. Etter 1 time inkubasjon ved 37 ° C, fjerne GM1 inneholder medium og vaske cellene to ganger med DMEM. Deretter plasserer cellene ved 4 ° C i 30 min i 1 mL DMEM inneholder 1 mg / ml av CT.
  4. Fjern toksinproduserende inneholder medium, vaske cellene to ganger med DMEM, og inkuber cellene i 1 ml DMEM ved 37 ° C for det ønskede tidsintervallet (s).
  5. På slutten av hver jage periode, vaske cellene med PBS og inkuber hver brønn med 250 mL på 0,5 mM EDTA i PBS. La cellene sitte i 10 min ved romtemperatur og deretter fjerne dem fra seks-brønns plate av kraftig trituration med en P1000 Pipetman. Etter en vel om cellene har blitt samlet inn, kombiner den med andre og deretter tredje brønn fra samme tilstand. Cell skraper kan også brukes til å samle cellene.
  6. Plasser den kombinerte cellesuspensjonen fra de tre replikere brønnene (750 mL totale volumet) i en enkelt mikrosentrifuge tube, og spinne den i en tabletop mikrosentrifuge for 5 min ved 5000 x g. Cell pellets av omtrent tilsvarende størrelse bør innhentes for alle forhold.
  7. Kast supernatanten og resuspender cellen pellet i 100 mL av 0,04% arbeider løsning av digitonin. Plasser cellesuspensjonen på is i 10 min.
  8. Spinn digitonin-permeabilized celler på 16 000 xg i 10 min i en tabletop mikrosentrifuge. Overfør cytosol inneholder supernatanten brøk til en frisk mikrosentrifuge tube, og beholde de organeller som inneholder pellet fraksjonen.
title "> 3. Prøvepreparering

  1. Cytosol inneholder supernatant fraksjoner er fortynnet i HCN buffer til en endelig volum på 1 ml. Smak volumer på minst 1 ml er nødvendig for å sikre luft fjernes fra 500 mL prøve sløyfe før injeksjon.
  2. Organeller som inneholder pellet fraksjoner resuspendert i 1 mL HCN buffer som inneholder 1% Triton X-100. Tilsetting av vaskemiddel er nødvendig å frigjøre membran-encased pool av toksin.
  3. Toksin standarder ved konsentrasjoner på 100, 10, 1, og 0,1 ng / ml er utarbeidet i HCN buffer.
  4. Parallelle sett av cytosoliske og organelle fraksjoner er forberedt for en kontroll eksperiment for å bekrefte troskap til fraksjonering prosedyren. Fraksjoner som genereres som beskrevet i punkt 2 er resuspendert i 20 mL på 4x sample buffer (cytosoliske fraksjon) eller 120 mL av 1x sample buffer (organelle fraksjon). Tilsvarende mengder hver brøkdel løses av natrium dodecyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese og probed by Western blot analyser for å demonstrere oppdeling av et cytosolprotein i supernatanten fraksjon og en løselig, bosatt ER protein i pellet brøkdel 16-19 år.

Fire. SPR skyv forberedelse

  1. Den Reichert SR7000 SPR refraktometer brukes for SPR eksperimenter.
  2. Sett en gullbelagt glass lysbilde med en selv-montert monolayer i SPR instrument. For å aktivere sensoren lysbildet, perfuse en 1:1 (v: v) løsning på 0,4 M EDC og 0,1 M NHS over lysbilde for 10 min ved en vannmengde på 41 mL / min. Alle påfølgende perfusions vil bruke samme flow rate.
  3. For å fjerne EDC: NHS aktivering buffer, vaske plate for 5 min med PBS som inneholder 0,05% Tween 20 (PBST). Platen inneholder nå reaktive amid platformer pga uncapping av EDC: NHS løsning.
  4. Perfuse en anti-CTA antistoff over aktivert sensor lysbilde om utvanning av 1:20,000 i 20 mM natriumacetat (pH 5,5) i 15 min. En innledende fall i refraktiv idex enhet (RIU) vil bli sett på grunn av pH-endring. Dette vil bli fulgt av en økning i RIU som antistoffet er tatt til fange av amid-reaktivt platformer på sensoren lysbildet.
  5. Fjern ubundet antistoff fra sensoren lysbilde med en 5-minutters PBST vask. Den RIU signal produsert av fanget antistoffet vil platå og stabilisere, og gir en ny baseline signal.
  6. Perfuse 1 M ethanolamine (pH 8.5) over sensoren lysbilde for 5 min. Dette caps og inaktiverer eventuelle ubundet platformer igjen på sensoren lysbildet.

5. SPR analyse av prøver

  1. Å etablere en baseline lesing, perfuse PBST over antistoff-belagte sensor for 5 min.
  2. Perfuse en eksperimentell prøve eller toksin standard over sensoren for 300 sek. Fjern ligand fra buffer og perfuse PBST over sensoren for ytterligere 200 sek.
  3. Etter hvert perfusjon, er bundet toksin fjernes fra sensoren ved en 100 sek vask med PBST ved pH 5,0. Dette vil returnere signalettil sin opprinnelige grunnlinjen lesing, og gir dermed en ny prøve som skal behandles på samme sensoren.
  4. Før du legger en ny prøve, trykke på en liten mengde luft gjennom prøven løkken å utvise eventuelle gjenværende væske fra den tidligere prøven. Ved hjelp av fremgangsmåten i 05.02 til 05.04, har vi kjørt opp til 12 prøver på ett lysbilde uten betydelig tap av grunnlinjen signal.
  5. Data analyse er utført med Scrubber 2-programvaren, og Igor programvare brukes for figur forberedelse.

