Summary
Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için yeteneği
Abstract
Graft-versus-host hastalığı (GVHH) hematolojik eksiklikleri çeşitli için küratif bir tedavi olarak kemik iliği nakli geniş kullanımı sınırlayıcı engeldir. GVHH alıcı infüze edilir kemik iliği greft mevcut olgun alloreactive T hücrelerinin neden olduğu ve ana organlara zarar edilmektedir. Bununla birlikte, farelerde, T hücreleri GVHD neden olduğu kemik iliği inokulum eklenmesi gerekir. Kapsamlı çalışmalar T hücre yanıtlarını transplantasyon sonrası karakterize yapılmış olmasına rağmen, bioluminescent görüntüleme teknolojisi in vivo T hücre trafiğini modellerini izlemek için bir non-invaziv bir yöntemdir.
Ölümcül radyasyon ardından, alıcı fareler donör farelerden alınan kemik iliği hücreleri ve dalak ile nakledilmektedir. L2G85.B6 (yapısal olarak ifade eden transgenik farelerde lusiferaz) alınan T-hücre alt nakli dahil edilmiştir. Sadece belirli T hücre alt nakli olarak, bir in vivo özgül T hücre alt izleyebilirve yere göre, değişik zaman noktalarında GVHD teşvik spesifik T hücre alt gruplarının rolü ile ilgili hipotezler geliştirmek. Önceden belirlenen aralıklarla transplantasyon sonrası anda, alıcı fareler bir Xenogen IVIS CCD kamera kullanarak görüntülü. Işık yoğunluğu foton yoğunluğu (kırmızı = yüksek yoğunluklu, mor = düşük yoğunluklu) dayalı bir pseudo-color görüntü oluşturmak için Yaşayan Image yazılımı kullanılarak belirlenebilir.
4-7 gün transplantasyon sonrası arasında, alıcı fareler GVHH klinik belirtileri göstermeye başlayabilir. Cooke ve ark. 1 alıcı fareler kürk, doku, deri bütünlüğü, aktivite, kilo kaybı ve duruş esas hastalığın ilerlemesini ölçmek için bir puanlama sistemi geliştirmiştir. Fare günlük attı, ve can çekişen olunca ötenazi uygulanır. Alıcı fareler genellikle 20-30 gün transplantasyon sonrası can çekişmekte.
Sıçan modellerinde GVHH immünoloji incelemek için değerli araçlardır. Seçerek özellikle T hücre alt ark nakliHer bir alt kümeye oynar rolleri dikkatli belirlenmesi için alçak. Non-invaziv in vivo T hücre yanıtları izleme murin GVHH modelleri değeri başka bir katman ekler.
Protocol
1. Öldürücü Işınlama
- Kullanılacak ışınlayıcılar ile uyumlu bir microisolator kafes içine 10 alıcı fareler kadar yerleştirin.
- Toplam doz (BALB.B alıcılar için toplam doz = 9 cGy) toplanmasıyla 2 eşit dozda ışın tedavisi. İkinci ışınlama birinci sonra 3 saat olmalıdır. Enjeksiyon nihai ışınlama sonrası 4-6 saat arasında meydana gelmelidir. Cs 137 kaynak veya RS2, 000, ışınlayıcı birinde saçmak fareler.
- Nakli saatine kadar asitlendirilmiş su ile microisolator kafesteki ikinci radyasyon dozu, mağaza fareler ardından.
2. Splenocyte Preparasyon
- Kurumsal kurallarına göre bir donör fare Euthanize. 125x10 6 splenositlerin - Her donör genellikle 75x10 6 verir. 12x10 6 CD8 T hücreleri - CD8 arıtma kitleri kullanılarak her bir fare genellikle 6x10 6 verir.
- Ilk doğrudan doğruya orta hat dikey bir 2 cm'lik kesi 2 cm yaparak dalak çıkarıngöğüs kafesi altında. Kürk, deri ve viseral zarından kesin.
