Summary
Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक प्रतिरक्षाविज्ञानी मनुष्यों में भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग संचालन तंत्र का अध्ययन है. टी सेल की तस्करी पैटर्न की निगरानी करने की क्षमता
Protocol
1. घातक किरणन
- 10 प्राप्तकर्ता चूहों को एक microisolator irradiator साथ संगत के लिए इस्तेमाल किया जा पिंजरे में रखें.
- 2 बराबर मात्रा में कुल खुराक (कुल खुराक = BALB.B प्राप्तकर्ताओं के लिए 9 cGy) संक्षेप चमकाना. दूसरा विकिरण 3 घंटा पहले के बाद होना चाहिए. इंजेक्शन अंतिम विकिरण के बाद 4-6 घंटे के बीच हो जाना चाहिए. या तो Cs 137 स्रोत या RS2, 000 irradiator, चमकाना चूहों.
- Acidified पानी के साथ प्रत्यारोपण के समय तक 2 विकिरण खुराक, microisolator पिंजरे में दुकान चूहों के बाद.
2. Splenocyte तैयारी
- संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार एक दाता माउस euthanize. 125x10 6 splenocytes - प्रत्येक दाता आम तौर पर 75x10 6 पैदावार. 12x10 6 CD8 टी कोशिकाओं CD8 शुद्धि किट का उपयोग करना, प्रत्येक माउस आम तौर पर 6x10 6 पैदावार.
- पहले सही midline सीधे की एक ऊर्ध्वाधर 2 सेमी चीरा 2 सेमी बनाने के द्वारा तिल्ली निकालेंरिब पिंजरे के तहत. फर, त्वचा, और आंत की झिल्ली के माध्यम से काटें.
- तिल्ली निकालें और एक पेट्री डिश में 40 μl जाल स्क्रीन के में 5% FBS साथ 1640 RPMI साथ तिल्ली रखने के द्वारा एकल कोशिका निलंबन बना. एक सिरिंज सवार का उपयोग करने के अलावा तिल्ली तोड़ने जब तक पूरे प्लीहा जाल स्क्रीन के माध्यम से पारित किया गया है.
- प्रत्येक WT और L2G85.B6 दाता के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. 1-50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी WT एकल कक्ष निलंबन को ले लीजिए, और सभी L2G85.B6 एक अलग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एकल कक्ष निलंबन इकट्ठा.
- 1,200 rpm पर 10 मिनट के लिए 4 में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस में Resuspend छर्रों 5% FBS और गिनती की कोशिकाओं के साथ RPMI 1640.
3. अस्थि मज्जा तैयार
- एक एक दाता माउस के पिछले अंग से त्वचा निकालें.
- ध्यान फीमर और टिबिया / fibula से संभव के रूप में बहुत मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में दूर कटौती.
- फीमर संयुक्त कूल्हे में दूर काटने के द्वारा पिछले अंग निकालें. दूर बस / टिबिअ fibula चौराहे के नीचे रियर पंजा कट. सभी की हड्डी में कटौती तगड़ा कैंची का उपयोग किया जाना चाहिए.
- ध्यान से किसी भी शेष मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें. बंद कट - fibula अपेक्षाकृत कम अस्थि मज्जा fibula में पाया जाता है और प्रयास के लायक नहीं है.
- 2 पिछले अंग के साथ ठंड RPMI 1640 5% FBS और दोहराने की प्रक्रिया में पिछले अंग रखें. 40x10 6 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं प्रत्येक माउस 20x10 6 के बीच उपज चाहिए.
4. अस्थि मज्जा निकालना
- बड़े पेट्री डिश में मीडिया और जगह से ठंड मीडिया (~ 1 मिलीग्राम) की एक छोटी राशि के साथ एक पिछले अंग निकालें.
- दूर घुटने संयुक्त कट. टिबिअ (> 5 मिलीलीटर मात्रा) में एक सिरिंज का प्रयोग, डालने चमड़े के नीचे सुई और सिरिंज दबाना जब तक सभी लाल सामग्री टिबिया के इंटीरियर से निकाल दिया जाता है. फीमर के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ. शेष अस्थि मज्जा से रहित हड्डियों त्यागें. 2 पिछले अंग के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- Pipetting बड़े पेट्री डिश और उपयोग सिरिंज सवार और 40 μl में अस्थि मज्जा वाले मीडिया द्वारा एकल कक्ष निलंबन बनाएँस्क्रीन जाल. पिपेट 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एकल कक्ष निलंबन और बर्फ पर रख.