Seks. Representant Resultater

Pertussis toksin (PT) er en AB gift som beveger seg fra celleoverflaten til akuttmottaket før sin En kjede (PTS1) kommer inn i tre cytosol, 12. Som vist i figur 2, kunne våre SPR-baserte translokasjon analysen oppdage PTS1 i cytosol av berusede CHO celler. Ingen signal ble generert fra cytosol av unintoxicated celler, som bekreftet anti-PTS1 antistoffet ikke kryssreagerer med en komponent av verten cytosol. Detcytosoliske brøkdel fra celler beruset i nærvær av brefeldin A (BFA) også klarte å produsere et positivt signal. BFA hindrer toksinet transport til ER translokasjon området 6-8, 12, 20-25 og dermed En kjede levering til cytosol. På slutten av hvert løp er bundet toksin strippet fra sensoren lysbildet. Dette tillot flere prøver å være skjermet på en enkelt sensor lysbilde, og dermed gitt en direkte sammenligning mellom resultater oppnådd med ulike eksperimentelle forhold.

CT er en annen AB-type, ER-translocating toxin fire. I figur 3A, ble CTA1 oppdaget i cytosoliske fraksjonen fra CT-behandlede Hela celler. Dette understreket at vår metodikk virker med flere celletyper, og kan brukes på alle toksin som en anti-A kjede antistoff er tilgjengelig. Ingen signal ble oppdaget da cytosoliske fraksjonen fra CT-behandlede cellene var perfused over en SPR sensor belagt med en anti-CTB antistoff (Fig. 3B), og dermed demonstrerer at CTA1subenheten men ikke celle-bindende CTB pentamer kommer inn i cytosol. Figur 3C viser signalet fra organeller brøk utenfor skalaen i forhold til de svakere signal fra cytosoliske fraksjonen. Dette var konsistent med den kjente ineffektiviteten av CT transport til ER translokasjon nettstedet 6, 7, som igjen begrenser mengden av toksin som kan nå cytosol. Videre inneholder organeller brøkdel CT holotoxin samt ER-lokalisert CTA1, så den resulterende SPR signal for organeller brøkdel er oppblåst av den ekstra massen av holotoxin-assosiert CTB pentamer. Dermed er det ikke praktisk å plotte data fra organeller og cytosoliske fraksjoner på samme sensorgram.

Vår analyse kan overvåke den tidsavhengige akkumulering av translocated, cytosoliske toksin (fig 4). Celler ble eksponert for CT ved 4 ° C, en temperatur som gjør at toksinet binding til plasmamembranen men hindrer internalisering av cellen-assosiert toxin. Etter removal av ubundet toksin, ble cellene varmes til 37 ° C. Begge toxin transport til ER og en kjede translokasjon til cytosol kan oppstå ved denne temperaturen. Ingen toksin ble oppdaget i cytosol 15 minutter etter oppvarming til 37 ° C. Dette reflekterte etterslepet tiden som kreves for (i) holotoxin trafficking til ER, (ii) A / B-subenheten dissosiasjon på akuttmottaket, og (iii) En kjede eksport til cytosol. En mindre pool av cytosoliske toksin ble oppdaget etter 30 minutter ved 37 ° C, og gradvis større mengder cytosoliske toksin ble funnet etter 45 og 60 minutt jage intervaller. Enda større grad av cytosoliske toksin ble oppdaget etter en 5 timers jakt intervall 17, og dermed demonstrerer en kontinuerlig og langsiktig leveranse av celle-assosiert toxin til verten cytosol.

Vår analyse kan også oppdage hemming av toksin translokasjon til cytosol (fig 5). Celler behandlet med 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), en kjemisk anstand som hindrer den termiske disordering av den isolerte CTA1 subenheten (T. Banerjee og K. Teter, upubliserte observasjoner), viste lave nivåer av cytosoliske CTA1 i forhold til den ubehandlede kontrollen cellene. Unfolding av toksinet En kjede er en forutsetning for translokasjon til cytosol 16-18, så DMSO-indusert stabilisering av CTA1 tilsvarende hindret dens bevegelse fra ER til cytosol.

Foreningen hastigheten konstant (k a) beregnet fra SPR eksperimenter er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av ligand i perfusjon buffer 14, 15, 26. Dermed er det mulig å bestemme konsentrasjonen av cytosoliske toksin fra en graf som plotter k en verdier for toksin standarder som en funksjon av toksin konsentrasjon. Denne prosedyren ble brukt til å kvantifisere DMSO-indusert blokk av toksin translokasjon presentert i figur 5: standard kurve som genereres fra kjente konsentrasjoner av toksin ble brukt til å beregne en cytosoliske CTA1 concentration på 0,3 ng / ml for ubehandlet celler og 0,1 ng / ml for DMSO-behandlede celler (Fig. 6). Hemming av CTA1 unfolding av DMSO dermed genererte en 3-fold reduksjon i ER-til-cytosol translokasjon av CTA1.

