Summary
Explants ממערכת המוח התיכון דופאמין הסטריאטום משמשים assay קולגן מטריקס עבור
Abstract
הדופמין במוח התיכון (mdDA) נוירונים הפרויקט באמצעות צרור המוח הקדמי המדיאלי כלפי כמה אזורים telencephalon, כולל 1 הסטריאטום. הדדי, הנוירונים קוצניים בינוני בסטריאטום שיוצרים מסלול (ישיר) striatonigral innervate nigra substantia 2. פיתוח של שטחים אלה האקסון תלויה בפעולות קומבינטורית של שפע של צמיחה האקסון ואת רמזים הדרכה כולל מולקולות שפורסמו על ידי neurites או (ביניים) אזורים היעד 3,4. גורמים אלה מסיסים ניתן ללמוד במבחנה על ידי mdDA culturing ו / או explants striatal במטריצה קולגן אשר מספק מצע תלת מימדי על אקסונים מחקה את הסביבה תאיים. בנוסף, מטריקס מאפשרת קולגן ליצירת שיפועים יציבה יחסית של חלבונים שפורסמו על ידי explants או תאים אחרים המוצבים בסביבה (למשל, לראות את הפניות 5 ו -6). כאן אנו מתארים את שיטות פורification של קולגן עכברוש הזנב, microdissection explants של דופאמין ו striatal, התרבות שלהם ג'ל קולגן וניתוח immunohistochemical וכמותית שלאחר מכן. ראשית, במוחם של עוברי עכברים E14.5 הם מבודד דופאמין ו explants striatal הם microdissected. Explants אלה מכן (CO) בתרבית ג'ל קולגן על coverslips במשך 48 עד 72 שעות במבחנה. כתוצאה מכך, תחזיות axonal הם דמיינו באמצעות סמנים עצביים (tyrosine hydroxylase למשל, DARPP32 או טובולין βIII) וצמיחה האקסון ותגובות האקסון אטרקטיביים או דוחה הם הניתנים לכימות. זו הכנה עצבי הוא כלי שימושי עבור במבחנה של המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון mesostriatal ו striatonigral והדרכה במהלך הפיתוח. שימוש assay זה, אפשר גם להעריך אחרים (ביניים) מטרות אקסונים דופאמין ו striatal או לבדוק אותות מולקולריים מסוימים.
Protocol
1. הכנת קולגן זנב עכברוש
- איסוף 6-10 זנבות עכברים בוגרים (ניתן לאחסן את זנבות ב -20 ° C עד השימוש).
- משרים את זנבות באתנול 95% בין לילה בטמפרטורת החדר (RT).
דיסקציה של זנבות עכברים (בשכונה בתרבית רקמה):
(לשמור על כלי באתנול 70%, כאשר לא משתמשים בהם ולוודא כי כל הפתרונות, הכלים וכלי הזכוכית בשימוש בכל הליך זה הם סטריליים)
- לאסוף גידים מ זנבות, לנתק את קצה הזנב. החזק בסופו של זנב גדול עם זוג מלקחיים. השתמש עוד זוג מלקחיים להחזיק, לכופף ולשבור את הזנב קרוב מלקחיים אחרים. לפרק ואת הגידים יישאר מאחור (איור 1 א ', ב').
- לאסוף את הגידים סטרילית H 2 O, ולאחר איסוף כל הגידים להעביר אותם petridish חדש עם סטרילית H 2 O.
- קח 2-3 גידים ו לגרוס אותם באמצעות 2 זוגות שלceps ב petridish חדש עם סטרילית H 2 O. הסר שאינם רקמת גיד כגון ורידים (רקמת גיד מבריק ומהורהר, 1C איור). לאחר הסרה של רקמת גיד לא הכל, זנב אחד מניב כ 100-150 מ"ג של גידים.
- להעביר את הגידים עד 300 מ"ל של חומצה אצטית סטרילית 3% ומערבבים לאט לילה ב 4 ° C.
- הוסף מ"ל נוסף 200 של חומצה אצטית סטרילית 3% ומערבבים לאט לילה ב 4 ° C.
- בצנטריפוגה פתרון חומצה אצטית המכיל את הגידים XG ב 2700 ~ 120 דקות ב 4 ° C עד גלולה לא מומס הגידים שאינם גיד רקמות.
- במהלך צנטריפוגה להכין צינורות דיאליזה:
- לחתוך חתיכות של 40 ס"מ
- להרתיח ב 500 מיקרומטר EDTA 5 דקות
- קריר סטרילי H 2 O
- לקשור קשר בקצה אחד של צינור דיאליזה ולמלא את צינורות עם supernatant הפתרון גיד centrifuged על הקרח מכסה המנוע תרבות רקמות באמצעות pipett אוטומטיתE ו פיפטה 25 מ"ל. הימנע לייצר בועות. קשר את הקצה השני של צינורות צינורות החנות על רדיד אלומיניום סטרילי על הקרח עד חתיכות של כל צינורות מלאים (1D איור).
