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Immunology and Infection

सतह plasmon अनुनाद द्वारा विष स्थानान्तरण के होस्ट cytosol में जांच

Published: January 3, 2012 doi: 10.3791/3686
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Microbiology, University of Central Florida

Summary

इस रिपोर्ट में, हम का वर्णन कैसे सतह plasmon अनुनाद मेजबान cytosol में विष प्रविष्टि का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह बेहद संवेदनशील विधि साइटोसोलिक विष की मात्रा पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करते हैं, कर सकते हैं और यह विषाक्त पदार्थों की एक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

अटल बिहारी विषाक्त पदार्थों सबयूनिट enzymatic और एक सेल बाध्यकारी बी 1 सबयूनिट से मिलकर बनता है. इन विषाक्त पदार्थों को बाह्य परिवेश में secreted रहे हैं, लेकिन वे यूकेरियोटिक cytosol के भीतर लक्ष्य पर कार्य करते हैं. पुटिका वाहक कोशिका की सतह से 2-4 cytosol में प्रवेश करने से पहले endoplasmic जालिका (ईआर) द्वारा कुछ अटल बिहारी विषाक्त पदार्थों यात्रा. ईआर में, विष और चाल के बाकी हिस्सों से एक प्रोटीन का आयोजन चैनल के माध्यम से उत्प्रेरक एक श्रृंखला dissociates अपने साइटोसोलिक 5 लक्ष्य तक पहुँचने के लिए. translocated, साइटोसोलिक एक श्रृंखला का पता लगाने के लिए के लिए मुश्किल है क्योंकि विष ईआर के लिए तस्करी के एक बेहद अक्षम प्रक्रिया है: सबसे भली भाँति विष गिरावट के लिए lysosomes कराई है, तो केवल सतह बाध्य विष का एक छोटा सा अंश Golgi उपकरण और ईआर 6 तक पहुँचता है -12.

विष ईआर से संवर्धित कोशिकाओं में cytosol स्थानान्तरण की निगरानी करने के लिए, हम highl के साथ एक subcellular fractionation प्रोटोकॉल संयुक्तy सतह plasmon (SPR) प्रतिध्वनि 13-15 के संवेदनशील पता लगाने विधि. विष का इलाज कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली चुनिंदा digitonin साथ permeabilized है, जो बाद में एक SPR एक विरोधी विष एक श्रृंखला एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर पर perfused है साइटोसोलिक अंश के संग्रह की अनुमति है. एंटीबॉडी - लेपित संवेदक पर कब्जा और साइटोसोलिक विष की स्नातकोत्तर / एमएल मात्रा का पता लगा सकते हैं. इस प्रोटोकॉल के साथ, यह संभव है cytosol में विष प्रविष्टि के कैनेटीक्स का पालन करें और स्थानान्तरण घटना पर निरोधात्मक प्रभाव विशेषताएँ है. साइटोसोलिक विष की एकाग्रता भी एक मानक है कि सेंसर के साथ perfused है एक श्रृंखला मानकों की ज्ञात मात्रा के साथ उत्पन्न वक्र से गणना की जा सकता है. हमारी विधि एक तेजी से, संवेदनशील और मात्रात्मक का पता लगाने प्रणाली है कि radiolabeling या लक्ष्य विष अन्य संशोधनों की आवश्यकता नहीं है का प्रतिनिधित्व करता है.

Protocol

1. Digitonin की तैयारी

  1. एक microcentrifuge ट्यूब 100% इथेनॉल 500 μL जोड़ें और यह एक गर्मी 80 डिग्री 10 मिनट के लिए सी सेट ब्लॉक में जगह.
  2. गर्म इथेनॉल 250 μL में digitonin के 2.5 मिलीग्राम भंग करने के लिए एक 1% digitonin का जायजा समाधान का उत्पादन.
  3. 0.04% digitonin का एक काम समाधान उत्पन्न करने के लिए, HCN बफर के 960 μL (50 मिमी Hepes पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 2 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी एन ethylmaleimide, और एक protease अवरोध करनेवाला digitonin स्टॉक समाधान की 40 μL जोड़ने कॉकटेल).

2. सेल नशा और permeabilization

हमारे स्थानान्तरण परख विषाक्त पदार्थों और सेल लाइनों की एक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. नीचे, हम हैजा विष (सीटी) का पता लगाने के के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. प्रक्रिया के एक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रदान की जाती है.

  1. HELA कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से युक्त एक एमएल DMEM प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं 10% के साथ पूरक भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक प्रतिकवकीय1x10 6 कोशिकाओं को प्राप्त करने / अच्छी तरह के बाद 37 में एक रात ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पता लगाने के लिए पर्याप्त साइटोसोलिक विष उत्पन्न करने के लिए, तीन प्रतियों कुओं प्रत्येक शर्त के लिए आवश्यक हैं.
  2. एक रात ऊष्मायन के बाद, 1 एमएल DMEM 100 एनजी / एमएल GM1 ganglioside युक्त के साथ मध्यम संस्कृति की जगह. यह सीटी के लिए बाध्यकारी साइटों की संख्या बढ़ जाती है, के रूप में सीटी की GM1 रिसेप्टर GM1 के समाधान के लिए संपर्क में कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में (अधिक दिन आदि का) सन्निवेश करना होगा.
  3. 1 37 घंटा ऊष्मायन के बाद ° सी, मध्यम GM1 युक्त निकालने और कोशिकाओं DMEM के साथ दो बार धोने. फिर, 4 कोशिकाओं जगह डिग्री सेल्सियस 1 एमएल DMEM 1 μg / सीटी के एमएल युक्त में 30 मिनट के लिए.
  4. मध्यम विष युक्त निकालें, कोशिकाओं DMEM के साथ दो बार धोने, और 37 में 1 एमएल DMEM में कोशिकाओं सेते ° सी वांछित समय अंतराल (ओं) के लिए.
  5. प्रत्येक पीछा अवधि के अंत में, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और पीबीएस में 0.5 मिमी EDTA के 250 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से सेते हैं. कोशिकाओं 10 के लिए बैठते हैं कमरे के तापमान पर मिनट और फिर एक P1000 pipetman के साथ जोरदार विचूर्णन द्वारा 6 अच्छी तरह से थाली से उन्हें हटाने. बाद कक्षों की एक अच्छी तरह से एकत्र किया गया है, यह दूसरे और अच्छी तरह से एक ही हालत से तो तीसरे के साथ गठबंधन. सेल स्क्रेपर्स भी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. एक एकल microcentrifuge ट्यूब में दोहराने तीन कुओं (750 μL कुल मात्रा), और 5 मिनट के लिए एक tabletop microcentrifuge में यह 5000 x जी पर स्पिन से संयुक्त सेल निलंबन प्लेस मोटे तौर पर बराबर आकार के सेल छर्रों सभी स्थितियों के लिए प्राप्त की जानी चाहिए.
  7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.04% digitonin के काम समाधान के 100 μL में सेल गोली resuspend. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन रखें.
  8. एक tabletop microcentrifuge में 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर digitonin - permeabilized कोशिकाओं स्पिन. एक ताजा microcentrifuge ट्यूब cytosol युक्त सतह पर तैरनेवाला अंश स्थानांतरण, और organelle युक्त गोली अंश को बनाए रखने के.
शीर्षक "तैयारी> 3 नमूना