Figur 1
Figur 1. Protokoll oversikt. (A) Cellene inkuberes med AB toksinet ved 4 ° C, en temperatur som gjør at toksinet binding til celleoverflaten, men hindrer toxin endocytose. A-og B-subenheter av toksin er representert med røde og blå sirkler, henholdsvis. (B) Ubundet gift er fjernet fra medium, og cellene blir varmet til 37 ° C for å fremme endocytose og retrograd transport av holotoxin til ER. Holotoxin dissosiasjon forekommer på akuttmottaket, noe som gjør den isolerte En kjede å gå inn i cytosol ved å passere gjennom et protein-ledende kanal (er) i ER membranen. (C) Cellene er behandlet med digitonin for å selektivt permeabilize plasmamembran. (D) Sentrifugering brukes til å partisjonere cellene i separate cytosoliske og organelle fraksjoner. Den cytosol er presset ut av cellen gjennom digitonin-genererte porene og ligger i supernatanten. Den intakt, membran-bundet organeller er funnet i pellet fraksjonen. (E) for å oppdage den translocated pool av toksin En kjede i verten cytosol, er supernatanten brøkdel perfused over en SPR sensor belagt med en anti-A kjede antistoff.

Figur 2
Figur 2. Påvisning av PTS1 translokasjon inn verten cytosol. CHO celler ble puls-merket ved 4 ° C i 30 min med 1 mg / ml av PT. Cellene ble deretter jaget for 3 hr ved 37 ° C i giftfrie medium som ikke inneholder noen filer (beruset) eller 5 mikrogram BFA / ml (+ BFA beruset). Permeabilization av plasma membran med digitonin ble brukt til å partisjonere celle ekstrakter i egne organeller og cytosoliske fractions. En SPR sensor belagt med en anti-PTS1 antistoff ble brukt til å detektere cytosoliske pool av PTS1 fra ubehandlet eller BFA-behandlede celler. PTS1 standarder ble perfused over sensoren som positive kontroller, mens cytosoliske fraksjonen fra unintoxicated celler var perfused over sensoren lysbildet som en negativ kontroll. På slutten av hvert løp, var bundet prøve strippet fra sensoren lysbildet.

Figur 3
Figur 3. Påvisning av CTA1 translokasjon inn verten cytosol. Hela celler puls-merket ved 4 ° C med 1 mg / ml av CT ble jaget for 2 timer ved 37 ° C i giftfrie medium som ikke inneholder noen filer (beruset) eller 5 mikrogram BFA / ml (+ BFA beruset). Permeabilization av plasma membran med digitonin ble brukt til å partisjonere celle ekstrakter i egne organeller og cytosoliske fraksjoner. (A) cytosoliske fraksjoner var perfused over en SPR sensor belagt med en anti-CTA antistoff. Kjentmengder CTA ble brukt som positive kontroller, mens cytosol fra unintoxicated celler ble brukt som en negativ kontroll. (B) Den cytosoliske fraksjonen fra celler beruset i fravær av BFA var perfused over en SPR sensor belagt med en anti-CTB antistoff. En renset CTB pentamer var perfused over lysbildet som en positiv kontroll. (C) organelle brøkdel ble solubilisert med 1% Triton X-100 før perfusjon over en SPR sensor belagt med en anti-CTA antistoff. For sammenligning var cytosoliske brøkdel (1 mL endelig volum) fra samme celle ekstrakt og en CTA standard også perfused over sensoren. For alle paneler, var bundet prøve strippet fra sensor ved slutten av hvert løp.

Figur 4
Figur 4. Kinetics of CTA1 innreise til cytosol. Hela celler puls-merket ved 4 ° C med 1 mg / ml av CT ble jaget i 15, 30, 45 eller 60 min ved 37 ° C i giftfrie medium. Å oppdage translocated pool av toksin, ble cytosoliske fraksjoner fra digitonin-permeabilized celler perfused over en SPR sensor belagt med en anti-CTA antistoff. CTA standarder ble perfused over sensoren også. På slutten av hvert løp, var bundet prøve strippet fra sensoren lysbildet.

Figur 5
Figur 5. Hemming av CTA1 translokasjon av DMSO. Hela celler puls-merket ved 4 ° C med 1 mg / ml av CT ble jaget for 2 timer ved 37 ° C i giftfrie medium som ikke inneholder noen filer (beruset) eller 10% DMSO (+ DMSO beruset). Å oppdage translocated pool av toksin, ble cytosoliske fraksjoner fra digitonin-permeabilized celler perfused over en SPR sensor belagt med en anti-CTA antistoff. CTA standarder (100, 10, 1 og 0,1 ng / ml) ble perfused over sensoren som positive kontroller, kun 1 og 0,1 ng / ml standarder er vist for skalering formål. Den cytosol fra unintoxicated celler ble brukt som en negativ kontroll. På slutten av hvert løp, var bundet prøve strippet fra sensoren lysbildet.