- Dalak çıkarın ve% 5 FBS 1640 RPMI ile bir Petri kabındaki 40 ul örgü ekran dalak koyarak tek hücre süspansiyonu oluşturmak. Tüm dalak örgü ekran geçirilir kadar dalak parçalayın için bir şırınga pistonu kullanın.
- Her WT ve L2G85.B6 donör için bu işlemi tekrarlayın. 1-50 ml konik bir tüp içinde tüm WT tek hücre süspansiyonları toplayın ve ayrı bir 50 ml'lik konik bir tüp içinde tüm L2G85.B6 tek hücre süspansiyonları toplamak.
- 4. 10 dakika için 1200 rpm'de santrifüje hücreleri ° C % 5 FBS ve sayım hücreleri 1640 RPMI süspanse pelet.
3. Kemik İliği Hazırlık
- Bir donör fare tek bir arka bacak arasından cilt çıkarın.
- Dikkatlice femur ve tibia / fibula mümkün olduğunca çok kas dokusu gibi kesip.
- Kalça eklemi uzakta femur keserek arka bacak kaldırın. Sadece tibia / fibula kesiştiği aşağıda arka pençe kesip. Tüm kemik keser sağlam makas kullanılarak yapılmalıdır.
- Dikkatlice kalan kas dokusu çıkarın. Fibula-nispeten daha az kemik iliği fibula bulunan ve çabaya değmez kesiniz.
- İkinci arka bacak ile soğuk 1.640 RPMI% 5 FBS ve tekrarlama sürecinde arka ekstremite yerleştirin. 40x10 6 kemik iliği hücreleri - Her fare 20x10 6 arasında boyun eğmek zorundadır.
4. Kemik İliği Kaldırma
- Soğuk ortamı (~ 1 ml), az miktarda büyük olan Petri kabındaki ortam ve bir yerden bir arka uzuv çıkarın.
- Diz eklemi kesip. Tibia içine bir şırınga (hacim> 5 ml), insert subkutan iğne kullanma ve tüm kırmızı malzeme tibianın iç kaldırılana kadar şırınga basın. Femur işlemi tekrarlayın. Kemik iliği yoksun kalan kemikleri atın. İkinci arka bacak ile tekrarlayın.
- Büyük Petri kabı ve kullanım şırınga pistonu ve ul 40 içine kemik iliği içeren pipetleme medya tarafından tek bir hücre süspansiyonu oluşturunekran kafes. Pipet tek hücre 50 ml konik tüp içine süspansiyon ve buz üzerinde tutmak.
5. CD3 tükenmesi
Kemik iliğinden CD3 + hücreler tüketmek için çeşitli yollar vardır. Bizim laboratuar Miltenyi Biotec (- 130-093-021 CD3-biotin) tarafından yapılan bir kit kullanır. Üreticinin protokolü takip kemik iliğinden CD3 + hücreler İncelten. Miltenyi kitleri için tampon bundan MACS Tampon (2 mM EDTA, PBS, pH 7.2 'de% 0.5 BSA) olarak adlandırılır.
- 4. 10 dakika ° C ve sayım hücreleri için 1200 rpm'de dalak ve kemik iliği hücreleri santrifüj hücreleri yıkayın.
- TÜM Süpernatantı. Süspanse kemik iliği MACS tamponu içerisinde 10 milyon kemik iliği hücreleri başına 100 ul hücre.
- Kullanarak CD3 tükenmesi ile devam 'protokolü üretmektedir.
- Steril PBS CD3 tüketilmiş kemik iliği hücreleri 3 kere yıkayın. Kont CD3 kemik iliği hücreleri tükenmiş ve 10 7 hücre enjekte etmek uygun bir ses seviyesinde tekrar süspansiyon haline getirin.