  1. Cytosol युक्त सतह पर तैरनेवाला भिन्न HCN बफर में 1 एमएल अंतिम मात्रा को पतला कर रहे हैं. कम से कम 1 एमएल का नमूना मात्रा हवा इंजेक्शन से पहले 500 μL नमूना पाश से purged है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं.
  2. Organelle युक्त गोली भिन्न HCN% 1 Triton एक्स 100 युक्त बफर के 1 एमएल में resuspended हैं. डिटर्जेंट के अतिरिक्त विष की झिल्ली encased पूल रिहाई के लिए आवश्यक है.
  3. 100 की सांद्रता, 10, 1, और 0.1 एनजी / एमएल पर विष मानकों HCN बफर में तैयार कर रहे हैं.
  4. Fractionation प्रक्रिया की निष्ठा की पुष्टि साइटोसोलिक और organelle भिन्न के समानांतर सेट नियंत्रण के प्रयोग के लिए तैयार हैं. Fractions उत्पन्न के रूप में धारा 2 में वर्णित हैं 4x नमूना बफर (साइटोसोलिक अंश) या 1x नमूना बफर (organelle अंश) की 120 μL के 20 μL में resuspended. प्रत्येक अंश के बराबर मात्रा में सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल कर रहे हैं और ख की जांचy पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सतह पर तैरनेवाला अंश में साइटोसोलिक प्रोटीन का विभाजन और एक घुलनशील 16-19 अंश में गोली निवासी ईआर प्रोटीन को प्रदर्शित करने के लिए .

4. SPR स्लाइड तैयारी

  1. रीचर्ट SR7000 SPR Refractometer SPR प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया है.
  2. SPR साधन में एक monolayer आत्म इकट्ठे के साथ एक सोना चढ़ाया गिलास स्लाइड सेट. 41 μL / मिनट की एक प्रवाह की दर पर 10 मिनट के लिए स्लाइड पर 0.4 एम EDC और 0.1 एम एन एच एस के समाधान सेंसर स्लाइड को सक्रिय करने के लिए, एक 1:1 (v v) छिड़कना. सभी बाद perfusions एक ही प्रवाह दर का प्रयोग करेंगे.
  3. EDC हटायें: एनएचएस सक्रियण बफर करने के लिए, पीबीएस 0.05% बीच 20 (PBST) युक्त के साथ 5 मिनट के लिए थाली धो लो. एनएचएस समाधान: थाली अब प्रतिक्रियाशील एमाइड EDC द्वारा uncapping के कारण tethers शामिल है.
  4. 1:20,000 के कमजोर पड़ने पर 15 मिनट के लिए 20 मिमी सोडियम एसीटेट (5.5 पीएच) में सक्रिय सेंसर स्लाइड पर एक विरोधी CTA एंटीबॉडी छिड़कना. अपवर्तक में एक प्रारंभिक में गिरावटडेक्स इकाई (RIU) पीएच परिवर्तन की वजह से देखा जाएगा. यह RIU में वृद्धि के द्वारा पीछा किया जाएगा के रूप में एंटीबॉडी सेंसर स्लाइड पर एमाइड प्रतिक्रियाशील tethers द्वारा कब्जा कर लिया है.
  5. एक 5 मिनट PBST धोने के साथ सेंसर स्लाइड से अनबाउंड एंटीबॉडी निकालें. RIU कब्जा कर लिया एंटीबॉडी द्वारा उत्पादित संकेत पठार और स्थिर, एक नया आधारभूत संकेत प्रदान करेंगे.
  6. छिड़कना 5 मिनट के लिए सेंसर स्लाइड से अधिक 1 एम ethanolamine (8.5 पीएच). यह टोपी और किसी भी अनबाउंड सेंसर स्लाइड पर छोड़ दिया tethers inactivates.

5. SPR विश्लेषण के नमूने

  1. एक आधारभूत, 5 मिनट के लिए एंटीबॉडी लेपित सेंसर पर छिड़कना PBST पढ़ने की स्थापना करने के लिए.
  2. 300 सेकंड के लिए एक प्रयोगात्मक या सेंसर पर विष मानक नमूना छिड़कना. एक और 200 सेकंड के लिए बफर और संवेदक पर छिड़कना PBST से ligand निकालें.
  3. प्रत्येक छिड़काव के बाद, बाध्य विष सेंसर से एक 100 PBST के साथ पीएच 5.0 सेकंड धोने के द्वारा हटा दिया जाता है. यह संकेत वापसी करेंगेअपने प्रारंभिक आधारभूत पढ़ने, इस प्रकार एक और नमूना एक ही संवेदक पर संसाधित करने के लिए अनुमति.
  4. एक नया नमूना लोड हो रहा है से पहले, नमूना पाश के माध्यम से हवा की एक छोटी राशि को पुश करने के लिए पूर्व नमूना से किसी भी अवशिष्ट तरल पदार्थ को निष्कासित. 5.2-5.4 में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करना, हम 12 नमूनों को चलाने आधारभूत संकेत के पर्याप्त हानि के बिना एक स्लाइड पर.
  5. डेटा विश्लेषण रंडी 2 सॉफ्टवेयर के साथ किया है, और इगोर सॉफ्टवेयर आंकड़ा तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