Figur 6
Figur 6. Beregning av cytosoliske CTA1. K en verdier for CTA standarder fra figur 5 ble plottet som en funksjon av toksin konsentrasjon. Den resulterende standardkurve ble brukt til å avgjøre, basert på k en verdier av den eksperimentelle prøver fra 5 Figur, konsentrasjonen av cytosoliske CTA1 i ubehandlet og DMSO-behandlede celler. Toksin standarder presenteres som fylte sirkler, den ubehandlet cytosol er presentert som en åpen plass, og den DMSO-behandlet cytosol er presentert som en åpen sirkel. I gjennomsnitt ± serier av to uavhengige eksperimenter er vist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenligning med eksisterende metodikk

Våre SPR-baserte translokasjon analysen representerer en rask, følsom, og kvantitative metode for å detektere toxin levering i verten cytosol. Teknikken krever ikke radiolabeling eller andre endringer av giftstoffer, og det kan brukes på alle toksin som en anti-toksin A kjede antistoff er tilgjengelig. Eksisterende metoder for å overvåke toxin passasje inn i cytosol også stole på en subcellular fraksjonering protokoll for å partisjonere celle ekstrakter i separate cytosol og membran fraksjoner 11, 23, 27, 28. Disse metodene bruker Western blot eller radiolabels å oppdage cytosoliske pool av toksin. Den tidligere tilnærming er semi-kvantitative i beste fall, og lider av relativt dårlig sensitivitet. Selv radiolabeling protokoller kan ta uker å generere et resultat, på grunn av lave nivåer av toksin som nå cytosol. Mens kvantitativ analyse med en radiomerket toksin kan bestemme den relative andelenav celle-assosiert toxin som går inn i cytosol, kan denne tilnærmingen ikke direkte fastslå nøyaktige antallet cytosoliske toksin molekyler. Sammenligning av følsomheten SPR toksin påvisning til deteksjon av radiomerket gift er derfor problematisk, ettersom mengden av cytosoliske toksin kan beregnes ved SPR, men ikke av radiolabeling.

Andre translokasjon analyser bypass oppstrøms toksinet trafficking trinn og levere toksinet En kjede direkte til akuttmottaket ved hjelp av enten plasmid-baserte uttrykk systemer eller in vitro transkripsjon / translation systemer 29-38. For enten metode, mål en amino-terminal signal sekvens A-kjeden for co-translasjonelle import inn i ER lumen. Eksport av det syntetiske A kjeden fra ER blir deretter oppdaget av subcellular fraksjonering, differensial sentrifugering, toksin aktivitet i cytosol, proteasomal nedbrytning av translocated Toxin, og / eller en cytosoliske-spesifikk toxin modifisering. Undergrupper av disse metodene forcus utelukkende på translokasjon arrangementet, kan brukes for in vitro rekonstituering eksperimenter, og gir forhøyede nivåer av toksin for deteksjon og co-immunoprecipitation studier. Imidlertid kan de metoder som ikke bestemme kinetikken eller effektivitet av toksin levering fra celleoverflaten til cytosol. Det er også mulig at translocated En kjede ikke gå inn på akuttmottaket i samme conformational stat som holotoxin levert En kjede. Andre aspekter av host-toksin interaksjoner mangler fra disse prosedyrene, slik som A / B dissosiasjon event. Dermed er det både styrker og svakheter til overvåking translokasjon med A kjeder som er syntetisert direkte i ER.

Toksin translokasjon er ofte oppdages gjennom beruselse analyser. Den cytotoksiske eller cytopathic effekt generert av eksogent anvendt toksinet demonstrerer toksinet En kjede har nådd sitt cytosoliske mål. Dette er selvsagt et indirekte mål på translokasjon som overvåker toksinet enctivity i cytosol i stedet for den fysiske tilstedeværelsen av cytosoliske toksin. Dermed kan teknikken verken kvantifisere nivåene av cytosoliske toksin eller direkte oppdage endret behandling av translocated toxin. Det finnes også scenarier der en direkte sammenheng mellom cytosoliske giftnivået og toksinet aktivitet ikke eksisterer, slik som mulig behovet for en terskel konsentrasjon av cytosoliske toksin å lokke fram en cellulær respons eller når toksin aktivitet produserer en mettet cellulær respons. Likevel kan forgiftning analysene gi en funksjonell sammenheng med analyser som direkte dokumenterer translokasjon hendelsen. Vi har tidligere brukt denne strategien for å demonstrere en hemming av en kjede translokasjon tilsvarer en hemming av cellulære forgiftning 17-19.

I sammendraget, det er flere metoder for å påvise toksin levering til cytosol. Våre SPR-basert tilnærming har fordeler av å gi rask, følsom, og kvantitative resultater. DATA kan også suppleres med eksperimenter ved hjelp av en av de nevnte eldre strategier for å skape en sterkere konklusjon.