L2G85.B6 farelerde CD8 T hücreleri arındırmak için çeşitli yollar vardır. Ayrıca, WT splenocyte vericilerden CD8 T hücreleri tüketmek için çeşitli yolları vardır. Bizim laboratuar Miltenyi Biotec (- 130-049-401, CD8 arıtma - 130-095-236 CD8 tükenmesi) dan kitleri kullanır.
- 10 7 hücre başına 90 ul MACS Tamponunda WT pelletini tekrar. 'Protokolü (- 130-049-401 CD8 tükenmesi) üretmektedir göre CD8 T hücre tükenmesi ile devam edin.
- 10 7 hücre başına 40 ul MACS Tamponunda L2G85.B6 pelletini tekrar. 'Protokolü (- 130-095-236 CD8 saflaştırma) üretmektedir göre CD8 T hücre saflaştırma ile devam edin.
- Her hücre popülasyonu sayın ve steril PBS ile her nüfusu 3 kere yıkayın. 18x10 6 WT (CD8 tüketilmiş) dalak ve 2x10 6 CD8 T hücreleri arıtılmış L2G85.B6 enjekte etmek uygun miktarda her nüfus süspanse edin.
7. Enjeksiyon Hazırlık
- Bir mikrosantrifüj tüp CD8 T hücreleri arıtılmış 10 7 CD3 tükenmiş kemik iliği hücreleri, 18x10 6 WT (CD8 tüketilmiş) dalak ve 2x10 6 L2G85.B6 birleştirin. 300 ul steril PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayınız.
- Alıcı farelerin kuyruk ven içine hücre hazırlama enjekte. Enjeksiyonlar 28 gauge iğne kullanılarak yapılmalıdır.
- Asitlendirilmiş su ile microisolator kafeste Mağaza fareler. Puan farelerin günlük Cooke ve arkadaşları 1 tarafından geliştirilen skorlama GVHH skorlama sistemi kullanılarak.
8. Bioluminescent Görüntüleme
- Altı gün transplantasyon sonrası, 4 mg D-luciferase ile alıcı farelere enjekte. Luciferase için 5 dk lusiferaz ile reaksiyona izin verin.
- Küçük binning ile 5 dakika biyolüminesans kamera ve görüntü alıcıların izofluran odasında fare uyuştur. Mümkün olduğunca çok sayıda olaylar olarak toplarken, bu yüksek çözünürlüklü bir görüntü oluşturacaktır.
- Oturma kullanarak verileri analizImage yazılımı. Pseudo-color görüntü ölçeği en iyi sonuçları elde etmek için değiştirilebilir. Bununla birlikte, aynı ölçekli deneyler ile aynı olmaları şarttır.
- Ilgi Bölgeler ilgi her bölgeden yayılan varlık akı (foton / sn) hesaplanarak belirlenebilir Yaşayan Image yazılımı ve ışık emittans kullanılarak oluşturulabilir.
9. Temsilcisi Sonuçlar
Yaklaşık 7-10 gün transplantasyon sonrası, fareler GVHH klinik belirtileri gösteren başlar. Fare tımar eksikliği scruffy nedeniyle görünür. Alıcılar da 7-10 gün transplantasyon sonrası arasındaki kilo kaybetmeye başlayacaktır. Alıcı fareler Faaliyet ve duruş yaklaşık günde 12-14 transplantasyon sonrası kadar nispeten normal kalır. Kümülatif GVHH puanları sürekli ilk 2-3 hafta sonrası transplantasyon (Şekil 1A) aracılığıyla artacaktır. Hastalık ders fareler arasında oldukça değişken olmakla birlikte, alıcıların eşit 30-40 d GVHD yenik gerekirays transplantasyon sonrası (Şekil 1B).