6. प्रतिनिधि परिणाम

पर्टुसिस विष (पीटी) एक अटल बिहारी विष है कि कोशिका की सतह से ईआर के लिए चाल से पहले अपने एक चेन (PTS1) cytosol 3, 12 में प्रवेश करती है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, हमारे स्थानान्तरण SPR आधारित परख नशे में धुत्त चो कोशिकाओं के cytosol में PTS1 पता लगा सकता है. कोई संकेत unintoxicated कोशिकाओं, जो एंटीबॉडी विरोधी PTS1 मेजबान cytosol के एक घटक के साथ पार प्रतिक्रिया नहीं की पुष्टि की cytosol से उत्पन्न किया गया था.brefeldin एक (BFA) की उपस्थिति में नशे में धुत्त कोशिकाओं से साइटोसोलिक अंश भी करने के लिए एक सकारात्मक संकेत का उत्पादन करने में विफल रहा है. BFA ईआर स्थानान्तरण साइट 6-8, 12, 20-25, और इस प्रकार एक श्रृंखला cytosol को प्रसव के लिए विष परिवहन को रोकता है . प्रत्येक चलाने के अंत में, बाध्य विष सेंसर स्लाइड से छीन लिया है. एक एकल सेंसर स्लाइड पर यह अनुमति दी कई नमूने जांच के लिए और इस तरह विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के साथ परिणाम प्राप्त के बीच एक सीधी तुलना प्रदान की.

सीटी एक और अटल बिहारी प्रकार, ईआर translocating 4 विष ​​है . चित्रा 3A में, CTA1 सीटी इलाज HELA कोशिकाओं से साइटोसोलिक अंश में पाया गया था. यह जोर दिया कि हमारी पद्धति अनेक प्रकार की कोशिकाओं के साथ काम करता है और किसी भी विष है जिसके लिए एक विरोधी एक श्रृंखला एंटीबॉडी उपलब्ध है के लिए लागू किया जा सकता है. कोई संकेत है जब सीटी का इलाज कोशिकाओं से साइटोसोलिक अंश एक SPR एक विरोधी CTB एंटीबॉडी (3B छवि) के साथ लेपित सेंसर अधिक perfused पता चला था, इस प्रकार है कि CTA1 प्रदर्शनसबयूनिट लेकिन cytosol नहीं में प्रवेश करती है सेल बाध्यकारी CTB pentamer है. चित्रा 3C से पता चलता है organelle अंश से संकेत साइटोसोलिक अंश से कमजोर संकेत की तुलना में बंद पैमाने पर है. यह सीटी परिवहन के ज्ञात ईआर साइट स्थानान्तरण 6, 7, जो बारी में विष की राशि है कि cytosol तक पहुँच सकते हैं की सीमा के लिए अक्षमता के साथ संगत किया गया था. इसके अलावा, organelle अंश सीटी के रूप में अच्छी तरह के रूप में ईआर-स्थानीयकृत CTA1 holotoxin, तो परिणामस्वरूप SPR संकेत organelle अंश के लिए holotoxin जुड़े CTB pentamer के अतिरिक्त जन द्वारा फुलाया जाता है शामिल हैं. इस प्रकार, यह व्यावहारिक ही sensorgram पर organelle और साइटोसोलिक भिन्न डेटा प्लॉट नहीं है.

हमारी परख translocated, साइटोसोलिक विष (चित्र 4) के समय पर निर्भर संचय की निगरानी कर सकते हैं. कक्ष 4 बजे सीटी से अवगत कराया गया ° सी, एक तापमान है कि विष प्लाज्मा झिल्ली के लिए बाध्य की अनुमति देता है, लेकिन सेल जुड़े विष के internalization रोकता है. रेमो के बादअनबाउंड विष के वैल, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस को गरम किया गया दोनों विष ईआर परिवहन और एक श्रृंखला cytosol स्थानान्तरण के इस तापमान पर हो सकता है. कोई विष cytosol 15 मिनट में वार्मिंग के बाद 37 डिग्री सेल्सियस तक का पता चला था इस अंतराल (i) के holotoxin ईआर तस्करी के लिए आवश्यक समय परिलक्षित, (ii) ईआर में बी / सबयूनिट हदबंदी, और (iii) एक श्रृंखला cytosol निर्यात. साइटोसोलिक विष की एक छोटी सी पूल 37 बजे 30 मिनट के बाद पता चला था ° C, और साइटोसोलिक विष के उत्तरोत्तर बड़ी मात्रा 45 और 60 मिनट के अंतराल पीछा के बाद पाया गया. साइटोसोलिक विष की भी अधिक से अधिक स्तर 5 घंटे पीछा 17 अंतराल के बाद पाया गया है, इस प्रकार एक निरंतर, सेल जुड़े मेजबान cytosol विष की लंबी अवधि के वितरण का प्रदर्शन.

हमारी परख भी विष स्थानान्तरण के cytosol निषेध (छवि 5) का पता लगा सकते हैं. कक्ष 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO), एक रासायनिक संरक्षक है कि थर्मल disord रोकता के साथ इलाजपृथक CTA1 सबयूनिट (टी. बनर्जी और लालकृष्ण Teter, अप्रकाशित टिप्पणियों) के ering, अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में साइटोसोलिक CTA1 के निम्न स्तर का प्रदर्शन किया. विष का खुलासा एक श्रृंखला 16-18 cytosol के लिए स्थानान्तरण के लिए एक शर्त है, तो तदनुसार CTA1 के DMSO प्रेरित स्थिरीकरण ईआर से cytosol करने के लिए अपने आंदोलन को रोका.

