Summary
Murine trapianto di midollo osseo è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi immunologici che regolano graft-versus-host disease negli esseri umani. La capacità di monitorare il traffico delle cellule T modelli
Abstract
Graft-versus-host disease (GVHD) è la barriera che limita l'ampio utilizzo di trapianto di midollo osseo come terapia curativa per una serie di carenze ematologiche. GVHD è causata da cellule T mature alloreattive presenti nel trapianto midollo osseo che sono infuse nel ricevente e causare danni agli organi di accoglienza. Tuttavia, nei topi, cellule T deve essere aggiunto al inoculo midollo osseo a causare GVHD. Sebbene un ampio lavoro è stato fatto per caratterizzare le risposte delle cellule T dopo trapianto, bioluminescente tecnologia di imaging è un metodo non invasivo per monitorare il traffico delle cellule T modelli in vivo.
A seguito di irradiazione letale, topi riceventi sono trapiantati con cellule del midollo osseo e splenociti di topi donatori. Sottopopolazioni di cellule T da L2G85.B6 (topi transgenici che esprimono costitutivamente luciferasi) sono incluse nel trapianto. Da trapiantare solo alcune sottopopolazioni di cellule T, è in grado di monitorare specifici sottogruppi di cellule T in vivo,e in base alla loro posizione, sviluppare ipotesi sul ruolo di specifici sottogruppi di cellule T nel promuovere la GVHD in vari momenti. A intervalli predeterminati dopo il trapianto, topi riceventi vengono esposte con una Xenogen IVIS camera CCD. L'intensità della luce può essere quantificato utilizzando il software Image Vivere per generare una pseudo-immagine a colori in base all'intensità fotone (rosso = alta intensità, viola intensità = bassa).
Tra 4-7 dopo il trapianto giorni, topi riceventi cominciano a mostrare segni clinici di GVHD. Cooke et al. 1 messo a punto un sistema di valutazione per quantificare la progressione della malattia in base al destinatario pelliccia trama topi, l'integrità della pelle, attività, perdita di peso, e la postura. I topi sono segnati tutti i giorni, e l'eutanasia quando diventano moribondi. Topi riceventi diventano in genere moribondo 20-30 giorni dopo il trapianto.
Modelli murini sono strumenti preziosi per lo studio della immunologia di GVHD. Selettivamente il trapianto delle cellule T sottoinsiemi particolare alminimi per l'identificazione accurata dei ruoli ogni sottoinsieme gioca. Non invasivo di monitoraggio risposte delle cellule T in vivo aggiunge un ulteriore livello di valore per i modelli murini GVHD.
Protocol
1. Irradiazione letale
- Inserire fino a 10 topi riceventi in una gabbia microisolator compatibile con l'irradiatore da utilizzare.
- Irradiare in 2 dosi uguali sommatori dose totale (dose totale = 9 cGy per i destinatari BALB.B). Irraggiamento secondo dovrebbe essere di 3 ore dopo la prima. L'iniezione deve avvenire tra 4-6 ore dopo l'irradiazione finale. Topi irradiano in entrambi 137 sorgente Cs o RS2, 000, irradiatore.
- Dopo la seconda dose di radiazioni, i topi in gabbia negozio microisolator con acqua acidificata fino al momento del trapianto.
2. Preparazione Splenocyte
- Eutanasia un topo donatore secondo le linee guida istituzionali. Ogni donatore produce generalmente 75x10 6 - 125x10 6 splenociti. Utilizzando CD8 kit di purificazione, ciascun topo produce generalmente 6x10 6 - 12x10 6 cellule T CD8.
- Rimuovere la milza facendo prima una verticale 2 centimetri di incisione 2 centimetri a destra della linea mediana direttamentesotto la gabbia toracica. Tagliare la pelliccia, la pelle, e la membrana viscerale.
- Rimuovere milza e creare singola sospensione cellulare mettendo milza in 40 microlitri mesh in una piastra di Petri con RPMI 1640 con 5% di FBS. Utilizzare un stantuffo della siringa per spezzare la milza fino a quando la milza intero è stato passato attraverso mesh.
- Ripetere questa procedura per ogni WT e L2G85.B6 donatore. Raccogliere tutte le sospensioni WT monocellulari in 1-50 ml tubetto conico, e raccogliere tutte le L2G85.B6 sospensioni di cellule singole in un apposito tubo da 50 ml.
