Summary
Murin benmärgstransplantation är en allmänt använd teknik för att studera immunologiska mekanismer som styr transplantat-mot-värd-sjukdom hos människor. Förmågan att övervaka T-cell mönster människohandel
Abstract
Graft-versus-värd-sjukdom (GVHD) är den begränsande hinder för den breda användningen av benmärgstransplantation som en botande terapi för en mängd hematologiska brister. GVHD orsakas av mogna alloreaktiva T-celler närvarande i benmärgen transplantat som infunderas i mottagaren och orsakar skador på organ värd. Emellertid, i möss, måste T-celler till benmärgen inokulum att orsaka GVHD. Även omfattande arbete har gjorts för att karakterisera T-cell svar efter transplantation är bioluminescent bildteknik en icke-invasiv metod för att övervaka T mönster cell handel in vivo.
Efter dödlig bestrålning, är mottagande möss transplanteras med benmärgsceller och splenocyter från donatormöss. T-cell-undergrupper från L2G85.B6 (transgena möss som konstitutivt uttrycker luciferas) ingår i transplantatet. Genom att bara transplantera vissa T-cell undergrupper är en möjlighet att spåra specifika T-celler undergrupper in vivo,och baserat på deras placering, utveckla hypoteser om betydelsen av specifika T-cell undergrupper för att främja GVHD vid olika tidpunkter. Vid förutbestämda intervaller efter transplantation är mottagande möss avbildas med en Xenogen IVIS CCD-kamera. Ljusintensiteten kan kvantifieras med hjälp av programvara Living Image för att generera en pseudo-färgbild baserad på foton intensitet (röd = hög intensitet, violett = låg intensitet).
Mellan 4-7 dagar efter transplantationen, mottagande möss börja visa kliniska tecken på GVHD. Cooke et al. 1 utvecklat ett poängsystem för att kvantifiera sjukdomsprogression baserat på mottagaren möss päls textur, hud integritet, aktivitet, viktminskning, och kroppshållning. Möss gjorde dagligen och avlivades när de blir döende. Mottagare möss blivit allmänt döende 20-30 dagar efter transplantationen.
Musmodeller är värdefulla verktyg för att studera immunologi GVHD. Selektivt transplantera synnerhet T-cell undergrupper albottenrekord för noggrann identifiering av rollerna varje delmängd spelar. Icke-invasivt spåra T-cellsvar in vivo lägger ytterligare ett lager av värde för murina GVHD modeller.
Protocol
1. Dödlig bestrålning
- Placera upp till 10 mottagande möss i en bur microisolator kompatibel med bestrålningsanordningen som skall användas.
- Bestråla i 2 lika stora doser summerande total dos (total dos = 9 cGy för BALB.B mottagare). Andra bestrålning ska vara 3 timmar efter första. Injektion skall ske mellan 4-6 timmar efter den slutliga bestrålning. Bestråla möss i antingen Cs 137 källa eller RS2, 000, bestrålningsanordningen.
- Efter den andra stråldos, lagra möss i microisolator bur med surgjort vatten tills tiden för transplantation.
2. Splenocyt Förberedelser
- Avliva en donator mus enligt lokala behandlingsrekommendationer. Varje givare ger i allmänhet 75x10 6 - 125x10 6 splenocyter. Använda CD8 rening kit, ger varje mus allmänhet 6x10 6 - 12x10 6 CD8 T-celler.
- Ta bort mjälten genom att först göra en vertikal 2 cm snitt 2 cm höger om mittlinjen direktunder bröstkorgen. Skär igenom päls, skinn och visceral membran.
- Avlägsna mjälten och skapa enkelcellsuspension genom att placera mjälte i 40 pl mesh i en petriskål med 1640 RPMI med 5% FBS. Använd en sprutkolv att bryta isär mjälten tills hela mjälten har passerat genom mesh sikt.
- Upprepa processen för varje WT och L2G85.B6 donator. Samla alla WT enkelcellsuspensioner i 1-50 ml koniskt rör och samla alla L2G85.B6 enkelcellsuspensioner i en separat 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera cellerna vid 1.200 rpm under 10 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera pellets i 1640 RPMI med 5% FBS och cellerna räknas.