5. CD3 रिक्तीकरण
CD3 + कोशिकाओं अस्थि मज्जा से व्यय करने के तरीके की एक किस्म है. हमारी प्रयोगशाला Miltenyi बायोटेक (130-093-021 CD3 बायोटिन) द्वारा किए गए एक किट का उपयोग करता है. CD3 अस्थि मज्जा से निर्माता प्रोटोकॉल के बाद + कोशिकाओं खलाना. Miltenyi किट के लिए बफर आगे से एमएसीएस बफर (2 मिमी EDTA, PBS, पीएच 7.2 में 0.5% BSA) कहा जाएगा.
- कोशिकाओं में 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस और गिनती की कोशिकाओं के लिए 1200 rpm पर centrifuging splenocytes और अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से धो लें.
- सभी तैरनेवाला निकालें. एमएसीएस बफर में 10 लाख अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के अनुसार 100 μl में Resuspend अस्थि मज्जा की कोशिकाओं.
- CD3 रिक्तीकरण के साथ आगे बढ़ें 'का उपयोग कर प्रोटोकॉल बनाती है.
- CD3 समाप्त अस्थि मज्जा की कोशिकाओं बाँझ पीबीएस में 3 बार धो लें. गणना CD3 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं समाप्त हो गया और एक उचित मात्रा में करने के लिए 10 7 कोशिकाओं इंजेक्षन resuspend.
वहाँ L2G85.B6 चूहों से CD8 टी कोशिकाओं को शुद्ध करने के तरीके के एक किस्म है. इसके अलावा, वहाँ WT splenocyte दाताओं से CD8 टी कोशिकाओं व्यय के लिए कई तरीके हैं. हमारी प्रयोगशाला Miltenyi बायोटेक (130-049-401 - CD8 शुद्धि - 130-095-236 CD8 रिक्तीकरण) से किट का उपयोग करता है.
- 10 7 कोशिकाओं प्रति 90 μl एमएसीएस बफर में WT गोली Resuspend. 'प्रोटोकॉल (130-049-401 - रिक्तीकरण CD8) विनिर्माण के अनुसार CD8 टी सेल रिक्तीकरण के साथ जारी रखें.
- 10 7 कोशिकाओं प्रति 40 μl एमएसीएस बफर में L2G85.B6 गोली Resuspend. 'प्रोटोकॉल (130-095-236 - शुद्धि CD8) विनिर्माण के अनुसार CD8 टी सेल शुद्धि के साथ जारी रखें.
- प्रत्येक सेल की आबादी की गणना और प्रत्येक जनसंख्या बाँझ पीबीएस के साथ 3 बार धो लो. उचित मात्रा में प्रत्येक जनसंख्या Resuspend 18x10 6 (CD8 समाप्त) WT splenocytes और 6 2x10 L2G85.B6 CD8 टी कोशिकाओं शुद्ध इंजेक्षन.
7. इंजेक्शन तैयारी
- 10 7 CD3 समाप्त हो अस्थि मज्जा कोशिकाओं, 18x10 6 WT splenocytes (CD8 समाप्त), और एक microcentrifuge ट्यूब में 6 2x10 L2G85.B6 CD8 टी कोशिकाओं शुद्ध जुडा. बाँझ पीबीएस और resuspend के साथ 300 μl में धो लें.
- प्राप्तकर्ता चूहों की पूंछ नस में सेल तैयारी इंजेक्षन. इंजेक्शन 28 गेज सुई का उपयोग किया जाना चाहिए.
- Acidified पानी के साथ microisolator पिंजरे में स्टोर चूहों. कुल चूहों दैनिक स्कोरिंग GVHD स्कोरिंग कुक एट अल 1 द्वारा विकसित प्रणाली का उपयोग कर.
8. Bioluminescent इमेजिंग
- छह दिनों के बाद प्रत्यारोपण, 4 मिलीग्राम डी Luciferin साथ प्राप्तकर्ता चूहों इंजेक्षन. Luciferin के लिए 5 मिनट luciferase के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दें.
- माउस anesthetize bioluminescence imager और छवि प्राप्तकर्ताओं के isoflurane चैम्बर में छोटे binning के साथ 5 मिनट के लिए. यह एक उच्च संकल्प छवि बनाने जबकि संभव के रूप में कई घटनाओं के रूप में जमा हो जाएगा.
- जहाँ रहते हैं का उपयोग कर डेटा का विश्लेषणछवि सॉफ्टवेयर. छद्म रंग छवि के पैमाने पर करने के लिए सबसे अच्छा परिणाम बदला जा सकता है. हालांकि, यह जरूरी है कि एक ही पैमाने पर प्रयोग में इस्तेमाल किया जा.
- हित के क्षेत्र लिविंग छवि सॉफ्टवेयर और प्रकाश emittance प्रवाह (फोटॉनों / सेक) ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र से उत्सर्जित होने की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है बनाया जा सकता है.