- Centrifugare le cellule a 1.200 rpm per 10 minuti a 4 ° C. Risospendere pellet in RPMI 1640 con 5% di FBS e le cellule di conteggio.
3. Preparazione di midollo osseo
- Togliere la pelle da una dell'arto posteriore di un topo donatore.
- Tagliare con cautela via come tessuto muscolare più possibile da femore e tibia / perone.
- Rimuovere dell'arto posteriore, tagliando via al femore dell'anca. Tagliare zampa posteriore appena sotto tibia / perone intersezione. Tutti i tagli ossei devono essere effettuate utilizzando le forbici robuste.
- Rimuovere con cautela la restante tessuto muscolare. Tagliare perone-relativamente poco midollo osseo si trova in fibula e non vale la pena.
- Mettere arto posteriore a freddo RPMI 1640 5% FBS processo e ripetere con la seconda parte posteriore. Ogni mouse dovrebbe produrre tra 20x10 6 - 40x10 6 cellule del midollo osseo.
4. Midollo osseo rimozione
- Rimuovere un arto posteriore da un supporto e mettere in grande piastra di Petri con una piccola quantità di supporti a freddo (~ 1 ml).
- Tagliare l'articolazione del ginocchio. Utilizzando una siringa (volume> 5 ml), inserire l'ago sottocutanea a tibia e deprimere siringa finché tutto il materiale rosso viene rimosso dall'interno della tibia. Ripetere il processo con il femore. Eliminare le ossa rimaste prive di midollo osseo. Ripetere il processo con il secondo degli arti posteriori.
- Crea singola sospensione cellulare da parte dei media di pipettaggio contenenti midollo osseo in grande piastra di Petri e stantuffo della siringa uso e 40 microlitrimaglia dello schermo. Pipettare sospensione singola cellula in tubo da 50 ml conica e tenere in ghiaccio.
5. CD3 esaurimento
Ci sono una varietà di modi per riducono cellule CD3 + dal midollo osseo. Il nostro laboratorio utilizza un kit composto da Miltenyi Biotec (CD3-biotina - 130-093-021). Riducono cellule CD3 + nel midollo osseo seguendo il protocollo del produttore. Il buffer per i kit Miltenyi sarà ora in poi denominato MACS Buffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA in PBS, pH 7,2).
- Lavare le cellule per centrifugazione splenociti e le cellule del midollo osseo a 1200 rpm per 10 min a 4 ° C e cellule conteggio.
- Rimuovi tutto il surnatante. Risospendere le cellule del midollo osseo in 100 pl per le cellule ossee 10000000 midollo in Buffer MACS.
- Continuare con CD3 esaurimento produce utilizzando il protocollo '.
- Lavare CD3 impoverito cellule del midollo osseo 3 volte in PBS sterile. Conte CD3 impoverito cellule del midollo osseo e risospendere in un volume adeguato di iniettare 10 7 cellule.
Ci sono una varietà di modi per purificare le cellule T CD8 da L2G85.B6 topi. Inoltre, ci sono diversi modi per riducono le cellule T CD8 da WT donatori splenocyte. Il nostro laboratorio utilizza i kit da Miltenyi Biotec (CD8 esaurimento - 130-049-401, CD8 purificazione - 130-095-236).
- Risospendere il pellet in 90 WT Buffer MACS microlitri per 10 7 cellule. Continuare con deplezione delle cellule T CD8 secondo produce 'protocollo (CD8 esaurimento - 130-049-401).
- Risospendere il pellet L2G85.B6 in 40 microlitri di buffer MACS per 10 7 cellule. Continuare con la purificazione delle cellule T CD8 secondo produce 'protocollo (CD8 depurazione - 130-095-236).
- Contare ogni popolazione di cellule e lavare ogni popolazione 3 volte con PBS sterile. Risospendere ogni popolazione in volume sufficiente per iniettare 18x10 6 WT (CD8 impoverito) splenociti e 2x10 6 L2G85.B6 purificato le cellule T CD8.
7. Iniezione di preparazione
- Combinare 10 7 CD3 impoverito cellule di midollo osseo, 18x10 6 WT (CD8 impoverito) splenociti e 2x10 6 L2G85.B6 purificate cellule T CD8 in una provetta da microcentrifuga. Lavare con PBS sterile e risospendere in 300 microlitri.
- Iniettare il preparato cellulare nella vena della coda di topi riceventi. Le iniezioni devono essere fatto utilizzando aghi di calibro 28.
- Conservare i topi in gabbia microisolator con acqua acidulata. Topi punteggio giornaliero con sistema di punteggio GVHD scoring sviluppato da Cooke et al 1.
8. Bioluminescent Imaging
- Sei giorni dopo il trapianto, iniettare topi riceventi con 4 mg di D-luciferina. 5 minuti per consentire di reagire con luciferina luciferasi.
- Anestetizzare il mouse nella camera di isoflurano imager bioluminescenza e dei beneficiari immagine per 5 min con binning piccolo. Questo creerà una immagine ad alta risoluzione, mentre la raccolta di quanti più eventi possibili.
- Analizzare i dati con LivingImmagine software. La scala di pseudo-immagine a colori può essere modificato per ottenere i migliori risultati. Tuttavia, è essenziale che la stessa scala da utilizzare in tutti gli esperimenti.
- Regioni di interesse possono essere creati utilizzando il software Image vita e di emittanza luce può essere quantificata calcolando il flusso (fotoni / sec) essendo emessa da ciascuna regione di interesse.
9. Risultati rappresentativi
Circa 7-10 giorni dopo il trapianto, i topi cominciano a mostrare segni clinici di GVHD. I topi sembrano trasandato a causa della mancanza di governare. Destinatari inizierà anche a perdere peso dopo il trapianto tra 7-10 giorni. Attività e la postura dei topi riceventi rimarrà relativamente normale fino a circa 12-14 giorni dopo il trapianto. Punteggi cumulativi GVHD saranno costantemente migliorate attraverso il primo 2-3 dopo il trapianto settimane (Figura 1A). Il decorso della malattia è molto variabile tra i topi, tuttavia, i beneficiari dovrebbero uniformemente soccombere alla GVHD del 30-40 days dopo il trapianto (Figura 1B).
La Figura 2 mostra topi riceventi che sono stati impressi sei giorni dopo il trapianto. Pseudo-color scala mostra diverse emittanza luce in tutto il corpo con la massima intensità di luce emessa nella milza e l'intestino. Cellule T CD8 accumulo nell'intestino è coerente con i risultati precedenti 6. Topi riceventi può essere rimesso in gabbia microisolator da acquisire in un secondo momento o punto di eutanasia per l'imaging ex vivo.
| Criteri | Grado 0 | Grade 1 | Grado 2 |
| Perdita di peso (wkly.) | <10% | > 10% - <25% | > 25% |
| Posizione | Normale | Incurvando solo a riposo | Diversi incurvando; altera movement |
| Attività | Normale | Da lieve a moderata diminuzione dell'attività | Stazionario a meno stimolato |
| Pelliccia tessitura | Normale | Da lieve a moderata scompigliava | Arruffarsi Grave / poveri grooming |
| Struttura della pelle | Normale | Scala di zampe / coda | Evidenti aree di pelle denudata |
Tabella 1. Cooke et al ha sviluppato questo sistema di punteggio nel 1996 1. I topi, deve essere catalogato ogni giorno su ciascuno dei criteri a sinistra. Ogni mouse viene dato un punteggio di 0-2 per ciascun criterio e il punteggio totale è la somma di tutti i punteggi individuali.
Figura 1. Letale BALB.B irradiati sono stati trapiantati con 10 7 ossocellule del midollo da soli o con 18x10 6 cellule T CD8 splenociti impoverito WT e 2x10 6 purificate L2G85.B6 cellule T CD8. A) Dati clinici punteggio dei destinatari di midollo osseo da solo o con cellule T CD8 impoverito splenociti WT e purificato L2G85.B6 cellule T CD8. B) I dati di sopravvivenza dei destinatari di midollo osseo da solo o con cellule T CD8 impoverito splenociti WT e purificato L2G85.B6 cellule T CD8. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. BALB.B topi letalmente irradiati sono stati trapiantati con 10 cellule di midollo osseo 7 da soli o con 18x10 6 cellule T CD8 splenociti impoverito WT e 2x10 6 purificate L2G85.B6 cellule T CD8. Destinatari sono stati iniettati con 4 mg D-luciferina tramite iniezione intraperitoneale e sono stati ripresi utilizzando IVIS Xenogen per 5 min a binning piccola. Pseudo di colore le immagini vengono visualizzate in cui viola rappresenta bassa intensità e rosso rappresenta regioni ad alta intensità di interesse sono stati elaborati intorno tutto il mouse e il flusso totale (fotoni / sec) sono stati quantificati.
Figura 3. BALB.B topi letalmente irradiati sono stati trapiantati con 10 cellule di midollo osseo 7 da soli o con 18x10 6 cellule T CD8 splenociti impoverito WT e 2x10 6 purificate L2G85.B6 cellule T CD8. Destinatari sono stati iniettati con 4 mg D-luciferina tramite iniezione intraperitoneale e sono stati ripresi utilizzando IVIS Xenogen per 5 min a binning piccola. Pseudo-color immagini vengono visualizzate in cui viola rappresenta bassa intensità e rosso rappresenta ad alta intensità. I destinatari sono stati ripreso su A) giorno 4, B) giorno 6, e C) giorno 8 vaglia postale.
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Discussion
Il protocollo per indurre GVHD nei topi qui presentato rappresenta un modello clinicamente rilevante di GVHD murino. Fondato da Berger et al. Nel 1994, il C57Bl / 6 in combinazione ceppo BALB.B è MHC-abbinato, con una mortalità GVHD mediata da CD4, CD8 dipendenti effettori T 2, molto simili allo scenario clinico più comune 3. E 'noto che trapiantando cellule T CD8 sola non causa GVHD in questo modello, tuttavia, la progressione della malattia è significativamente peggiore quando sia CD4 e CD8 T sono presenti rispetto a cellule T CD4 soli. Inoltre, vi è stato un ampio lavoro che mostra la gerarchia immunodominante della risposta immunitaria a disparità istocompatibilità minori in questo modello 10. Tuttavia, rimane una certa ambiguità per quanto riguarda i ruoli per i sottogruppi di cellule T durante le diverse fasi di GVHD 4. Studi inediti nostro laboratorio suggeriscono che le cellule T CD4 hanno un ruolo dominante durante la GVHD prestoeventi, mentre le cellule T CD8 dominano in momenti successivi.
La possibilità di tenere traccia delle cellule T modelli di accumulo in vivo è un potente strumento che ha il potenziale per verificare ipotesi riguardanti CD4 e CD8 contributi delle cellule T durante la GVHD. I topi transgenici per la lucciola luciferasi sono state inizialmente sviluppate nel laboratorio del Dr. Robert Negrin 5. A causa della loro espressione costitutiva luciferasi, queste cellule da topi donatori possono essere monitorati in vivo utilizzando una tecnica non invasiva di imaging 5. Un altro vantaggio di questo modello è che singoli topi può essere monitorata nel tempo. Tuttavia, nonostante l'imaging ripetizione di topi riceventi, resta variabilità sperimentale tra i beneficiari. Come mostrato in figura 2, la gamma di flusso totale del corpo è 2,4 milioni e il mouse con il più basso flusso ha meno del 60% del flusso totale del corpo del mouse con il massimo flusso. Poiché un singolo transgene luciferasi è adeguato per Tcell rilevamento, il ceppo positivo luciferasi può essere facilmente allevati per creare topi doppi transgenici. Studi nel nostro laboratorio hanno dimostrato un ruolo per il CD103 integrina nel promuovere GVHD 6. CD103 è un integrina espressa su cellule T CD8 7 e il ligando è E-caderina, che è selettivamente espresso sulle cellule epiteliali 8,9. Creazione di un CD103-/ - topo che è in grado di esprimere luciferasi consentirà esperimenti per verificare ulteriori ipotesi sul ruolo di CD103 in GVHD. Questa tecnica sperimentale è limitato a valutare i modelli di accumulazione tra organi. Tecniche alternative devono essere utilizzati per spiegare i modelli di traffico cellulari all'interno di singoli organi. Inserimento di un modello clinicamente rilevante con GVHD bioluminescente immagini aiuteranno a far luce sulla cinetica del traffico delle cellule T e contributi relativi delle cellule CD4 e CD8 T successivi al trapianto di midollo osseo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Siamo in debito con Alice Gaughan e-Jiao Jing Wang cui eccellente supporto tecnico, apporto intellettuale, e sostegno morale hanno contribuito a spostare in avanti questi studi. Questi studi sono stati sostenuti dalla concessione NIH AI036532 a GAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
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