संघ की दर लगातार कश्मीर (एक) SPR प्रयोगों से गणना सीधे छिड़काव बफर 14, 15, 26 में ligand की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है . इस प्रकार, यह एक ग्राफ से साइटोसोलिक विष की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए संभव है कि कश्मीर विष एकाग्रता के एक समारोह के रूप में विष के मानकों के लिए एक मान भूखंडों. इस प्रक्रिया के लिए विष चित्रा 5 में प्रस्तुत स्थानान्तरण के DMSO प्रेरित ब्लॉक यों इस्तेमाल किया गया था: मानक विष के ज्ञात सांद्रता से उत्पन्न वक्र एक साइटोसोलिक CTA1 concentrat की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया थाके आयन 0.3 एनजी / अनुपचारित कोशिकाओं और 0.1 DMSO इलाज किया कोशिकाओं के लिए एनजी / एमएल (छवि 6) के लिए एमएल. इस प्रकार CTA1 के DMSO के द्वारा खुलासा निषेध CTA1 के ईआर - cytosol स्थानान्तरण में 3 गुना कमी उत्पन्न.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल सिंहावलोकन. (ए) कक्ष अटल बिहारी विष के साथ 4 में incubated हैं डिग्री सेल्सियस, तापमान है कि विष कोशिका की सतह के लिए बाध्य अनुमति देता है, लेकिन विष endocytosis रोकता. विष के ए और बी सब यूनिटों लाल और नीले हलकों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, क्रमशः. (बी) अनबाउंड विष के माध्यम से हटा दिया है, और कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस के क्रम में ईआर holotoxin की endocytosis और प्रतिगामी परिवहन को बढ़ावा देने के लिए गरम कर रहे हैं. Holotoxin हदबंदी ईआर, जो पृथक एक श्रृंखला ईआर झिल्ली में प्रोटीन का आयोजन चैनल (ओं) के माध्यम से गुजर cytosol में प्रवेश करने के लिए अनुमति देता है में होता है. (सी) कक्ष digitonin के साथ व्यवहार कर रहे हैं क्रम में चुनिंदा प्लाज्मा permeabilizeझिल्ली. (डी) centrifugation अलग साइटोसोलिक और organelle भागों में कोशिकाओं के विभाजन के लिए प्रयोग किया जाता है. cytosol सेल के बाहर निचोड़ा हुआ है और digitonin - जनित pores के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला में स्थित है. बरकरार, झिल्ली ही सीमित organelles गोली अंश में पाया जाता है. (ई) के लिए विष मेजबान cytosol में एक श्रृंखला के translocated पूल का पता लगाने, सतह पर तैरनेवाला अंश एक SPR एक विरोधी एक श्रृंखला एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर अधिक perfused है.

चित्रा 2
चित्रा 2 मेजबान cytosol में PTS1 स्थानान्तरण की जांच. चो कोशिकाओं थे नाड़ी 4 में लेबल ° सी 1 μg / पीटी के एमएल के साथ 30 मिनट के लिए. कोशिकाओं तो 37 में थे 3 घंटा लिए पीछा ° सी में विष से मुक्त नहीं (नशे में धुत्त) परिवर्धन या 5 μg BFA / एमएल (नशे में धुत्त BFA +) युक्त मध्यम. Digitonin साथ प्लाज्मा झिल्ली के Permeabilization अलग organelle और साइटोसोलिक fracti में विभाजन सेल अर्क के लिए इस्तेमाल किया गया थाons है. एक SPR विरोधी PTS1 के साथ एक एंटीबॉडी लेपित सेंसर अनुपचारित या BFA इलाज कोशिकाओं से PTS1 के साइटोसोलिक पूल का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. PTS1 मानकों पर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेंसर perfused थे, जबकि unintoxicated कक्षों से साइटोसोलिक अंश एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेंसर स्लाइड पर perfused था. प्रत्येक चलाने के अंत में, बाध्य नमूना सेंसर स्लाइड से छीन लिया.

चित्रा 3
चित्रा 3 मेजबान cytosol में CTA1 स्थानान्तरण की जांच. HELA कोशिकाओं नाड़ी 4 में लेबल ° सी 1 μg / सीटी के एमएल के साथ 2 घंटा के लिए 37 पर पीछा किया गया ° सी में विष से मुक्त नहीं (नशे में धुत्त) परिवर्धन या 5 μg BFA / एमएल (नशे में धुत्त BFA +) युक्त मध्यम. Digitonin साथ प्लाज्मा झिल्ली के Permeabilization अलग organelle और साइटोसोलिक भिन्न में विभाजन सेल अर्क के लिए इस्तेमाल किया गया था. (ए) साइटोसोलिक भिन्न एक SPR एक विरोधी CTA एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर पर perfused थे. ज्ञातCTA की मात्रा सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया, जबकि unintoxicated कक्षों से cytosol एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. (बी) BFA के अभाव में नशे में धुत्त कोशिकाओं से साइटोसोलिक अंश एक SPR एक विरोधी CTB एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर पर perfused था. एक शुद्ध CTB pentamer स्लाइड पर एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में perfused था. (सी) organelle अंश के साथ solubilized किया गया था 1% ट्राइटन X-100 एक SPR एक विरोधी CTA एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर पर छिड़काव से पहले. तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए, एक ही सेल निकालने और एक CTA मानक (1 एमएल अंतिम मात्रा) से साइटोसोलिक अंश भी सेंसर से अधिक perfused थे. सभी पैनल के लिए बाध्य नमूना संवेदक से प्रत्येक चलाने के अंत में छीन लिया था.

चित्रा 4
चित्रा 4 cytosol में CTA1 प्रविष्टि के कैनेटीक्स. HELA कोशिकाओं नाड़ी 4 ° सी 1 μg / सीटी के एमएल के साथ 15, 30, 45, के लिए पीछा किया गया, या 37 पर 60 मिनट डिग्री सेल्सियस विष मुक्त mediu में लेबलमी विष के translocated पूल का पता लगाने के लिए, digitonin - permeabilized कोशिकाओं से भिन्न साइटोसोलिक एक SPR एक विरोधी CTA एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर पर perfused थे. CTA मानकों सेंसर अधिक perfused थे के रूप में अच्छी तरह से. प्रत्येक चलाने के अंत में, बाध्य नमूना सेंसर स्लाइड से छीन लिया.