Şekil 2. 6 gün transplantasyon sonrası görüntülendi alıcı fareler gösterir. Pseudo-renkli ölçek dalak ve bağırsak yayılan varlık yüksek ışık yoğunluğu ile vücut boyunca ışık emittans değişen gösterir. Gut ve CD8 T hücre birikimi önceki bulguları 6 ile tutarlıdır. Alıcı fareler daha sonraki bir zaman noktasında görüntülü ya da ex vivo görüntüleme için ötenazi ile microisolator kafesine geri yerleştirilebilir.
| Kriterleri | Sınıf 0 | Grade 1 | Grade 2 |
| Kilo kaybı (wkly.) | <% 10 | >% 10 - <25% | > 25% |
| Duruş | Normal | Kalanı sadece hunching | Çeşitli hunching; bozar MOVEMEnt |
| Etkinlik | Normal | Aktivitesinde azalma Hafif ve orta şiddette | Uyarılmış sürece Kırtasiye |
| Kürk doku | Normal | Dağıtmıştı Hafif ve orta şiddette | Şiddetli dağıtmıştı / yoksul tımar |
| Cilt dokusu | Normal | Pençeleri / kuyruk Ölçekleme | Soyulmuş deri belirgin alanlar |
Tablo 1. Cooke ve ark 1996 1 Bu skorlama sistemi geliştirilmiştir. Fare sol kriterleri her günlük atılır gerekmektedir. Her fare her bir kriter için 0-2 arasında bir puan verilir ve toplam puan tüm bireysel puanları toplamı olur.
Şekil 1. Lethally ışınlanmış BALB.B 10 7 kemik ile transplante edildiKemik iliği hücreleri tek başına veya L2G85.B6 CD8 T hücreleri arıtılmış 18x10 6 CD8 T hücre tükenmiş WT dalak ve 2x10 6 ile. A) kemik iliği alıcılarının klinik skoru veriler tek başına veya CD8 T hücre ile WT splenositlerin tükenmiş ve L2G85.B6 CD8 T hücreleri saflaştırılmış. B) kemik iliği alıcıları tek başına ya da Survival veri CD8 T hücre WT splenositlerin tükenmiş ve L2G85.B6 CD8 T hücreleri saflaştırılmış. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Lethally ışınlanmış BALB.B fareler 10 7 kemik iliği hücreleri tek başına veya L2G85.B6 CD8 T hücreleri arıtılmış 18x10 6 CD8 T hücre tükenmiş WT dalak ve 2x10 6 ile birlikte transplante edildi. Alıcılar, intraperitoneal enjeksiyon ile 4 mg D-lusiferin ile enjekte edildi ve küçük binning 5 dakika için Xenogen IVIS kullanılarak görüntülendi. Psmor düşük yoğunluklu temsil eder ve kırmızı ilgi yüksek yoğunluklu bölgeler tüm fare ve toplam akı (foton / sn) etrafında çizildi ölçüldü temsil eder eudo renkli görüntüler gösterilir.
Şekil 3. Lethally ışınlanmış BALB.B fareler 10 7 kemik iliği hücreleri tek başına veya L2G85.B6 CD8 T hücreleri arıtılmış 18x10 6 CD8 T hücre tükenmiş WT dalak ve 2x10 6 ile birlikte transplante edildi. Alıcılar, intraperitoneal enjeksiyon ile 4 mg D-lusiferin ile enjekte edildi ve küçük binning 5 dakika için Xenogen IVIS kullanılarak görüntülendi. Mor düşük yoğunluklu temsil eder ve kırmızı yüksek yoğunluk temsil ettiği sözde renkli görüntüler gösterilir. Alıcılar A) günde 4, B) Günlük 6, ve C) 8 gün sonrası transfer görüntülendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan farelerde GVHD uyarılacak protokolü murin GVHH klinik açıdan uygun bir modeli temsil eder. Başlangıçta Berger ve arkadaşları tarafından kurulmuştur. 1994 yılında, BALB.B gerginlik kombinasyon içine C57BL / 6 bağımlı CD4, en sık görülen klinik senaryo 3 çok benzer CD8 T etkileyiciler 2, aracılık GVHH mortalite ile, MHC-eşleştirilmiş olduğunu. Tek başına CD8 T hücre nakli bu modelde GVHD neden olmadığı bilinmektedir, ancak hastalığın ilerlemesi yalnız CD4 T hücreleri ile karşılaştırıldığında CD4 ve CD8 T hücreleri hem mevcut olduğunda önemli ölçüde kötüdür. Ayrıca, bu model 10 minör histokompatibilite farklarının immün yanıtın immünodominant hiyerarşisini gösteren kapsamlı bir çalışma olmuştur. Ancak, GVHH 4 farklı aşamalarında T hücre alt grupları için rollerine ilişkin bazı belirsizlik orada kalır. Bizim laboratuvar Yayınlanmamış çalışmalar CD4 T hücreleri erken GVHH sırasında baskın bir rol oynadığını göstermektedirolaylar, CD8 T hücreleri daha sonraki zaman noktalarında hakim iken.