3. Benmärg Beredning
- Ta huden från en bakre delen av en donator mus.
- Skär försiktigt bort så mycket muskelvävnad som möjligt från lårben och skenben / vadben.
- Ta bakbenen genom att skära lårbenet bort på höftleden. Klipp bort bakre tassen nedanför skenben / vadben korsningen. Alla ben nedskärningar bör göras med stadiga sax.
- Ta försiktigt bort eventuellt kvarvarande muskelvävnad. Skär av vadben-relativt lite benmärg finns i fibula och inte värt ansträngningen.
- Placera bakben i kall RPMI 1640 5% FBS och upprepa processen med den andra bakbenet. Varje mus ska ge mellan 20x10 6 - 40x10 6 benmärgsceller.
4. Bone Marrow Borttagning
- Ta en bakbenet från media och placera i stora Petriskål med en liten mängd kallt medium (~ 1 ml).
- Skär bort knäleden. Med hjälp av en spruta (volym> 5 ml), insats subkutan nål i skenbenet och tryck sprutan tills all röda materialet avlägsnas från insidan av skenbenet. Upprepa processen med lårbenet. Kassera återstående ben saknar benmärg. Upprepa processen med andra bakbenet.
- Skapa enkelcellsuspension genom att pipettera media som innehåller benmärg i stora petriskål och användning sprutkolven och 40 plmesh sikt. Pipettera enda cellsuspension i 50 ml koniskt rör och hålla på is.
5. CD3 Avskrivningar
Det finns en mängd olika sätt att bryter CD3 +-celler från benmärgen. Vår labb använder ett kit från Miltenyi Biotec (CD3-biotin - 130-093-021). Bryter CD3 + celler från benmärgen efter tillverkarens protokoll. Bufferten för Miltenyi kit kommer hädanefter att kallas MACS Buffert (2 mM EDTA, 0,5% BSA i PBS, pH 7,2).
- Tvätta cellerna genom centrifugering splenocyter och benmärgsceller vid 1200 rpm under 10 min vid 4 ° C och räkna celler.
- Ta bort alla supernatanten. Återsuspendera benmärgsceller i 100 pl per 10 miljoner benmärgsceller i MACS buffert.
- Fortsätt med CD3 utarmning med tillverkar-protokollet.
- Tvätta CD3 utarmade benmärgsceller 3 gånger i steril PBS. Greve CD3 utarmade benmärgsceller och återsuspendera vid en lämplig volym för att injicera 10 7 celler.
Det finns en mängd olika sätt att rena CD8 T-celler från möss L2G85.B6. Dessutom finns det flera sätt att bryter CD8 T-celler från WT splenocyt donatorer. Vår labb använder kit från Miltenyi Biotec (CD8 utarmning - 130-049-401, CD8 rening - 130-095-236).
- Resuspendera WT pelleten i 90 pl MACS buffert per 10 7 celler. Fortsätt med CD8 T-cell utarmning enligt tillverkar "-protokollet (CD8 utarmning - 130-049-401).
- Resuspendera L2G85.B6 pelleten i 40 pl MACS buffert per 10 7 celler. Fortsätt med CD8 T-cell rening enligt tillverkar "-protokollet (CD8 rening - 130-095-236).
- Räkna varje cellpopulation och tvätta varje population 3 gånger med steril PBS. Resuspendera varje population i lämplig volym för att injicera 18x10 6 WT (CD8 utarmat) splenocyter och 2x10 6 L2G85.B6 renade CD8 T-celler.
7. Injektion Beredning
- Kombinera 10 7 CD3 utarmade benmärgsceller, 18x10 6 WT (CD8 utarmat) splenocyter, och 2x10 6 L2G85.B6 renade CD8 T-celler i ett mikrocentrifugrör. Tvätta med steril PBS och återsuspendera i 300 pl.
- Injicera cellberedningen i svansvenen av mottagande möss. Injektioner bör göras med 28 nålar.