- הכן 10 ליטר של סטרילית 0.1x ספורט, pH 4.0, בשכונה בתרבית רקמה. הוסף מצוף לחתיכות של צינורות ולהוסיף אותם לפתרון מראש מקורר MEM 0.1x בכוס 10 ליטר. Dialyze לילה ב 4 ° C תוך לאט תוך ערבוב. דיאליזה זה מסיר עודפי חומצה, תוך שמירה על pH נמוך.
- החלף חדשה מראש מקורר 10 אני 0.1x MEM ומערבבים לילה ב 4 ° C.
- חזור על השלב הקודם על ידי החלפת מראש עם חדש מקורר 10 אני 0.1x MEM ומערבבים במשך הלילה על 4 ° C.
- קולגן aliquot פתרון תוך 50 צינורות סטריליים מ"ל. החנות aliquots ב 4 ° C. שמור על 6-12 חודשים, רק להתמודד עם המניות קולגן בשכונה בתרבית רקמה.
- חשוב לבדוק אם קולגן מטוהרים צריך להיות מדולל (ב 0.1x MEM) כדי להשיג תוצאות אופטימליות ב matr קולגןט assay. לכן, לייצר סדרה דילול הקולגן (הקולגן חי, 01:01, 01:02 ו 01:05 בדילול מלא) ולבצע מטריקס מבחני קולגן כמתואר להלן, כדי לקבוע את דילול קולגן אופטימלית.
2. דיסקציה של המוח התיכון דופאמין 7,8
- לנתח E14.5 עוברי עכברים מן הרחם של האם לשמור על המדיום L15 על הקרח עד הצורך.
כל השלבים הנתיחה שלאחר מכן מבוצעות בתווך L15 על הקרח.
- לנתח את המוח.
- הסר את telencephalon על ידי חיתוך לאורך החלק המדיאלי של שלפוחית כל telencephalic (שימוש שלפוחית telencephalic עבור explants striatal).
- הסר את נדן meningeal.
- לעשות חתך dorsoventral מקורי רק של כפף mesencephalic.
- לעשות עוד קיצוץ הזנב dorsoventral רק כפף mesencephalic.
- לעשות חתך לאורך קו האמצע rostrocaudal הגב באמצעות microdissectioסכין n לחשוף את הרקמה הבסיסית המוח התיכון הגחון. להיזהר לא לפגוע ברקמת המוח התיכון הגחון מכיוון שהיא מכילה נוירונים דופאמין (איור 2).
- בשני חתכים rostrocaudal לרוחב ובמקביל קו האמצע הגחון כדי להסיר רקמות המוח התיכון הגב.
- מחלקים את רקמת המוח התיכון הנותרים הגחוני אל explants באמצעות סכין microdissection.
- אחסן את explants במדיום L15 FBS המכיל 5% על הקרח עד לשימוש.
3. דיסקציה של הסטריאטום
צעדים כל דיסקציה מבוצעות בתווך L15 על הקרח.
- השתמש שלפוחית telencephalic גזור במהלך דיסקציה המוח התיכון.
- הסר את התלמוס על ידי חיתוך בין התלמוס ואת הסטריאטום באמצעות מלקחיים.
- לעשות חתך mediolateral מקורי כדי הסטריאטום להסיר מבנים מקורי כגון נורת חוש הריח. חזור על פעולה זו על רקמת ממוקם caudally אל הסטריאטום.
- עמדהפרוסת הנותרים לקבל תצוגה העטרה של הסטריאטום (איור 2).
- הסטריאטום יכול להיות מוכר כחלק מעט פחות צפוף (שקוף יותר) של רקמה. לנתח את הסטריאטום לחתוך לתוך explants באמצעות סכין microdissection. הימנע קרוב רקמות מעט כהה יותר כדי קו האמצע, אשר מכיל נוירונים נודדים של רוממות ganglionic לרוחב ו המדיאלי.
- אחסן את explants במדיום L15 FBS המכיל 5% על הקרח עד לשימוש.
4. הרכבה קולגן מטריקס מבחני
הכנת קולגן (בכל הצעדים על הקרח, להשתמש מקורר טיפים פיפטה)
- מערבבים 860 μl של קולגן בדילול מלא עם 100 μl של MEM 10x ו 40 μl של סודה לשתייה 1 יג (NaHCO 3) ולשמור על הקרח. אם בשלב זה הקולגן מתחמם זה יהיה לחזק.
- הוסף ירידה של μl 20 (כ 5 מ"מ קוטר) של קולגן מוכנים coverslip היטב מנה 4-גם Nuncולתת לו לעמוד CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות (הסביבה O 2 בריכוז מספיק). במהלך הדגירה זה קולגן יהיה gelatinize.