9. प्रतिनिधि परिणाम
लगभग 7-10 दिनों के बाद प्रत्यारोपण, चूहों GVHD के नैदानिक लक्षण दिखा शुरू. चूहे scruffy संवारने की कमी के कारण दिखाई देते हैं. प्राप्तकर्ता भी 7-10 दिनों के बाद प्रत्यारोपण के बीच अपना वजन कम करने के लिए शुरू हो जाएगा. गतिविधि और प्राप्तकर्ता चूहों के मुद्रा अपेक्षाकृत सामान्य दिन लगभग 12-14 पोस्ट प्रत्यारोपण तक रहेगा. संचयी GVHD स्कोर पहले 2-3 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण (चित्रा 1 ए) के माध्यम से तेजी से वृद्धि होगी. रोग पाठ्यक्रम चूहों के बीच काफी परिवर्तनशील है, तथापि, प्राप्तकर्ताओं को समान रूप से 30-40 घ GVHD शिकार चाहिएays पोस्ट प्रत्यारोपण (चित्रा 1 बी).
चित्रा 2 प्राप्तकर्ता चूहों कि 6 दिनों के बाद प्रत्यारोपण imaged थे दिखाता है. छद्म रंग पैमाने पर उच्चतम प्लीहा और पेट में उत्सर्जित तीव्रता प्रकाश के साथ पूरे शरीर में प्रकाश emittance अलग से पता चलता है. CD8 टी सेल संचय पेट में पिछले 6 निष्कर्षों के साथ संगत है. प्राप्तकर्ता चूहों microisolator पिंजरे में वापस रखा जा सकता है और एक बाद में समय बिंदु पर imaged किया जा या पूर्व vivo इमेजिंग के लिए euthanized.
मापदंड | 0 ग्रेड | ग्रेड 1 | ग्रेड 2 |
वजन घटाने (wkly.) | <% 10 | > 10% <25% | > 25% |
आसन | साधारण | बाकी में केवल Hunching | कई Hunching, impairs movemeNT के |
सक्रियता | साधारण | गतिविधि में कमी उदारवादी हल्के | उत्तेजित जब तक स्टेशनरी |
फर बनावट | साधारण | Ruffling उदारवादी हल्के | गंभीर ruffling / गरीब संवारने |
त्वचा की बनावट | साधारण | पंजे / पूंछ की स्केलिंग | Denuded त्वचा की स्पष्ट क्षेत्रों |
तालिका 1 कुक एट अल एक 1996 में इस स्कोरिंग प्रणाली विकसित की है. चूहे बाईं तरफ मानदंडों में से प्रत्येक पर दैनिक रन चाहिए. एक माउस 0-2 की प्रत्येक मापदंड के लिए एक अंक दिया जाता है और सभी व्यक्तिगत स्कोर का कुल स्कोर एक योग है.
चित्रा 1 lethally विकिरणित BALB.B 10 7 हड्डी के साथ प्रत्यारोपित किया गया.मज्जा कोशिकाओं अकेले या 18x10 6 CD8 टी सेल समाप्त WT splenocytes और 6 2x10 शुद्ध L2G85.B6 CD8 टी कोशिकाओं के साथ. ए) अस्थि मज्जा की प्राप्तकर्ताओं की क्लीनिकल स्कोर डेटा अकेले या CD8 टी सेल के साथ WT splenocytes समाप्त और L2G85.B6 CD8 टी कोशिकाओं शुद्ध. बी) अस्थि मज्जा के प्राप्तकर्ताओं को अकेले या साथ की उत्तरजीविता डेटा CD8 टी सेल WT splenocytes समाप्त और L2G85.B6 CD8 टी कोशिकाओं शुद्ध बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 2 lethally विकिरणित BALB.B चूहों 10 7 अस्थि मज्जा अकेले या 18x10 6 CD8 टी सेल समाप्त WT splenocytes और 6 2x10 शुद्ध L2G85.B6 CD8 टी कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया. प्राप्तकर्ता intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से 4 डी Luciferin मिलीग्राम के साथ अंतःक्षिप्त थे और छोटे binning पर 5 मिनट के लिए Xenogen IVIS का उपयोग imaged. पुनश्चeudo रंगीन छवियों जहां बैंगनी कम तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है और लाल रंग का प्रतिनिधित्व करता है ब्याज की उच्च तीव्रता क्षेत्र पूरे माउस और कुल प्रवाह (फोटॉनों / सेक) के चारों ओर खींचा थे quantified दिखाए जाते हैं.
चित्रा 3 lethally विकिरणित BALB.B चूहों 10 7 अस्थि मज्जा अकेले या 18x10 6 CD8 टी सेल समाप्त WT splenocytes और 6 2x10 शुद्ध L2G85.B6 CD8 टी कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया. प्राप्तकर्ता intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से 4 डी Luciferin मिलीग्राम के साथ अंतःक्षिप्त थे और छोटे binning पर 5 मिनट के लिए Xenogen IVIS का उपयोग imaged. छद्म रंग छवियों जहां बैंगनी कम तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है और लाल उच्च तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है दिखाए जाते हैं. प्राप्तकर्ता) 4 दिन, बी) 6 दिन, और सी) दिन 8 पोस्ट हस्तांतरण पर imaged थे.