Fremtidige anvendelser

Våre label-fri metode for påvisning og kvantifisering av cytosoliske toksin gir etterforskere med den fleksibiliteten som løser mange utestående spørsmål om cellebiologi av beruselse. For eksempel er det mulig å etablere effektiviteten av en kjede levering til cytosol ved å beregne hvor stor prosentandel av overflate-bundet toksinet som når cytosol. Det er også mulig å kvantifisere den totale mengden cytosoliske toksiner og forlengelsen av dette, antall cytosoliske toksin molekyler per celle. Det antas at ett molekyl av cytosoliske difteri toxin er tilstrekkelig til å lokke fram en komplett cytopathic / cytotoksiske effekt 39; denne modellen kan nå testes med andre giftstoffer bruke vår translokasjon analysen og correlative beruselse analyser. Dermed våre SPR-baserte analysen Should kunne bestemme hvor mange molekyler av cytosoliske toksin er nødvendig for produktiv rus. Vår teknikk kan også spore den utholdenhet av cytosoliske toksin. Betydelige nedbrytning av translocated En kjede ville begrense og muligens redusere sin cytosoliske konsentrasjon over tid, noe som ville innebære effekten av forgiftning kan bli reversert hvis En kjede tilgang til cytosol var begrenset etter den første toxin eksponering. Videre kan det ekstracellulære mediet og membran pellet fra beruset celler brukes til å spore den mengde utskilles toksiner eller giftstoff som er bosatt i endomembrane systemet, henholdsvis. Sammenlignende studier av ekstracellulære, endomembrane-lokalisert, og cytosoliske toksinet kan brukes til å undersøke hvordan cellebiologi av beruselse varierer for ulike ER-translocating giftstoffer. Vår analyse kan også brukes til å dissekere toksinet-spesifikke cellulære faktorer som kreves for translokasjon arrangementet 19. Det bør være mulig å tilpasse våre metoder for å sporeendosome til cytosol translokasjon av andre AB giftstoffer som miltbrann dødelig faktor og difteri toxin. Endelig kunne viral inntreden i verten cytosol muligens bli overvåket med en lignende eksperimentell prosedyre.

Begrensninger

Forhold som hemmer toksinet trafficking til akuttmottaket vil også hindre toksinet levering til cytosol. Dette ble demonstrert av fraværet av cytosoliske toksin i BFA-behandlede celler (figur 2, 3A). Dermed er ekstra kontroll eksperimenter nødvendig når du bruker denne metoden til å undersøke mulige blokker av toksin translokasjon. For noen AB giftstoffer, reduksjon av en disulfide bånd som platformer den katalytiske subenheten til holotoxin sin forekommer i de 6 ER, 40-43. Den redox status i A-kjeden kan derfor brukes som et mål av toksin transport til de 16 ER, 18 år. Rekombinant giftstoffer inneholder konsensus sekvens for N-linked glykosylering, en modifikasjon som er initiert på akuttmottaket, har også blittbrukes til å oppdage toxin inntreden i de 12 ER, 23, 44-46. Til slutt, som omtalt ovenfor, alternative protokoller som involverer co-translasjonelle innsetting av toksin A-kjeden inn i ER lumen kan bekrefte en hemmende effekt på translokasjon hendelsen. For eksempel demonstrerte vår SPR-baserte translokasjon analysen en funksjonell rolle for Hsp90 i CTA1 translokasjon som ble bekreftet med et plasmid-basert system som uttrykte CTA1 direkte i ER lumen 19.

A kjeder av ER-translocating giftstoffer viser en sterk arginin-over-lysin aminosyre bias som gjør at translocated toksinet å unngå ubiquitin-avhengige proteasomal nedbrytning 47-50. Imidlertid skjer nedbrytning av cytosoliske toksiner fortsatt av en relativt langsom, ubiquitin-uavhengig proteasomal mekanisme 51, 52. Forhold som øker proteasomal aktivitet kan dermed forskyve resultatene av våre translokasjon assay ved å redusere pool av translocated gift i cytosoliske FRADette skjer. Celler utsatt for en proteasome hemmer kan brukes til å kontrollere for denne muligheten, en økning i cytosoliske toksin følge av proteasomal hemming ville indikere toksinet kan faktisk komme til cytosol, men ble degradert før deteksjon.

Det bør bemerkes at disse hensynene gjelder undergrupper av de nevnte alternative tilnærminger og er ikke unikt for vår metode. Som nevnt tidligere, er den beste strategien for å karakterisere translokasjon arrangementet å bruke en kombinasjon av godt kontrollerte teknikker.

Kritiske trinn og feilsøking

Kjemisk forberedelse er et kritisk punkt for analysen. Digitonin opphever ikke lett, og det bør være forberedt ferskt for hvert eksperiment. Likeledes bør friske PBST brukes for SPR analyse. EDC: NHS aktivering buffer bør tilberedes umiddelbart før bruk, det vil ikke beholde aktiviteten hvis lagret etter blande to løsninger. However, separate alikvoter av EDC og NHS kan oppbevares ved -80 ° C og tint en gang før bruk. Alle løsninger, inkludert prøvene, bør de-gasset før injeksjon. Dette vil forhindre air-indusert toppene i SPR signal.