चित्रा 5
चित्रा 5 DMSO के द्वारा CTA1 स्थानान्तरण का निषेध. HELA कोशिकाओं नाड़ी 4 में लेबल ° सी 1 μg / सीटी के एमएल के साथ 2 घंटा के लिए 37 पर पीछा किया गया ° सी में विष से मुक्त नहीं (नशे में धुत्त) परिवर्धन या DMSO के 10% (+ नशे में धुत्त DMSO) से युक्त मध्यम. विष के translocated पूल का पता लगाने के लिए, digitonin - permeabilized कोशिकाओं से भिन्न साइटोसोलिक एक SPR एक विरोधी CTA एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर पर perfused थे. CTA मानकों (100, 10, 1, और 0.1 एनजी / एमएल) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेंसर अधिक perfused थे, केवल 1 और 0.1 एनजी / एमएल मानकों स्केलिंग प्रयोजनों के लिए दिखाए जाते हैं. unintoxicate से cytosolघ कोशिकाओं को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रत्येक चलाने के अंत में, बाध्य नमूना सेंसर स्लाइड से छीन लिया.

चित्रा 6
6 चित्रा की गणना CTA1 साइटोसोलिक. चित्रा 5 से CTA मानकों के लिए एक मूल्यों कश्मीर विष एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते थे. परिणामस्वरूप मानक वक्र निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कश्मीर पर आधारित है, चित्रा 5, इलाज और DMSO के इलाज की कोशिकाओं में साइटोसोलिक CTA1 की एकाग्रता से प्रयोगात्मक नमूनों की एक मान . विष मानकों भरा हलकों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, अनुपचारित cytosol एक खुले वर्ग के रूप में प्रस्तुत किया है, और cytosol DMSO के इलाज एक खुला वृत्त के रूप में प्रस्तुत किया है. ± दो स्वतंत्र प्रयोगों की औसत पर्वतमाला दिखाए जाते हैं.

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Discussion

मौजूदा पद्धति के लिए तुलना करें

हमारे स्थानान्तरण SPR आधारित परख एक तेजी से, संवेदनशील और मात्रात्मक विधि मेजबान cytosol में विष प्रसव का पता लगाने का प्रतिनिधित्व करता है. तकनीक radiolabeling या विष को अन्य संशोधनों की आवश्यकता नहीं करता, और यह किसी भी विष है जो एक विरोधी विष के लिए एक श्रृंखला एंटीबॉडी उपलब्ध है के लिए लागू किया जा सकता है. Cytosol में विष बीतने पर नजर रखने के मौजूदा तरीकों को भी अलग cytosol और झिल्ली भिन्न 11, 23, 27, 28 में विभाजन सेल के अर्क से एक subcellular fractionation प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं. इन तरीकों का उपयोग करने के लिए पश्चिमी धब्बा या radiolabels विष के साइटोसोलिक पूल का पता लगाने. पूर्व दृष्टिकोण पर सबसे अच्छा अर्द्ध मात्रात्मक है और अपेक्षाकृत गरीब संवेदनशीलता से ग्रस्त है. यहां तक ​​कि radiolabeling प्रोटोकॉल सप्ताह लेने के लिए एक परिणाम के कारण उत्पन्न विष के निम्न स्तर जो cytosol तक पहुँचने के लिए कर सकते हैं,. जबकि एक radiolabeled विष के साथ मात्रात्मक विश्लेषण रिश्तेदार प्रतिशत निर्धारित कर सकते हैंसेल जुड़े विष जो cytosol में प्रवेश करती है, इस दृष्टिकोण सीधे साइटोसोलिक विष अणु की सही संख्या नहीं निर्धारित कर सकते हैं. Radiolabeled विष का पता लगाने के लिए SPR विष का पता लगाने की संवेदनशीलता तुलना इसलिए समस्याग्रस्त है, के रूप में साइटोसोलिक विष की मात्रा SPR द्वारा नहीं बल्कि radiolabeling द्वारा गणना की जा सकती है.

अन्य स्थानान्तरण assays अपस्ट्रीम विष तस्करी कदम बाईपास और विष या तो प्लाज्मिड आधारित अभिव्यक्ति सिस्टम या / प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली 29-38 में इन विट्रो का उपयोग ईआर के लिए एक श्रृंखला सीधे देने. या तो विधि के लिए, एक एमिनो टर्मिनल संकेत अनुक्रम सह translational ईआर लुमेन में आयात के लिए एक श्रृंखला लक्ष्य. संश्लेषित ईआर से एक श्रृंखला के निर्यात तो subcellular fractionation, अंतर है centrifugation, cytosol, translocated विष के proteasomal गिरावट में विष गतिविधि, और / या एक विष साइटोसोलिक विशिष्ट संशोधन से पता चला है. इन तरीकों के लिए सबसेटस्थानान्तरण घटना पर पूरी तरह ग्राहकों के लिए इन विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, और पता लगाने और सह immunoprecipitation अध्ययन के लिए विष का ऊंचा स्तर का उत्पादन. हालांकि, तरीके विष कोशिका की सतह से cytosol प्रसव के कैनेटीक्स या दक्षता नहीं निर्धारित कर सकते हैं. यह भी संभव है कि translocated एक श्रृंखला holotoxin दिया एक श्रृंखला के रूप में एक ही गठनात्मक राज्य में ईआर में प्रवेश नहीं करता है. मेजबान विष बातचीत के अन्य पहलुओं / A, B हदबंदी घटना के रूप में इन प्रक्रियाओं से लापता हैं. इस प्रकार, वहाँ एक श्रृंखला है कि सीधे ईआर में संश्लेषित कर रहे हैं के साथ दोनों शक्तियों और कमजोरियों निगरानी स्थानान्तरण करने के लिए कर रहे हैं.