הגדרת שיתוף תרבות קולגן ג'ל
- לאחר קולגן יש gelatinized, השתמש פיפטה עם טיפ 200 μl להעביר explant דופאמין או striatal קולגן.
- להעביר את explants בסמיכות זה לזה באמצעות מחט. להפריד ביניהם במרחק של קוטר של כ explant 1 (~~~HEAD=NNS 200-300 מיקרומטר) (איור 2).
- הסר בינוני עודף ולהוסיף 20 μl של קולגן מוכן על גבי explants את. זה יהיה לעיתים קרובות לגרום explants כדי לנוע. למקם מחדש את explants באמצעות מחט כמתואר 4.4.
- בואו הקולגן לחזק במשך 15 דקות ב RT ואחריו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר קולגן קבע, הוסף 400 μl של הבינוני xplant ולגדול במשך 2-3 ימים CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
5. ניתוח על פי אימונוהיסטוכימיה וכימות
אימונוהיסטוכימיה
- כדי לתקן explants, בעדינות להוסיף 400 μl של paraformaldehyde 8% (PFA) ב PBS עד 400 μl של המדיום (ובכך לדלל PFA ל -4%) ולתת לעמוד במשך שעה 1 ב RT.
- לשטוף דקות 3x 15 ב PBS ב RT.
- דגירה בחסימת המאגר (BB; PBS + 1% FBS + 0.1% טריטון X-100) במשך 2 שעות.
- דגירה בין לילה עם הנוגדן העיקרי BB ב 4 ° C. על האקסונים דופאמין להשתמש נגד טירוזין נוגדנים hydroxylase (1:1000) 7, אקסונים striatal נגד DARPP32 נוגדנים (1:500) 9 ו המאפשר הדמיה את כל האקסונים נגד βIII טובולין (1:3000) 7.
- לשטוף שעה 5x 1 ב PBS ב RT.
- דגירה עם נוגדנים משני מצומדות כדי fluorophore המתאים (1:500) ב BB לילה בשעה 4° C. משלב זה ואילך לצמצם את החשיפה של explants את האור (למשל לכסות אותן בנייר כסף).
- לשטוף לילה PBS ב 4 ° C ואחריו שוטף כמה במהלך היום הבא.
- הר explants על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות להאריך מגיב Antifade הרכבה בינונית. הוסף ירידה של 10 μl ~ בשקופית מיקרוסקופ זכוכית. קח coverslip בעדינות ומניחים אותו על ירידה של המדיום גובר כאשר הצד explant כלפי מטה. למנוע השמנה כל האוויר מתחת דה coverslip ידי בעדינות הורדת אותו על ירידה של המדיום גובר.
כימות על ידי חישוב P / D יחס
- לרכוש תמונות דיגיטליות של explants באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence (איור 3).
- שימוש בתמונות אלה, לחלק אחד explant לתוך הרביעים לייצר ברבע פרוקסימלי (כלומר החלק של explant הקרוב explant צמוד) וגם ברבע דיסטלי (חלק explant הרחוק ביותר מן expla הסמוךNT) (איור 2, 4).
- למדוד את אורך של 20 neurites הארוכים ביותר העולה מתוך explant הן את הרביעים הפרוקסימלית ומ דיסטלי.
- השתמש באורך ממוצע של 20 neurites הארוכים ביותר כדי לחשב את יחס P / D עבור explant בנפרד. AP / D יחס> 1 מציין משיכה האקסון, בעוד יחס <1 מצביע על דחייה האקסון.
- במקרים מסוימים, צמיחה צפופה של neurites מונע הערכת אורך neurite הפרט. במצבים אלה, כימות יכול להתבצע על ידי מדידת המרחק בין קצה explant והחזית המוביל של הצמיחה האקסון של הרביעים הפרוקסימלית ומ דיסטלי.
6. נציג תמונות
אחרי התרבות המוצלח של explants דופאמין ו striatal מספר רב של אקסונים גלויים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או דמיינו כפי immunocytochemistry נגד βIII טובולין (לא מוצג). תת קבוצה של אקסונים אלה יהיו דופאמין או של אקסונים triatal כמו immunocytochemistry באמצעות דמיינו (איור 3). על ידי חלוקת explants לתוך הרביעים כמתואר וקביעת P / D יחס, התוצאה האקסון המשוערת מושכת או דוחה ניתן לכמת (איור 3E).
באיור 1. תמונות הממחישות את ההכנה של הקולגן בגידים זנב חולדה. א) משיכת חוץ זנב עכברוש חושף את הגידים. ב) הגידים הם נראים כמו חבל, כמו צרורות. ג) הגידים קל להבחין בין עורקים על ידי המראה הלבן הבוהק שלהם. ד) לאחר המסת הגידים חומצה אצטית, הפתרון הוא להעביר את צינורות דיאליזה. כדי לשמור על קור קולגן מומס, צינורות ממוקמות על רדיד אלומיניום סטרילי על הקרח.