Cellen som skal brukes for denne analysen må uttrykke nok toksin reseptorer for å tillate en påviselig pool av toksin En kjede å nå cytosol. I noen tilfeller, slik som forbehandling av Hela celler med GM1 før CT utfordring, kan flere toksin reseptorer legges til overflaten i målcellene. Cellen typen må også være utsatt for selektiv permeabilization av plasma membran med digitonin. Protokollen er beskrevet her er effektiv med Hela og CHO-celler, men andre celletyper vil kreve en optimalisering steg med Western blot analyser for å overvåke den rene separasjon av organeller og cytosoliske fraksjoner. Vi rutinemessig følger distribusjoner av protein disulfide isomerase (et løselig ER protein) og Hsp90 (a cytosoliske Protei) for dette formålet 16-19 år. Den eksklusive partisjonering av protein disulfide isomerase inn i pelleten brøkdel 16-19 sikrer også at organeller samlet i membranen pellet er intakte. Dette er en viktig del av vår metode, som utilsiktet brudd på intracellulære organeller ville introdusere feil i systemet ved å slippe endomembrane-restricted toksinet inn i cytosoliske fraksjonen. SPR-baserte eksperimenter kan også brukes til å demonstrere at cytosoliske pool av toksin resultater fra en translokasjon event snarere enn fra lysis av intracellulære organeller. For eksempel ble ingen toksiner påvist i cytosol av BFA-behandlede celler (2 figur, 3A) eller celler eksponert for giftstoffer for bare 15 minutter (fig 4). Likeledes ble det B-subenheten av CT ikke oppdaget i cytosoliske brøkdel etter en to timers toksin eksponering (Fig. 3B). Hadde vår protokoll resulterte i permeabilization av interne membraner, ville vi ha oppdaget en cytosoliske pool av toksin for hver av de tidligerenevnte forhold. Etablering riktig protokoll for reproduserbar, selektiv permeabilization av plasma membranen er sannsynlig å representere hastighetsbegrensende trinn for analysen gjennomføring. Andre alternativer for plasma membran permeabilization er tilgjengelig, men vi fant ut at digitonin behandlingen gitt mer konsistente resultater enn andre metoder som for eksempel behandling med streptolysin O.

Kvaliteten av antistoff vil også bestemme sensitiviteten av analysen, som kan etableres med serielle fortynninger av et giftstoff standard. For eksempel kan vi reproduserbart oppdage så lite som 0,1 ng / ml av enten PTS1 eller CTA standard (figur 2-6). Den anti-A kjede antistoff bør ikke anerkjenne toksinet B-subenhet, og unintoxicated celler bør alltid brukes som en kontroll for å sikre at antistoffet ikke kryssreagerer med proteiner i vertscellen. Foreløpige eksperimenter vil trenge for å optimalisere forholdene for stripping bundet toksin fra antistoff, da dette kan varierefor ulike anti-toxin antistoffer.

Når overvåking toxin translokasjon henhold til endrede cellulære forhold, bør toksinet standarder og cytosoliske brøkdel av ubehandlet kontroll celler suppleres å matche betingelsene i den eksperimentelle prøven. For eksempel ble CTA standarder og ubehandlet cytosoliske fraksjonen fra figur 5 supplert med 1% DMSO å matche den endelige legemiddelkonsentrasjonen i cytosoliske fraksjonen fra DMSO-behandlede celler. Dette eliminerer mulige forskjeller i SPR signaler som kan oppstå fra forskjeller i den kjemiske sammensetningen av de innsamlede fraksjoner. Sammenligninger mellom cytosoliske og organelle fraksjoner ville også kreve tillegg av 1% Triton X-100 til cytosoliske brøkdel og standarder, da dette vaskemiddel brukes til å slippe membran-encased toksin fra organeller brøkdel for SPR deteksjon. Innledende forsøk har vist tilstedeværelse av cytosol endrer ikke SPR respons på toksin standarder,så det er ikke nødvendig å supplere toksinet standarder med cytosol fra unintoxicated celler.

Antistoff binding til sensoren skyve vil ikke skje hvis EDC: NHS aktivering løsningen er gammel eller hvis lysbildet er satt inn i instrumentet med gullet vendt ned. Gitt produksjonsprosessen, vil det være noen plate til plate variabilitet som kan forhindre at EDC: NHS aktivering og dermed antistoff fange. Dersom antistoff binding til raset er dårlig, som indikert av et svakt forhøyet RIU, kan en andre injeksjon depositum mer av antistoffet på tallerkenen. Den RIU er en vilkårlig enhet som varierer fra ett eksperiment til et annet avhengig av hvor mye anti-toxin antistoff avsettes på sensoren. Vil imidlertid av og på prisene holdes konstant.

Det er å foretrekke å bruke et refraktometer med tokanals perfusjon kamre, som en kanal kan brukes til eksperimentelle prøve og den andre kanalen kan brukes til buffer Alone for å korrigere for mulige baseline drift. Når du bruker en dobbel kammer instrument, sørge for at anti-toksinet antistoff er bare lagt til en av de to kanalene. Prøvene vil senere bli kjørt gjennom begge kanaler. Med et enkelt kanal instrument, innebærer kompensasjon for baseline drift innsamling av buffer alene data fra antistoff-belagte skyv før prøve injeksjon.