विष स्थानान्तरण अक्सर नशा assays के माध्यम से पता लगाया है. साइटोटोक्सिक या कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव exogenously लागू विष द्वारा उत्पन्न विष एक श्रृंखला अपने साइटोसोलिक लक्ष्य तक पहुँच गया है दर्शाता है. जाहिर है, इस स्थानान्तरण के एक अप्रत्यक्ष उपाय है कि एक विष की निगरानीसाइटोसोलिक विष की भौतिक उपस्थिति के बजाय cytosol में ctivity. इस प्रकार, तकनीक न तो साइटोसोलिक विष के स्तर यों न ही कर सकते हैं सीधे translocated विष की बदल प्रसंस्करण का पता लगाने. वहाँ भी परिदृश्य में जो साइटोसोलिक विष स्तर और विष गतिविधि के बीच एक सीधा संबंध नहीं मौजूद है साइटोसोलिक विष की एक सीमा एकाग्रता के लिए संभव की जरूरत है जैसे, एक सेलुलर प्रतिक्रिया या जब विष गतिविधि एक संतृप्त सेलुलर प्रतिक्रिया पैदा बटोर रहे हैं. फिर भी, नशा assays assays जो सीधे स्थानान्तरण घटना दस्तावेज़ के लिए एक कार्यात्मक संबंध प्रदान कर सकते हैं. हम पहले इस रणनीति का इस्तेमाल किया है सेलुलर 17-19 नशे के निषेध से मेल खाती है एक श्रृंखला स्थानान्तरण के निषेध का प्रदर्शन.

संक्षेप में, वहाँ cytosol विष प्रसव का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं. हमारे SPR आधारित दृष्टिकोण तेजी से, संवेदनशील और मात्रात्मक परिणाम उपलब्ध कराने के लाभ है. घअता भी aforementioned बड़े रणनीतियों की एक का उपयोग करने के लिए एक मजबूत निष्कर्ष उत्पन्न प्रयोगों के साथ पूरक जा सकता है.

भविष्य अनुप्रयोगों

साइटोसोलिक विष का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए हमारी लेबल से मुक्त विधि कई बकाया नशे की कोशिका जीव विज्ञान के बारे में सवालों के पते करने के लिए लचीलेपन के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, यह सतह बाध्य विष है कि cytosol तक पहुँच के प्रतिशत की गणना के द्वारा cytosol एक श्रृंखला वितरण की दक्षता की स्थापना संभव है. यह भी संभव है साइटोसोलिक विष की कुल राशि यों और विस्तार के द्वारा, सेल प्रति साइटोसोलिक विष अणुओं की संख्या. यह माना जाता है कि साइटोसोलिक डिप्थीरिया विष से एक अणु एक पूर्ण / कोशिकाविकृति संबंधी 39 साइटोटोक्सिक प्रभाव प्रकाश में लाना करने के लिए पर्याप्त है, इस मॉडल अब हमारे स्थानान्तरण परख और correlative नशा assays का उपयोग अन्य विषाक्त पदार्थों के साथ परीक्षण किया जा सकता है. इस प्रकार, हमारे SPR आधारित परख थानेदारuld निर्धारित करने के लिए कैसे साइटोसोलिक विष के कई अणुओं उत्पादक नशे के लिए आवश्यक हैं सक्षम हो. हमारी तकनीक भी साइटोसोलिक विष के हठ को ट्रैक कर सकते हैं. Translocated एक श्रृंखला के पर्याप्त गिरावट को सीमित और संभवतः उसके साइटोसोलिक एकाग्रता कम समय के साथ, जो नशे के प्रभाव मतलब उलट हो सकता है अगर एक श्रृंखला के लिए उपयोग cytosol प्रारंभिक विष प्रदर्शन के बाद प्रतिबंधित किया गया था. इसके अलावा, बाह्य और नशे में धुत्त कोशिकाओं से मध्यम झिल्ली गोली secreted विष या endomembrane प्रणाली में रहने वाले, क्रमशः विष की मात्रा को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिकी, endomembrane स्थानीयकृत, और साइटोसोलिक विष के तुलनात्मक अध्ययन के लिए जांच करने के लिए कैसे नशे की कोशिका जीव विज्ञान विभिन्न ईआर translocating विषाक्त पदार्थों के लिए बदलता रहता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी परख भी विष विशिष्ट सेलुलर स्थानान्तरण 19 घटना के लिए आवश्यक कारक टुकड़े करना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह संभव हो सकता है ट्रैक करने के लिए हमारी पद्धति के अनुकूल होना चाहिएएंथ्रेक्स घातक कारक और डिप्थीरिया विष जैसे अन्य अटल बिहारी toxins के endosome को cytosol स्थानान्तरण. अंत में, मेजबान cytosol में वायरल प्रविष्टि संभवतः एक इसी तरह की प्रयोगात्मक प्रक्रिया के साथ नजर रखी जा सकता है.

सीमाएं

स्थितियां कि ईआर के लिए विष तस्करी रोकना भी cytosol विष प्रसव को रोकने जाएगा. यह BFA इलाज किया कोशिकाओं में साइटोसोलिक विष का अभाव (2 Figs., 3A) के द्वारा प्रदर्शन किया गया. इस प्रकार, अतिरिक्त नियंत्रण प्रयोगों जब इस पद्धति का उपयोग करने के लिए विष स्थानान्तरण की क्षमता ब्लॉक की जांच करने के लिए आवश्यक हैं. कुछ अटल बिहारी विषाक्त पदार्थों के लिए, एक डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी है कि अपनी holotoxin उत्प्रेरक सबयूनिट tethers ईआर 6, 40-43 में होता है. श्रृंखला एक की redox स्थिति के अनुसार विष ईआर 16, 18 के लिए परिवहन के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. पुनः संयोजक विषाक्त पदार्थों युक्त एन जुड़े ग्लाइकोसिलेशन के लिए आम सहमति अनुक्रम, ईआर में शुरू की है एक संशोधन है कि, भी किया गया है12 ईआर, 23, 44-46 में विष प्रविष्टि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया. अंत में, के रूप में ऊपर, वैकल्पिक प्रोटोकॉल सह translational ईआर लुमेन में एक श्रृंखला स्थानान्तरण घटना पर निरोधात्मक प्रभाव को सत्यापित कर सकते हैं विष की प्रविष्टि को शामिल चर्चा. उदाहरण के लिए, हमारे स्थानान्तरण SPR आधारित परख है कि एक प्लाज्मिड आधारित प्रणाली है कि CTA1 ईआर 19 लुमेन में सीधे व्यक्त के साथ पुष्टि की गई CTA1 स्थानान्तरण में एक HSP90 के लिए कार्यात्मक भूमिका का प्रदर्शन किया.