- Förvara möss i microisolator bur med surgjort vatten. Betyg möss med daglig poängsystem GVHD poängsystem utvecklats av Cooke et al 1.
8. Bioluminescent Imaging
- Sex dagar efter transplantation, injicera mottagande möss med 4 mg D-luciferin. Låt 5 min för luciferin att reagera med luciferas.
- Söva musen i isofluran kammare bioluminiscens Imager och mottagare bild under 5 min med små binning. Detta kommer att skapa en högupplöst bild samtidigt samla så många händelser som möjligt.
- Analysera data med LivingBildbehandlingsprogram. Omfattningen av pseudo-färgbilden kan ändras för att ge bästa resultat. Emellertid, är det absolut nödvändigt att samma skala användas över experiment.
- Områden av intresse kan skapas med hjälp av programvara Living Image och ljus emittans kan kvantifieras genom att beräkna flödet (fotoner / sek) som sänds ut från varje region av intresse.
9. Representativa resultat
Cirka 7-10 dagar efter transplantationen, möss börjar uppvisar kliniska tecken på GVHD. Möss verkar Josh grund av brist på grooming. Mottagarna kommer också att börja gå ner i vikt mellan 7-10 dagar efter transplantationen. Aktivitet och hållning av mottagande möss förblir relativt normal fram till ungefär dag 12-14 efter transplantation. Kumulativa GVHD poäng kommer successivt att öka genom den första 2-3 veckor efter transplantation (Figur 1A). Sjukdomsförloppet är ganska varierande mellan möss, men borde mottagare enhetligt ge efter för GVHD med 30-40 days efter transplantation (Figur 1B).
Figur 2 visar mottagande möss som avbildas 6 dagar efter transplantationen. Pseudo-färgad skala visar varierande ljus emittans hela kroppen med den högsta ljusintensiteten som avges i mjälten och tarmen. CD8 T-cell ackumulering i tarmen överensstämmer med tidigare fynd 6. Recipientmöss kan placeras tillbaka i microisolator bur som skall avbildas vid en senare tidpunkt eller avlivades för ex vivo avbildning.
| Kriterier | Klass 0 | Grad 1 | Grad 2 |
| Viktminskning (wkly.) | <10% | > 10% - <25% | > 25% |
| Posture | Normal | Hunching endast vid vila | Flera hunching; försämrar movement |
| Aktivitet | Normal | Mild till måttlig minskning i aktivitet | Stationär inte stimuleras |
| Päls textur | Normal | Mild till måttlig ruffling | Svår ruffling / dålig grooming |
| Hudens struktur | Normal | Skalning av tassar / svans | Uppenbara områden blottade hud |
Tabell 1. Cooke et al utvecklat detta poängsystem i 1996 1. Möss bör görs dagligen på varje kriterium till vänster. Varje mus ges en poäng av 0-2 för varje kriterier och den totala poängen är summan av alla enskilda poäng.
Figur 1. Dödligt bestrålade BALB.B transplanterades med 10 7 benbenmärgsceller ensam eller med 18x10 6 tömda CD8 T cell WT splenocyter och 2x10 6 renade L2G85.B6 CD8 T-celler. A) Kliniska poäng uppgifter om mottagare av benmärg enbart eller tillsammans med CD8 T-cell utarmad WT splenocyter och renade L2G85.B6 CD8 T-celler. B) Överlevnadsdata mottagare av benmärg enbart eller tillsammans med CD8 T-cell utarmad WT splenocyter och renade L2G85.B6 CD8 T-celler. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Letalt bestrålade BALB.B möss transplanterades med 10 7 benmärgsceller ensam eller med 18x10 6 tömda CD8 T cell WT splenocyter och 2x10 6 renade L2G85.B6 CD8 T-celler. Mottagare injicerades med 4 mg D-luciferin genom intraperitoneal injektion och avbildades med användning av Xenogen IVIS under 5 min vid små binning. Pseudo färgade bilder visas där lila representerar låg intensitet och rött står hög intensitet områden av intresse drogs runt hela musen och totala flödet (fotoner / sek) kvantifierades.