Før starten på en SPR eksperiment, sikre sensoren lysbildet er satt stramt i instrumentet og alle beslag er sikre. Lekkasjer følge av disse problemene vil generere luft toppene i de innsamlede dataene. Lekkasjer kan også påvises ved fravær av avfall flow, som alltid bør være til stede. Et prøvevolum større enn volumet av injeksjonen Loop er nødvendig for å unngå luft pigger også - for eksempel bruker vi 1 ml prøve volumer med en 500 mL injeksjon loop. En upassende mengde nedsenking olje på prismet vil hindre stabilisering av grunnlinjen Signal. Andre spørsmål knyttet til drift av SPR instrumentet blir tatt opp i Users Guide og teknisk Bulletiner levert av Reichert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R01 AI073783 til K. Teter. Vi takker Dr. Shane Massey for bistand i utviklingen av subcellular fraksjonering protokollen og Helen Burress for kritisk lesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin Sigma-Aldrich D141
Ethanol Acros Organics 61509-0010
DMEM Invitrogen 11995065
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Ganglioside GM1 Sigma-Aldrich G7641
CTA Sigma-Aldrich C2398
PTS1 List 182
NHS (N-Hydroxysuccinimide) Pierce, Thermo Scientific 24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) Thermo Fisher Scientific, Inc. 22981
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135
PBST Medicago 09-8903-100
Anti-CTA antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-80747
Anti-CTB antibody Calbiochem 227040
Anti-PTS1 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-57639
Refractometer Reichert SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides Reichert 13206060
Syringe pump Cole-Parmer 780200C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
  2. Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
  3. Carbonetti, N. H. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol. 5, 455-469 (2010).
  4. Wernick, N. L. B., Chinnapen, D. J. -F., Cho, J. A., Lencer, W. I. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins. 2, 310-325 (2010).
  5. Lord, J. M., Roberts, L. M., Lencer, W. I. Entry of protein toxins into mammalian cells by crossing the endoplasmic reticulum membrane: co-opting basic mechanisms of endoplasmic reticulum-associated degradation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 300, 149-168 (2005).
  6. Lencer, W. I. Entry of cholera toxin into polarized human intestinal epithelial cells. Identification of an early brefeldin A sensitive event required for A1-peptide generation. J. Clin. Invest. 92, 2941-2951 (1993).
  7. Orlandi, P. A., Curran, P. K., Fishman, P. H. Brefeldin A blocks the response of cultured cells to cholera toxin. Implications for intracellular trafficking in toxin action. J. Biol. Chem. 268, 12010-12016 (1993).
  8. Sandvig, K., Prydz, K., Hansen, S. H., van Deurs, B. Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. J. Cell. Biol. 115, 971-981 (1991).
  9. Sandvig, K., Prydz, K., Ryd, M., van Deurs, B. Endocytosis and intracellular transport of the glycolipid-binding ligand Shiga toxin in polarized MDCK cells. J. Cell Biol. 113, 553-562 (1991).
  10. van Deurs, B. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 106, 253-267 (1988).
  11. Tam, P. J., Lingwood, C. A. Membrane cytosolic translocation of verotoxin A1 subunit in target cells. Microbiology. 153, 2700-2710 (2007).
  12. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cell. Microbiol. 10, 1130-1139 (2008).
  13. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  14. Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
  15. Medaglia, M. V., Fisher, R. J. Protein-Protein Interactions. Golemis, E. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 255-272 (2002).
  16. Banerjee, T. Contribution of subdomain structure to the thermal stability of the cholera toxin A1 subunit. Biochemistry. 49, 8839-8846 (2010).
  17. Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. J. Mol. Biol. 393, 1083-1096 (2009).
  18. Taylor, M. A therapeutic chemical chaperone inhibits cholera intoxication and unfolding/translocation of the cholera toxin A1 subunit. PLoS ONE. 6, e18825-e18825 (2011).
  19. Taylor, M. Hsp90 is required for transfer of the cholera toxin A1 subunit from the endoplasmic reticulum to the cytosol. J. Biol. Chem. 285, 31261-31267 (2010).
  20. Donta, S. T., Beristain, S., Tomicic, T. K. Inhibition of heat-labile cholera and Escherichia coli enterotoxins by brefeldin A. Infect. Immun. 61, 3282-3286 (1993).
  21. Donta, S. T., Tomicic, T. K., Donohue-Rolfe, A. Inhibition of Shiga-like toxins by brefeldin. A. J. Infect. Dis. 171, 721-724 (1995).
  22. Nambiar, M. P., Oda, T., Chen, C., Kuwazuru, Y., Wu, H. C. Involvement of the Golgi region in the intracellular trafficking of cholera toxin. J. Cell. Physiol. 154, 222-228 (1993).
  23. Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3783-3788 (1997).