ईआर translocating विषाक्त पदार्थों की एक श्रृंखला एक मजबूत arginine से अधिक lysine एमिनो एसिड पूर्वाग्रह है कि translocated विष ubiquitin निर्भर proteasomal 47-50 गिरावट से बचने के लिए अनुमति देता है दिखा रहे हैं. हालांकि, साइटोसोलिक विष की गिरावट अभी भी एक अपेक्षाकृत धीमी गति से, ubiquitin स्वतंत्र proteasomal 51 तंत्र, 52 से होता है. स्थितियां कि proteasomal गतिविधि बढ़ाने सकता है इस प्रकार साइटोसोलिक fra में translocated विष के पूल को कम करने से हमारे स्थानान्तरण परख के परिणाम तिरछाction. इस संभावना के लिए एक एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला के लिए उजागर कोशिकाओं नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, साइटोसोलिक विष proteasomal निषेध से उत्पन्न में वृद्धि का संकेत विष वास्तव cytosol तक पहुंच सकता है लेकिन पता लगाने से पहले अपमानित किया गया था.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन विचारों को aforementioned वैकल्पिक तरीकों के सबसेट को लागू करते हैं और हमारे विधि के लिए अद्वितीय नहीं कर रहे हैं. जैसा कि पहले उल्लेख किया है, स्थानान्तरण घटना निस्र्पक के लिए सबसे अच्छी रणनीति के लिए अच्छी तरह से नियंत्रित तकनीकों का एक संयोजन का उपयोग है.

महत्वपूर्ण कदम है और मुसीबत शूटिंग

रासायनिक तैयारी परख के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. Digitonin आसानी से भंग नहीं करता, और यह हर प्रयोग के लिए ताजा तैयार किया जाना चाहिए. इसी तरह, ताजा PBST SPR विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. EDC: एनएचएस सक्रियण बफर उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए, यह गतिविधि भी नहीं रख अगर दो समाधान मिश्रण के बाद संग्रहीत. However, EDC और एनएचएस के अलग aliquots -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है और उपयोग करने से पहले एक बार thawed है. नमूने सहित सभी समाधान,, होना चाहिए इंजेक्शन से पहले डे - मार डाला. यह SPR संकेत में हवा प्रेरित spikes से रोकने जाएगा.

सेल इस परख के लिए इस्तेमाल किया जा प्रकार व्यक्त करने के लिए पर्याप्त विष रिसेप्टर्स cytosol तक पहुँचने की श्रृंखला के विष की एक detectable पूल की अनुमति चाहिए. पूर्व GM1 के साथ सीटी चुनौती पहले HELA कोशिकाओं के इलाज के रूप में कुछ मामलों में, अतिरिक्त विष रिसेप्टर्स लक्ष्य कोशिकाओं की सतह के लिए जोड़ा जा सकता है है. सेल प्रकार भी digitonin के साथ प्लाज्मा झिल्ली के चुनिंदा permeabilization के लिए अतिसंवेदनशील होना चाहिए. प्रोटोकॉल वर्णित यहाँ HeLa और चो कोशिकाओं के साथ प्रभावी है, लेकिन अन्य प्रकार की कोशिकाओं के एक अनुकूलन organelle और साइटोसोलिक भिन्न की साफ जुदाई की निगरानी के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करने के लिए कदम की आवश्यकता होगी. हम नियमित रूप से प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड isomerase के वितरण (एक घुलनशील प्रोटीन ईआर) और HSP90 (एक साइटोसोलिक prote का पालन करेंइस प्रयोजन के 16-19 के लिए) में . गोली 16-19 अंश में प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड isomerase की अनन्य विभाजन भी सुनिश्चित करता है कि झिल्ली गोली में एकत्र organelles बरकरार हैं. यह हमारी पद्धति का एक महत्वपूर्ण पहलू है, के रूप में intracellular organelles के unintentional टूटना साइटोसोलिक अंश में endomembrane प्रतिबंधित विष जारी करके सिस्टम में त्रुटि शुरू होगा. SPR-आधारित प्रयोगों को भी प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि बजाय एक स्थानान्तरण घटना से intracellular organelles के lysis से विष परिणामों के साइटोसोलिक पूल. उदाहरण के लिए, कोई विष BFA का इलाज (2 Figs., 3 ए) कक्षों या कक्षों केवल 15 मिनट (4 छवि) के लिए विष को उजागर cytosol में खोजा गया था. इसी तरह, सीटी के बी सबयूनिट साइटोसोलिक अंश में एक दो घंटे विष जोखिम (3B छवि) के बाद पता नहीं था. अगर हमारी आंतरिक झिल्ली के permeabilization प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप, हम प्रत्येक afore के लिए विष के साइटोसोलिक पूल है पता चला होगाशर्तों उल्लेख किया है. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, प्लाज्मा झिल्ली के चुनिंदा permeabilization के लिए उचित प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए दर सीमित परख कार्यान्वयन के लिए कदम का प्रतिनिधित्व होने की संभावना है. प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के लिए अन्य विकल्प उपलब्ध हैं, लेकिन हमने पाया कि digitonin उपचार streptolysin ओ के साथ इलाज के रूप में अन्य विधियों की तुलना में और अधिक अनुरूप परिणाम प्रदान

एंटीबॉडी की गुणवत्ता भी परख की संवेदनशीलता है, जो एक विष मानक के धारावाहिक dilutions के साथ स्थापित किया जा सकता है है का निर्धारण करेगा. उदाहरण के लिए, हम reproducibly के रूप में छोटे रूप में 0.1 या तो PTS1 या CTA मानक (2-6 Figs.) के एनजी / एमएल का पता लगा सकते हैं. विरोधी एक श्रृंखला एंटीबॉडी विष बी सबयूनिट पहचान नहीं है, और unintoxicated कोशिकाओं को हमेशा एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें एंटीबॉडी मेजबान सेल में प्रोटीन के साथ पार प्रतिक्रिया नहीं करता. प्रारंभिक प्रयोगों एंटीबॉडी से बाध्य विष विपठ्ठन करने के लिए शर्तों का अनुकूलन की जरूरत है, के रूप में इस अलग कर सकते हैंविभिन्न विरोधी विष एंटीबॉडी के लिए.