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Discussion
उत्प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत चूहों में GVHD murine GVHD के एक नैदानिक प्रासंगिक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है. मूलतः बर्गर एट अल द्वारा 1994 में स्थापित, C57BL / 6 BALB.B तनाव संयोजन में MHC मिलान GVHD निर्भर CD4, CD8 टी 2 effectors, अत्यधिक सबसे आम नैदानिक 3 परिदृश्य के लिए इसी तरह की मध्यस्थता मृत्यु दर के साथ है. यह ज्ञात है कि अकेले CD8 टी कोशिकाओं रोपाई इस मॉडल में GVHD कारण नहीं है, तथापि, रोग प्रगति जब दोनों CD4 और CD8 टी कोशिकाओं के रूप में मौजूद हैं टी कोशिकाओं CD4 अकेले की तुलना में काफी बदतर है. इसके अलावा, इस मॉडल में 10 मामूली उतक अनुरूपता असमानताओं के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की immunodominant पदानुक्रम दिखा व्यापक काम किया गया है. हालांकि, वहाँ कुछ 4 GVHD के विभिन्न चरणों के दौरान टी सेल सबसेट के लिए भूमिका के बारे में अस्पष्टता बनी हुई है. हमारी प्रयोगशाला से अप्रकाशित अध्ययन बताते हैं कि CD4 टी कोशिकाओं को जल्दी GVHD के दौरान एक प्रमुख भूमिका निभाघटनाओं, जबकि CD8 टी कोशिकाओं बाद में समय बिंदुओं पर हावी.
vivo में टी सेल संचय पैटर्न को ट्रैक करने की क्षमता एक शक्तिशाली उपकरण कि GVHD दौरान CD4 और CD8 टी सेल योगदान के बारे में hypotheses परीक्षण करने की क्षमता है है. जुगनू luciferase के लिए चूहे ट्रांसजेनिक शुरू में डॉ. रॉबर्ट 5 Negrin प्रयोगशाला में विकसित किए गए. उनके विधान luciferase अभिव्यक्ति की वजह से, इन दाता चूहों से कोशिकाओं को एक गैर इनवेसिव इमेजिंग तकनीक का उपयोग करते हुए 5 vivo में पता लगाया जा सकता है. इस मॉडल का एक और लाभ यह है कि व्यक्तिगत चूहों के समय पर नजर रखी जा सकती है. हालांकि, प्राप्तकर्ता चूहों के दोहराने इमेजिंग के बावजूद, प्राप्तकर्ताओं के बीच प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता बनी हुई है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, शरीर के कुल प्रवाह की सीमा 2.4 लाख और कम प्रवाह के साथ माउस माउस की तुलना में सबसे बड़ी प्रवाह के साथ शरीर के कुल प्रवाह के 60% से कम है. क्योंकि एक एकल luciferase transgene टीसी के लिए पर्याप्त हैपक्ष का पता लगाने, luciferase सकारात्मक तनाव आसानी से डबल ट्रांसजेनिक चूहों बनाने पैदा कर सकते हैं. हमारी प्रयोगशाला में अध्ययन को बढ़ावा देने के 6 GVHD Integrin CD103 के लिए एक भूमिका में दिखाया गया है. CD103 एक Integrin CD8 टी 7 कोशिकाओं और ligand ई cadherin है, जो चुनिंदा उपकला 8,9 कोशिकाओं पर व्यक्त की है पर व्यक्त की है. माउस कि व्यक्त luciferase प्रयोगों के लिए अनुमति देने के लिए आगे GVHD में CD103 की भूमिका के बारे में hypotheses परीक्षण करने में सक्षम है - एक CD103 / बनाना. प्रयोगात्मक तकनीक अंगों के बीच संचय पैटर्न का आकलन करने के लिए सीमित है. वैकल्पिक तकनीकों के लिए अलग - अलग अंगों के भीतर सेलुलर की तस्करी पैटर्न स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए. Bioluminescent इमेजिंग के साथ एक नैदानिक प्रासंगिक GVHD मॉडल युग्मन टी सेल तस्करी और अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद CD4 और CD8 टी कोशिकाओं के रिश्तेदार योगदान के कैनेटीक्स पर प्रकाश डाला में मदद मिलेगी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम ऐलिस Gaughan और जिओ Jing वैंग जिसका बकाया तकनीकी समर्थन, बौद्धिक इनपुट, और नैतिक समर्थन इन अध्ययनों को आगे बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी ऋणी हैं. इन अध्ययनों NIH अनुदान AI036532 गाह समर्थित थे.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
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