ה 2 "src =" / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg "/>
איור 2. סכמטי המציין את השלבים השונים של ההליך. אזורי המוח המתאימים גזור ופצע ליצור explants. המוח התיכון יחיד explant striatal ממוקמים בסמיכות במטריצה קולגן והשאיר לגדול במשך 48-72 שעות על 37 ° C. האקסונים הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה הקרינה ואת היחס P / D מחושב לכמת התגובות chemotropic.
איור 3. תוצאות נציג מראה צמיחה האקסון בתרבות מטריקס קולגן. א) explant המוח התיכון מוכתם נגד tyrosine hydroxylase נוגדנים תוצאה חושפים האקסון. הקו המקווקו מציין explant הסמוך. ב) הגדלה של מספר neurites בודדים המראים קונוסים צמיחה (חיצים). ג) explant Striatal מוכתם נגד DARPP32. D) הגדלה של C מראה neurites בודדים. ה) דוגמהע / D יחס כימות. Explants מחולקים הרביעים שווים. ברבע הפרוקסימלי עומדת בפני explant הסמוך ואילו ברבע דיסטלי פונה ממנו. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay מטריקס קולגן המתואר כאן נעשה שימוש ושיפרה ידי מעבדות רבות בעשורים האחרונים לחקור מגוון רחב של מולקולות האקסון הדרכה ומערכות עצביות (למשל לראות הפניות 5-8). מחקרים אלה הראו כי assay זה הוא כלי רב עוצמה לחקר תופעות ורגולציה של מולקולות האקסון הדרכה המופרשים על ידי (ביניים) ברקמות שונות היעד.
עם זאת, יש לציין כי מטריקס קולגן הוא תחליף בסביבה תאית (ECM), אבל ברור שחסר חלבונים רבים מציגים בדרך כלל ECM. מרכיבי ECM ידועים להשפיע על ההשפעות של מולקולות הנחיה האקסון 10. עם זאת, assay מטריקס קולגן שימושי במיוחד לחקירת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים במבחנה בשילוב עם גישות אחרות תרבות רקמות (למשל תרבויות פרוסה organotypic 11) או ניתוח של מודלים בבעלי חיים מהונדסים גנטית. מספר גורמים קובעים את ההצלחה של assay מטריקס קולגן. ראשית, גודל explants הוא קריטי לצמיחה אופטימלית האקסון. Explants דופאמין ו striatal גדולים לעתים קרובות להציג צמיחה האקסון מוגבל, תוך explants קטנים להראות תוצאה לא סדיר fasciculated. יתר על כן, המרחק בין explants בודדים מאוד משפיע השפעה מולקולה מופרש יכול להפעיל על explants סמוכים. אם explants הם רחוקים מדי, מולקולות diffusible לא יצליח להגיע explants. לעומת זאת, כאשר המרחק הוא אקסונים קטנים מדי עשוי לגדול לתוך explants סמוכים, ולכן קשה להעריך איכותית וכמותית הצמיחה האקסון והדרכה. לבסוף, איכות הקולגן זנב עכברוש חשובה קשורה ישירות עם תוצאה של אקסונים הישרדות explants.
Assay המתואר כאן יכול להיות שונה בדרכים שונות כדי לענות על שאלות מחקר ספציפיות. לדוגמה, תוספת שלפונקציית חסימת נוגדנים עד בינוני צמיחה מאפשר עיכוב תפקודית (של המועמד) מולקולות. בנוסף, explants ניתן בשילוב עם אגרגטים תא גידול מפריש האקסון מסוים וגורמים הדרכה. לבסוף, explants ניתן להשיג עכברים GFP הכתב שבו אוכלוסיות נוירונים ספציפיים האקסונים שלהם מסומנים. באמצעות התקנה זו, אקסונים ניתן בעקבות במהלך assay מטריקס קולגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
Assay מטריצת הקולגן פותחה לשפר על ידי עבודה של הרבה קבוצות מחקר שונות במהלך השנתיים עד שלוש השנים האחרונות. הגישות המתוארות כאן explants דופאמין ו striatal תועלת רבה ממחקרים אלה. בנוסף, החוקרים מודים Asheeta פראסאד על עזרתה בהקמת תרבויות explant striatal. לעבוד במעבדה מומן על ידי ארגון Human תוכנית המדע הגבול (פיתוח פרס קריירה), ארגון הולנד למחקר בריאות ופיתוח (ZonMW-VIDI ZonMW ו-TOP), האיחוד Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , גרנט 222999) (כדי RJP), לבין ארגון הולנד למחקר מדעי (TopTalent, כדי Eres).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