  24. Xu, Y., Barbieri, J. T. Pertussis toxin-mediated ADP-ribosylation of target proteins in Chinese hamster ovary cells involves a vesicle trafficking mechanism. Infect. Immun. 63, 825-832 (1995).
  25. Yoshida, T., Chen, C. C., Zhang, M. S., Wu, H. C. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricin, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp. Cell Res. 192, 389-395 (1991).
  26. Godber, B. Direct quantification of analyte concentration by resonant acoustic profiling. Clin. Chem. 51, 1962-1972 (2005).
  27. Bernardi, K. M., Forster, M. L., Lencer, W. I., Tsai, B. Derlin-1 facilitates the retro-translocation of cholera toxin. Mol. Biol. Cell. 19, 877-884 (2008).
  28. Wernick, N. L., De Luca, H., Kam, W. R., Lencer, W. I. N-terminal Extension of the Cholera Toxin A1-chain Causes Rapid Degradation after Retrotranslocation from Endoplasmic Reticulum to Cytosol. J. Biol. Chem. 285, 6145-6152 (2010).
  29. Simpson, J. C. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS. Lett. 459, 80-84 (1999).
  30. Veithen, A., Raze, D., Locht, C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int. J. Med. Microbiol. 290, 409-413 (2000).
  31. Castro, M. G., McNamara, U., Carbonetti, N. H. Expression, activity and cytotoxicity of pertussis toxin S1 subunit in transfected mammalian cells. Cell. Microbiol. 3, 45-54 (2001).
  32. Schmitz, A., Herrgen, H., Winkeler, A., Herzog, V. Cholera toxin is exported from microsomes by the Sec61p complex. J. Cell Biol. 148, 1203-1212 (2000).
  33. Teter, K., Allyn, R. L., Jobling, M. G., Holmes, R. K. Transfer of the cholera toxin A1 polypeptide from the endoplasmic reticulum to the cytosol is a rapid process facilitated by the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Infect. Immun. 70, 6166-6171 (2002).
  34. Winkeler, A., Godderz, D., Herzog, V., Schmitz, A. BiP-dependent export of cholera toxin from endoplasmic reticulum-derived microsomes. FEBS Lett. 554, 439-442 (2003).
  35. Yu, M., Haslam, D. B. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect. Immun. 73, 2524-2532 (2005).
  36. LaPointe, P., Wei, X., Gariepy, J. A role for the protease-sensitive loop region of Shiga-like toxin 1 in the retrotranslocation of its A1 domain from the endoplasmic reticulum lumen. J. Biol. Chem. 280, 23310-23318 (2005).
  37. Teter, K., Jobling, M. G., Sentz, D., Holmes, R. K. The cholera toxin A13 subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect. Immun. 74, 2259-2267 (2006).
  38. Redmann, V. Dislocation of ricin toxin a chains in human cells utilizes selective cellular factors. J. Biol. Chem. 286, 21231-21238 (2011).
  39. Yamaizumi, M., Mekada, E., Uchida, T., Okada, Y. One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell. 15, 245-250 (1978).
  40. Bellisola, G. Reductive activation of ricin and ricin A-chain immunotoxins by protein disulfide isomerase and thioredoxin reductase. Biochem. Pharmacol. 67, 1721-1731 (2004).
  41. McKee, M. L., FitzGerald, D. J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Biochemistry. 38, 16507-16513 (1999).
  42. Orlandi, P. A. Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line. J. Biol. Chem. 272, 4591-4599 (1997).
  43. Spooner, R. A. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383, 285-293 (2004).
  44. Fujinaga, Y. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol. Biol. Cell. 14, 4783-4793 (2003).
  45. Guerra, L. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway. Cell. Microbiol. 7, 921-934 (2005).
  46. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. J. Biol. Chem. 272, 19554-19561 (1997).
  47. Deeks, E. D. The low lysine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biochemistry. 41, 3405-3413 (2002).
  48. Hazes, B., Read, R. J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36, 11051-11054 (1997).
  49. Rodighiero, C., Tsai, B., Rapoport, T. A., Lencer, W. I. Role of ubiquitination in retro-translocation of cholera toxin and escape of cytosolic degradation. EMBO Rep. 3, 1222-1227 (2002).
  50. Worthington, Z. E., Carbonetti, N. H. Evading the proteasome: absence of lysine residues contributes to pertussis toxin activity by evasion of proteasome degradation. Infect. Immun. 75, 2946-2953 (2007).
  51. Pande, A. H., Moe, D., Jamnadas, M., Tatulian, S. A., Teter, K. The pertussis toxin S1 subunit is a thermally unstable protein susceptible to degradation by the 20S proteasome. Biochemistry. 45, 13734-13740 (2006).
  52. Pande, A. H. Conformational instability of the cholera toxin A1 polypeptide. J. Mol. Biol. 374, 1114-1128 (2007).

Tags

Immunologi Surface plasmon resonans AB toksin translokasjon endoplasmatiske retikulum cellekultur koleratoksin pertussis toksin
Påvisning av giftstoffer translokasjon i Host cytosol ved Surface Plasmon Resonance
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M., Banerjee, T.,More

Taylor, M., Banerjee, T., VanBennekom, N., Teter, K. Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (59), e3686, doi:10.3791/3686 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter