Summary
O transplante de medula óssea murina é uma técnica amplamente utilizada para estudar os mecanismos imunológicos que regem enxerto-versus-hospedeiro da doença em seres humanos. A capacidade de monitorar padrões de tráfico de células T
Abstract
Enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) é a barreira limitante à ampla utilização de transplante de medula óssea como uma terapia curativa para uma variedade de deficiências hematológicas. GVHD é causada por células T maduras alorreactivas presentes no enxerto de medula óssea que são infundidas no receptor e causar danos aos órgãos de acolhimento. No entanto, em ratinhos, as células T deve ser adicionado ao inoculo de medula óssea para causar GVHD. Apesar de extenso trabalho tem sido feito para caracterizar células T após o transplante respostas, bioluminescente tecnologia de imagem é um método não-invasivo para monitorar padrões de tráfico de células T in vivo.
Após irradiação letal, ratinhos receptores foram transplantados com células de medula óssea e de esplenócitos de ratinhos dadores. Subconjuntos de células T a partir de L2G85.B6 (ratinhos transgénicos que expressam constitutivamente luciferase) estão incluídos no transplante. Por apenas transplantar certos subgrupos de células T, um é capaz de rastrear específicas subpopulações de células T in vivo,e com base na sua localização, desenvolver hipóteses sobre o papel das subpopulações de células T específicas para a promoção GVHD em vários pontos temporais. No transplante predeterminado intervalos post, ratos receptores são fotografada usando um Xenogen IVIS câmera CCD. A intensidade da luz pode ser quantificado usando software imagem viva para gerar uma imagem pseudo-cor com base na intensidade de fótons (vermelho = intensidade alta, violeta = intensidade baixa).
Entre 4-7 dias após o transplante, os ratos receptores começam a apresentar sinais clínicos da GVHD. Cooke et al. 1 desenvolveu um sistema de pontuação para quantificar a progressão da doença com base na textura da pele destinatário ratos, a integridade da pele, atividade, perda de peso e postura. Os ratinhos são marcados diariamente, e sacrificados quando se tornam moribundo. Ratinhos receptores tornam-se geralmente moribundo 20-30 pós-transplante dias.
Modelos murinos são ferramentas valiosas para o estudo da imunologia da GVHD. Seletivamente transplante especial de células T subconjuntos almínimos para identificação cuidadosa dos papéis de cada subconjunto joga. De forma não invasiva de rastreamento respostas de células T in vivo adiciona outra camada de valor para modelos murinos de GVHD.
Protocol
1. A irradiação letal
- Colocar-se a 10 ratinhos receptores em uma gaiola microisolator compatível com o irradiador de ser usado.
- Irradiar em 2 doses iguais somando dose total (dose total = 9 cGy para receptores BALB.B). Irradiação segundo deve ser de 3 horas após a primeira. A injecção deve ocorrer entre 4-6 horas após a irradiação final. Irradiar ratos em qualquer fonte de 137 Cs ou RS2, 000 irradiador,.
- Após a segunda dose de radiação ratos, armazenar em gaiola microisolator com água acidificada até o momento do transplante.
2. Preparação esplenócitos
- Euthanize um camundongo doador acordo com as diretrizes institucionais. Cada dador geralmente produz 75x10 6 - 125x10 6 esplenócitos. Utilizando kits de purificação de CD8, cada rato geralmente produz 6x10 6 - 12x10 6 células T CD8.
- Remover o baço fazendo primeiro um verticais 2 centímetros de incisão direita 2 centímetros da linha mediana directamentesob a caixa torácica. Cortar através da pele, pele, membrana e visceral.
- Remover o baço e criar suspensão de células individuais através da colocação do baço em 40 ul de tela de malha em uma placa de Petri com meio RPMI 1640 com FBS a 5%. Usar um êmbolo da seringa para quebrar o baço até ao baço inteiro foi passado através de peneiro de malha.
- Repita esse processo para cada WT e L2G85.B6 doador. Recolher todos os WT suspensões de células individuais em tubo 1-50 ml, e recolher todos os L2G85.B6 suspensões de células individuais em um tubo separado 50 ml.
- Centrifugar as células a 1.200 rpm durante 10 min a 4 ° C. Pelotas Ressuspender em 1640 RPMI com 5% de FBS e contagem de células.
3. Preparação de Medula Óssea
- Remover a pele de um membro posterior de um rato dador.
- Cortar cuidadosamente como tecido muscular máximo possível de fêmur e tíbia / fíbula.
- Remover membro posterior cortando fêmur afastado na articulação do quadril. Cortar pata traseira, logo abaixo da tíbia / fíbula intersecção. Todos os cortes ósseos, deve ser feita com uma tesoura resistente.
- Remova cuidadosamente qualquer tecido do músculo restante. Corte-fíbula relativamente pouco medula óssea é encontrada na fíbula e não vale a pena o esforço.
- Coloque membro posterior no frio 1640 RPMI processo FBS e repita 5% com a segunda parte traseira. Cada rato deve render entre 6 20x10 - 40x10 6 células da medula óssea.
4. Remoção de Medula Óssea
- Remover um membro posterior da mídia e coloque em placa de Petri grande com uma pequena quantidade de meios frios (~ 1 ml).
- Cortar a articulação do joelho. Utilizando uma seringa (volume de ml> 5), a inserção da agulha subcutâneo na tíbia e deprimir seringa até que todo o material é removido do vermelho interior da tíbia. Repita o processo com o fêmur. Descartar ossos restantes desprovidos de medula óssea. Repita o processo com o segundo membro posterior.
- Criar suspensão de células individuais por meio de pipetagem contendo medula óssea em placas de Petri e grande utilização êmbolo da seringa e 40 ulmalha da tela. Pipetar única suspensão de células em 50 ml de tubo cónico e manter em gelo.
5. CD3 Esgotamento
Há uma variedade de maneiras para empobrecem células CD3 + a partir de medula óssea. O nosso laboratório utiliza um kit fabricado por Miltenyi Biotec (CD3-biotina - 130-093-021). Empobrecem células CD3 + a partir de medula óssea após o protocolo do fabricante. O tampão para os kits de Miltenyi será daqui em diante chamado de buffer MACS (2 mM de EDTA, 0,5% de BSA em PBS, pH 7,2).
- Lave as células por centrifugação esplenócitos e células da medula óssea a 1200 rpm durante 10 min a 4 ° C as células e contagem.
- Remover ALL sobrenadante. Ressuspender as células ósseas medula em 100 ul por 10 milhões de células de medula óssea em tampão MACS.
- Continue com CD3 esgotamento usando fabrica protocolo ".
- Lavar CD3 depletados de células da medula óssea 3 vezes em PBS estéril. Contagem de CD3 empobrecido células da medula óssea e ressuspender em um volume apropriado de injectar 10 7 células.
Há uma variedade de maneiras de purificar a partir de células T CD8 L2G85.B6 ratos. Além disso, existem várias maneiras de destroem as células T CD8 a partir de doadores de esplenócitos WT. Nosso laboratório utiliza kits de Miltenyi Biotec (CD8 exaustão - 130-049-401, CD8 purificação - 130-095-236).
- Ressuspender o sedimento em 90 WT Tampão MACS ul por 10 7 células. Continue com depleção de células T CD8 de acordo com a fabrica "protocolo (CD8 exaustão - 130-049-401).
- Ressuspender o sedimento em 40 L2G85.B6 Tampão MACS ul por 10 7 células. Continue com CD8 purificação de células T de acordo com a fabrica "protocolo (CD8 purificação - 130-095-236).
- Contar cada população de células e lava-se cada população 3 vezes com PBS estéril. Ressuspender cada população em volume adequado para injectar 18x10 6 WT (CD8 empobrecido) e esplenócitos de 2x10 6 L2G85.B6 purificado células T CD8.
7. Preparação de injecção
- Combinar 10 7 células CD3 ósseas empobrecido medulas, 18x10 6 WT (CD8 empobrecido) e esplenócitos de 2x10 6 L2G85.B6 células T CD8 purificadas num tubo de microcentrífuga. Lavar com PBS estéril e ressuspender em 300 ul.
- Injectar preparação de células para dentro da veia da cauda dos ratos receptores. As injeções devem ser feitas usando agulhas de calibre 28.
- Loja ratos na gaiola microisolator com água acidificada. Camundongos pontuação diária usando pontuação sistema de pontuação GVHD desenvolvido por Cooke et al 1.
8. Bioluminescent imagem
- Seis dias após o transplante, injectar ratinhos receptores com 4 mg de D-luciferina. 5 min para permitir que a luciferina a reagir com a luciferase.
- Anestesiar mouse na câmara de isoflurano de imageador bioluminescência e receptores de imagem por 5 minutos com binning pequeno. Isto irá criar uma imagem de alta resolução durante a coleta de tantos eventos quanto possível.
- Analisar dados usando VivoSoftware de imagem. A escala da imagem pseudo-cor pode ser alterado para se obter os melhores resultados. No entanto, é imperativo que a mesma escala ser usados em experimentos.
- As regiões de interesse podem ser criados utilizando o software de imagem e de estar emitância luminosa pode ser quantificada por cálculo do fluxo (fotões / sec) a ser emitida a partir de cada região de interesse.
9. Resultados representativos
Cerca de 7-10 dias após o transplante, os ratos começam a mostrar sinais clínicos da GVHD. Ratos aparecer desalinhado devido à falta de higiene. Os destinatários também vai começar a perder peso entre 7-10 dias após o transplante. Atividade e postura de ratos receptores permanecerão relativamente normal até pós-transplante aproximadamente 12-14 dias. Cumulativos pontuações GVHD irá aumentar gradualmente através do primeiro transplante pós 2-3 semanas (Figura 1A). Curso da doença é bastante variável entre os ratos, no entanto, os destinatários devem uniformemente sucumbir a DECH por d 30-40ays após o transplante (Figura 1B).
A Figura 2 mostra que os ratinhos receptores foram fotografados 6 após o transplante dias. Pseudo-colorida escala mostra variando emitância luz em todo o corpo, com a maior intensidade de luz a ser emitida no baço e no intestino. CD8 acumulação de células T no intestino é consistente com descobertas anteriores 6. Ratinhos receptores podem ser colocados de volta na gaiola microisolator a ser trabalhada em um ponto de tempo posterior, ou sacrificados por ex imagiologia in vivo.
| Critérios | Grau 0 | Grau 1 | Grau 2 |
| Perda de peso (wkly.) | <10% | > 10% - <25% | > 25% |
| Postura | Normal | Hunching apenas em repouso | Hunching várias; prejudica movement |
| Atividade | Normal | Ligeira a moderada diminuição de actividade | Estacionário, a menos que estimulou |
| Textura da pele | Normal | Leve a moderada despenteando | Ruffling grave / preparação pobres |
| A textura da pele | Normal | Escala de patas / cauda | Áreas óbvias de pele desnudada |
Tabela 1. Cooke et al desenvolveram esse sistema de pontuação em 1996 1. Mice deve ser marcado diário em cada um dos critérios sobre a esquerda. Cada mouse é atribuída uma pontuação de 0-2 para cada critério ea pontuação total é a soma de todas as pontuações individuais.
Figura 1. Letalmente irradiados foram transplantados BALB.B com 10 7 ossoAs células da medula sozinho ou com 18x10 6 células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e 2x10 6 purificadas L2G85.B6 células T CD8. A) Os dados clínicos de pontuação receptores de medula óssea, isoladamente ou com células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e purificado L2G85.B6 células T CD8. B) Os dados da sobrevivência de receptores de medula óssea sozinho ou com células T CD8 esgotado esplenócitos WT e purificado L2G85.B6 células T CD8. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Ratinhos BALB.B letalmente irradiados foram transplantados com 10 7 células de medula óssea por si só ou com 18x10 6 células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e 2x10 6 purificadas L2G85.B6 células T CD8. Os receptores foram injectados com 4 mg de D-luciferina, por injecção intraperitoneal e foram fotografadas usando IVIS Xenogen durante 5 min a binning pequena. Pseudo cor-de-imagens são mostradas em roxo representa baixa intensidade e vermelha representa Regiões de alta intensidade de interesse foram desenhada ao redor do rato inteiro e fluxo total (fótons / s) foram quantificadas.