Figur 3. Letalt bestrålade BALB.B möss transplanterades med 10 7 benmärgsceller ensam eller med 18x10 6 tömda CD8 T cell WT splenocyter och 2x10 6 renade L2G85.B6 CD8 T-celler. Mottagare injicerades med 4 mg D-luciferin genom intraperitoneal injektion och avbildades med användning av Xenogen IVIS under 5 min vid små binning. Pseudo-färgade bilder visas där lila representerar låg intensitet och rött står hög intensitet. Mottagare avbildades på A) dag 4, B) dag 6, och C) dag 8 efter överföring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet för att inducera GVHD i möss som presenteras här är en kliniskt relevant modell för murin GVHD. Ursprungligen fastställts av Berger et al. Under 1994, är det C57BL / 6 till BALB.B stam kombination av MHC-matchas med GVHD dödlighet förmedlas av CD4-beroende, CD8 T effektorer 2, mycket liknande den vanligaste kliniska scenariot 3. Det är känt att transplantera CD8 T-celler enbart inte orsakar GVHD i denna modell, men är sjukdomsprogression betydligt sämre när både CD4 och CD8 T-celler är närvarande jämfört med CD4-T-celler enbart. Dessutom har det varit ett omfattande arbete som visar immunodominanta hierarki immunsvaret mot mindre histokompatibla skillnaderna i denna modell 10. Det finns dock viss oklarhet om rollerna för T-cell undergrupper under olika faser av GVHD 4. Opublicerade studier från vårt laboratorium visar att CD4 T-celler spelar en dominerande roll under tidig GVHDhändelser, medan CD8-T-celler dominerar vid senare tidpunkter.
Möjligheten att spåra T-cell ackumulering mönster in vivo är ett kraftfullt verktyg som har potential att testa hypoteser om CD4 och CD8 T-bidrag cell under GVHD. Möss transgena för eldflugeluciferas ursprungligen utvecklades i laboratoriet av Dr Robert Negrin 5. På grund av deras konstitutiv luciferasuttryck, kan celler från dessa donatormöss spåras in vivo med användning av en icke-invasiv avbildningsteknik 5. En annan fördel med denna modell är att individuella möss kan följas över tiden. Trots upprepade avbildning av mottagande möss kvarstår experimentell variation mellan mottagare. Som visas i figur 2, är utbudet av kroppens totala flödet 2400 tusen och musen med den lägsta flöde har mindre än 60% av kroppens totala flödet än musen med största flödet. Eftersom en enda luciferas transgen är tillräcklig för Tcell upptäckt kan luciferas positiva stammen lätt uppvuxna att skapa dubbla transgena möss. Studier i vårt laboratorium har visat en roll för integrin CD103 främja GVHD 6. CD103 är en integrin som uttrycks på CD8 T-celler 7 och liganden är E-cadherin, som selektivt uttrycks på epitelceller 8,9. Skapa en CD103-/ - möss som kan uttrycka luciferas möjliggör experiment för att testa ytterligare hypoteser om betydelsen av CD103 i GVHD. Denna experimentella teknik är begränsad till att bedöma ackumulering mönster mellan organ. Alternativa tekniker måste användas för att belysa cellulära människohandel mönster inom enskilda organ. Koppling av en kliniskt relevant GVHD modell med självlysande bildbehandling hjälper belysa kinetik T-cell människohandel och relativa bidrag CD4 och CD8 T-celler efter benmärgstransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi står i tacksamhetsskuld till Alice Gaughan och Jiao-Jing Wang, vars enastående teknisk support, intellektuella insatser och moraliskt stöd bidrog flytta dessa studier framåt. Dessa studier stöddes av NIH bidrag AI036532 till GAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Cooke, K. R. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Berger, M. T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens. Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).
- Nimer, S. D. Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial. Transplantation. 57, 82-87 (1994).
- Korngold, R., Sprent, J. Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences. Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).
- Cao, Y. A. Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation. Transplantation. 80, 134-139 (2005).
- Asady, R. E. l TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease. J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).
- Karecla, P. I. Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7). Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).
- Cepek, K. L. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin. Nature. 372, 190-193 (1994).
- Malarkannan, S. The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60. J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).