जब विष बदल सेलुलर शर्तों के तहत स्थानान्तरण की निगरानी, ​​विष मानकों और अनुपचारित नियंत्रण कक्षों से साइटोसोलिक अंश के नमूने में प्रयोगात्मक शर्तों मैच पूरक होना चाहिए. उदाहरण के लिए, CTA मानकों और चित्रा 5 से अनुपचारित साइटोसोलिक अंश% 1 DMSO के साथ पूरक थे DMSO का इलाज कोशिकाओं से साइटोसोलिक अंश में अंतिम दवा एकाग्रता मैच. SPR संकेतों कि एकत्र भागों की रासायनिक संरचना में मतभेद से पैदा हो सकता है में यह संभव मतभेद समाप्त. साइटोसोलिक और organelle भिन्न के बीच तुलना इसी तरह 1% के अलावा आवश्यकता होगी साइटोसोलिक अंश और मानकों करने के लिए X-100 ट्राइटन, के रूप में इस डिटर्जेंट SPR पता लगाने के लिए organelle अंश से झिल्ली-encased विष जारी करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रारंभिक प्रयोगों से पता चला है cytosol की उपस्थिति SPR विष मानकों करने के लिए प्रतिक्रिया को बदल नहीं,तो यह unintoxicated कोशिकाओं से cytosol के साथ विष मानकों के पूरक के लिए आवश्यक नहीं है.

सेंसर स्लाइड पर बाध्यकारी एंटीबॉडी EDC अगर घटित नहीं होगा: एनएचएस सक्रियण समाधान पुराना है या यदि स्लाइड साधन में सोने की ओर चेहरे के साथ डाला जाता है नीचे. एनएचएस सक्रियण और इस प्रकार, एंटीबॉडी पर कब्जा: विनिर्माण प्रक्रिया को देखते हुए, वहाँ कुछ थाली थाली परिवर्तनशीलता जो उचित EDC रोका जा सकता है किया जाएगा. यदि स्लाइड करने के लिए बाध्य प्रतिरक्षी गरीब है, के रूप में एक कमजोर ऊंचा RIU ने संकेत दिया है, एक दूसरे इंजेक्शन थाली पर एंटीबॉडी की अधिक जमा कर सकते हैं. RIU एक मनमाना इकाई है कि एक प्रयोग से एक और कितना विरोधी विष एंटीबॉडी सेंसर पर जमा है के आधार पर बदलता है. हालांकि, पर और बंद दरों स्थिर रहेगा.

यह दोहरी चैनल छिड़काव कक्षों के साथ एक Refractometer उपयोग करने के लिए बेहतर है, एक चैनल के रूप में प्रयोगात्मक नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अन्य चैनल बफर alo के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपूर्वोत्तर के क्रम में संभव आधारभूत बहाव के लिए सही. जब एक दोहरी चैम्बर साधन का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि विरोधी विष एंटीबॉडी केवल दो चैनलों के लिए जोड़ा जाता है. नमूने बाद में दोनों चैनलों के माध्यम से चला जाएगा. एक एकल चैनल साधन के साथ, आधारभूत बहाव के लिए मुआवजा बफर के संग्रह अकेले एंटीबॉडी लेपित नमूना इंजेक्शन से पहले स्लाइड से डेटा शामिल है.

एक SPR प्रयोग की शुरुआत से पहले सुनिश्चित करने के लिए, सेंसर स्लाइड तंग साधन में सेट कर दिया जाता है और सभी फिटिंग सुरक्षित हैं. इन मुद्दों से उत्पन्न लीक एकत्र आंकड़ों में हवा के spikes उत्पन्न होगा. लीक भी बर्बादी प्रवाह के अभाव है, जो हमेशा मौजूद होना चाहिए द्वारा पता लगाया जा सकता है. एक नमूना इंजेक्शन पाश की मात्रा से अधिक मात्रा के रूप में अच्छी तरह से हवा के spikes से बचने के लिए आवश्यक है - उदाहरण के लिए, हम एक 500 μL इंजेक्शन पाश के साथ 1 एमएल नमूना संस्करणों का उपयोग करें. विसर्जन के तेल के चश्मे पर एक अनुचित राशि आधारभूत हस्ताक्षर के स्थिरीकरण को रोकने जाएगा.. SPR साधन के आपरेशन करने के लिए संबंधित अन्य मुद्दों उपयोगकर्ता गाइड और तकनीकी रीचर्ट द्वारा प्रदान बुलेटिन में संबोधित कर रहे हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान AI073783 R01 लालकृष्ण Teter के लिए वित्त पोषित किया गया था. हम सहायता के लिए पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए subcellular fractionation प्रोटोकॉल और हेलेन Burress के विकास में डा. शेन Massey धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin Sigma-Aldrich D141
Ethanol Acros Organics 61509-0010
DMEM Invitrogen 11995065
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Ganglioside GM1 Sigma-Aldrich G7641
CTA Sigma-Aldrich C2398
PTS1 List 182
NHS (N-Hydroxysuccinimide) Pierce, Thermo Scientific 24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) Thermo Fisher Scientific, Inc. 22981
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135
PBST Medicago 09-8903-100
Anti-CTA antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-80747
Anti-CTB antibody Calbiochem 227040
Anti-PTS1 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-57639
Refractometer Reichert SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides Reichert 13206060
Syringe pump Cole-Parmer 780200C

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इम्यूनोलॉजी अंक 59 भूतल plasmon अनुनाद अटल बिहारी विष स्थानान्तरण endoplasmic जालिका सेल संस्कृति हैजा विष काली खांसी विष
सतह plasmon अनुनाद द्वारा विष स्थानान्तरण के होस्ट cytosol में जांच
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Taylor, M., Banerjee, T.,… More

Taylor, M., Banerjee, T., VanBennekom, N., Teter, K. Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (59), e3686, doi:10.3791/3686 (2012).

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