Figura 3. Ratinhos BALB.B letalmente irradiados foram transplantados com 10 7 células de medula óssea por si só ou com 18x10 6 células T CD8 esgotadas esplenócitos WT e 2x10 6 purificadas L2G85.B6 células T CD8. Os receptores foram injectados com 4 mg de D-luciferina, por injecção intraperitoneal e foram fotografadas usando IVIS Xenogen durante 5 min a binning pequena. Pseudo-coloridas imagens são mostradas em roxo representa baixa intensidade e vermelha representa alta intensidade. Os destinatários foram fotografadas em um dia) 4, B) dia 6, e C) dias após transferência 8.
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Discussion
O protocolo para a indução de GVHD em ratinhos apresentados aqui representa um modelo clinicamente relevante da GVHD de murino. Originalmente criado por Berger et al., Em 1994, o C57Bl / 6 em BALB.B combinação estirpe é MHC-combinado, com mortalidade DECH mediada por CD4, CD8 dependentes efetores T 2, altamente semelhantes ao cenário clínico mais comum 3. Sabe-se que o transplante de células T CD8 sozinho não causar GVHD neste modelo, no entanto, a progressão da doença é significativamente pior quando CD4 e CD8 das células T estão presentes, em comparação com as células T CD4 por si só. Além disso, tem havido um extenso trabalho mostrando a hierarquia imunodominante da resposta imune às disparidades de histocompatibilidade menor neste modelo 10. No entanto, ainda há alguma ambiguidade sobre as funções para subpopulações de células T durante as diferentes fases de GVHD 4. Estudos não publicados de nosso laboratório sugerem que as células T CD4 desempenham um papel dominante durante GVHD cedoeventos, enquanto células T CD8 dominam a pontos de tempo posteriores.
A capacidade de controlar os padrões de acumulação de células T in vivo é uma ferramenta poderosa que tem o potencial para testar hipóteses sobre CD4 e CD8 contribuições de células T durante GVHD. Camundongos transgênicos para firefly luciferase foram inicialmente desenvolvidos no laboratório do Dr. Robert Negrin 5. Por causa da sua expressão constitutiva de luciferase, as células de ratinhos dadores estas podem ser rastreadas in vivo usando uma técnica de imagem não invasiva 5. Uma outra vantagem deste modelo é que ratinhos individuais pode ser monitorizado ao longo do tempo. No entanto, apesar de imagiologia de repetição de ratinhos receptores, continua a existir a variabilidade experimental entre receptores. Como mostrado na Figura 2, o intervalo de fluxo total do corpo é de 2,4 milhões e o rato com o menor fluxo tem menos do que 60% do fluxo total do corpo do que o rato com o maior fluxo. Uma vez que um único transgene luciferase é adequado para Tcdetecção ell, a tensão positiva da luciferase pode ser facilmente criados para criar ratos transgénicos duplos. Estudos em nosso laboratório mostraram um papel para a integrina na promoção CD103 GVHD 6. CD103 é uma integrina expressa em células T CD8 7 e o ligando é a E-caderina, que é selectivamente expresso em células epiteliais 8,9. Criando uma CD103-/ - de rato, que é capaz de expressar luciferase permitirão experiências para testar hipóteses futuras sobre o papel de CD103 em GVHD. Esta técnica experimental é limitada para avaliar padrões de acumulação entre órgãos. Técnicas alternativas devem ser utilizadas para elucidar padrões de tráfico celulares dentro de órgãos individuais. Acoplamento de um modelo clinicamente relevante GVHD com bioluminescente de imagem vai ajudar a lançar luz sobre a cinética da T tráfico de celular e contribuições relativas de CD4 e células T CD8 após o transplante de medula óssea.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Somos gratos a Alice Gaughan e Jiao Wang Jing-cujo saldo suporte técnico, contribuição intelectual, e apoio moral foram fundamentais para mover esses estudos à frente. Estes estudos foram apoiados pela concessão NIH AI036532 para GAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Cooke, K. R. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Berger, M. T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens. Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).
- Nimer, S. D. Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial. Transplantation. 57, 82-87 (1994).
- Korngold, R., Sprent, J. Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences. Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).
- Cao, Y. A. Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation. Transplantation. 80, 134-139 (2005).
- Asady, R. E. l TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease. J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).
- Karecla, P. I. Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7). Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).
- Cepek, K. L. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin. Nature. 372, 190-193 (1994).
- Malarkannan, S. The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60. J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).