In vivo T hücre birikimi desenleri izlemek için yeteneği CD4 ve GVHH sırasında CD8 T hücre katılım ile ilgili hipotezleri test etmek için potansiyele sahip güçlü bir araçtır. Ateşböceği lusiferaz için Fare transgenik başlangıçta Dr Robert Negrin 5 laboratuvarda geliştirilmiştir. Çünkü onların kurucu lusiferaz ifade, bu donör farelerden alınan hücreler non-invaziv bir görüntüleme tekniği 5 kullanılarak in vivo izlenebilir. Bu modelin diğer bir avantajı, tek fareler saat boyunca izlenebilir olmasıdır. Ancak, alıcı farelerin tekrarlayan görüntüleme rağmen, alıcılar arasında deneysel değişkenlik orada kalır. Şekil 2 de gösterildiği gibi, total vücut akış aralığı 2.4 milyon ve en düşük akış ile fare büyük akı ile fare dışında toplam vücut akı az% 60 sahiptir. Tek bir lusiferaz transgen Tc için yeterli olduğundanell algılama, lusiferaz pozitif gerinim kolayca çift transgenik farelerin oluşturmak için yetiştirilen olabilir. Bizim laboratuarımızda Çalışmaları GVHH 6 teşvik integrin CD103 için bir rol göstermiştir. CD103 seçici olarak epitel hücrelerde ifade edilir 8,9 üzerinde CD8 T hücrelerinin 7 ve ligand E-cadherin ise, bir integrin eksprese olduğunu. Lusiferaz GVHH yılında CD103 rolü ile ilgili daha hipotezleri test etmek için deneyler için izin verecektir ifade edebilir fare - Bir CD103-/ oluşturma. Bu deneysel teknikte organlar arasındaki birikimi desenleri değerlendirmek sınırlıdır. Alternatif tekniklerle tek tek organların içinde hücresel ticareti desenleri aydınlatmak için yararlanılır. Bioluminescent görüntüleme ile klinik GVHH modeli Coupling T hücre trafiğini ve kemik iliği transplantasyonu sonrası CD4 ve CD8 T hücrelerinin göreli katkıları kinetiği aydınlatılmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz kimin üstün teknik destek, entelektüel girdi ve manevi destek öncesinde bu çalışmalarda hareket etkili olmuştur Alice Gaughan ve Jiao-Jing Wang borçluyuz. Bu çalışmalar GAH için NIH hibe AI036532 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 μM Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotin | Miltenyi Biotec | 130-093-021 | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-091-147 | |
| CD8a Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-401 | Used to deplete CD8 T cells from spleen. |
| CD8a Purification Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | Used to purify CD8 T cells from spleen. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
References
- Cooke, K. R. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Berger, M. T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens. Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).
- Nimer, S. D. Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial. Transplantation. 57, 82-87 (1994).
- Korngold, R., Sprent, J. Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences. Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).
- Cao, Y. A. Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation. Transplantation. 80, 134-139 (2005).
- Asady, R. E. l TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease. J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).
- Karecla, P. I. Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7). Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).
- Cepek, K. L. Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin. Nature. 372, 190-193 (1994).
- Malarkannan, S. The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60. J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).
