Summary
Быстрый и эффективный способ для интеграции чужеродной ДНК интерес в готовых акцептором штаммов, называемых штаммов посадочной площадки, описан. Метод позволяет на конкретных участках интеграции ДНК кассету в инженерных локус площадку приземления данного штамма, через сопряжение и выражения ΦC31 интегразы.
Abstract
Бактериальной хромосомы могут быть использованы для поддержания стабильно чужеродной ДНК в мега-база от 1. Интеграция в хромосому обходит такие вопросы, как плазмиды репликации плазмиды стабильности, плазмиды несовместимости, и плазмиды дисперсии числа копий. Этот метод использует сайт-специфические интегразы из Streptomyces фага (Φ), C31 2,3. ΦC31 интегразы катализирует прямой рекомбинации между двумя определенными участками ДНК: attB и attP (34 и 39 б.п. соответственно), 4. Это рекомбинация является стабильной и не возвращается 5. "Посадочная площадка" (LP) последовательность, состоящая из спектиномицину ген устойчивости, Aada (СРП), и Е. палочки бета-глюкуронидазы ген (uidA) в окружении сайтов attP была интегрирована в хромосомах Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi и Agrobacterium tumefaciens в межгенных региона, утрапКл локус, и тета локус, соответственно. С. meliloti используется в данном протоколе. Mobilizable векторы донора содержащие attB сайтов фланговые писака красный флуоресцентный белок (RFP) гена и гена устойчивости к антибиотикам, также были построены. В этом примере гентамицина устойчивы плазмиды pJH110 используется. Ген RFP 6 может быть заменен на желаемую конструкцию использованием Sph я и Pst I. Кроме того синтетическая конструкция в окружении attB сайты могут быть суб-клонирован в вектор mobilizable таких как pK19mob 7. Выражение ΦC31 интегразы гена (клонированы из pHS62 8) приводится в движение промоутер лак на mobilizable широкий спектр хозяин плазмиды pRK7813 9.
Tetraparental протокола спаривания используется для передачи доноров кассету в LP штамм тем самым заменив маркеры в последовательности LP с донорами кассету. Эти клетки являются переходыS-интегрантов. Транс-интегрантов формируются с типичной эффективностью 0,5%. Транс-интегрантов которые обычно встречаются в первые 500-1000 колонии экранируется чувствительность к антибиотикам или сине-белые скрининга с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновой кислоты (X-Gluc). Этот протокол содержит спаривания и процедуру отбора для создания и выделения транс-интегрантов.
Protocol
1. Производство культуры
- Подготовка стерильных жидких сред: TY 10 (5 г / л триптон, 3 г / л дрожжевого экстракта, 0,44 г / л хлорида кальция обезвоживания) и LB 11 (10 г / л триптон, 5 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / хлорид натрия, рН 7).
- Инокулировать из одной колонии: SmUW227 (С. meliloti LP-деформированного: строительство будут описаны в другом месте, процедить деталей конструкции по запросу) () в 5 мл TY СМИ с 50 мкг / мл спектиномицину. Привить следующие штаммы в 5 мл среды LB жидкости, дополняя данный антибиотик: Е. палочки DH5α 12, содержащий pJC2, интегразы выражение плазмида, с 10 мкг / мл тетрациклина, Е. палочки MT616 13, мобилизатор, с 10 мкг / мл хлорамфеникола и E. палочки DH5α содержащие pJH110, донор кассеты плазмиды, с 5 мкг / мл гентамицина.
- Инкубируйте E. штаммов кишечной ночь на 37 иградусов, в постоянной тряски. Инкубируйте С. meliloti деформации при 30 ° C в течение двух дней при встряхивании. Это позволило получить С. meliloti культуры ночь с большей посевной (1:500 субкультура насыщенного культуры).
2. Подготовка культуры и смешивания
- Промойте 1,5 мл культуры каждого штамма, собирая осадок клеток путем центрифугирования при 17000 х г в течение 30 секунд и ресуспендирования в 1 мл стерильного 0,85% NaCl; повторить один раз.
- Ресуспендируют осадок в 100 мкл стерильного 0,85% NaCl.
- Индивидуально обнаружить 10 мкл промытый культуры для каждого штамма на равнине пластины агар TY. Эти пятна контроль пятна.
- Добавить 40 мкл каждого штамма исключением E. палочки DH5α 12, содержащий pJC2 в стерильную пробирку, перемешайте и место 120 мкл этой смеси на равнине пластины агар TY. Это место не-интегразы отрицательного контроля.
- Добавить 40 мкл каждого штамма в стерильном тВБО, перемешать, и место 160 мкл этой смеси на равнине пластины агар TY. Это место IMCE место спаривания.
- Позвольте мест для просушки в ламинарном боксе.
- Уплотнение пластин и инкубировать при температуре 30 ° С в течение ночи.
3. Выделение Транс-интегрантов
- Подряд контроль пятен и IMCE место на пластинах агар TY дополнен 200 мкг / мл стрептомицина (SmUW227 основан на Rm1021 который несет в себе мутацию присвоении высокого уровня устойчивости к стрептомицину 14) и 30 мкг / мл гентамицина.
- Для расчета эффективности IMCE, ресуспендируют примерно четверть IMCE место спаривания в 500 мкл стерильного 0,85% NaCl. Сделать 10 раз серийные разведения до 10 -7. Пластина разведения 10 -2 до 10 -5 на TY агаром дополнен 200 мкг / мл стрептомицина и 30 мкг / мл гентамицина, чтобы выбрать для транс-интегрантов. Пластина разведении 10 -3 Четух 10 -7 на TY агаром дополнен 200 мкг / мл стрептомицина, чтобы выбрать для транс-интегрантов и потенциальных получателей, то есть общий получателей.
- Для изоляции безмаркерных транс-интегрантов ресуспендируют примерно четверть IMCE место спаривания в 500 мкл стерильного 0,85% NaCl. Сделать 10 раз серийные разведения до 10 -6. Пластина разведения 10 -4 до 10 -6 на четырех TY агаром дополнен 200 мкг / мл стрептомицина и 200 мкг / мл X-Gluc.
- Инкубируйте пластины при температуре 30 ° С в течение 3 дней.
- Просмотр RFP транс-интегрантов в зеленом свете (525 нм) и через красный светофильтр (> 610 нм) 15.
- Расчет эффективности процентов IMCE как КОЕ транс-интегрантов по сравнению с КОЕ от общего числа получателей. Примерно половина из транс-интегрантов будет прошли истинный обмен кассета делая их белыми и спектиномицину чувствительны.
- Чтобы найти безмаркерных транс-интегрантов (безЗдесь донор вектор не содержат ГМ-т, как в pJH110) экрана для белого колонии (длительный период инкубации 1-2 дополнительных дня при комнатной температуре, будет способствовать дифференциации колоний через X-Gluc, это необходимо в С. meliloti SmUW227), подтвердить спектиномицину чувствительность колонии путем скрининга на пластинке агара TY без антибиотиков и пластин TY агар, содержащий 100 мкг / мл спектиномицину.
4. Представитель Результаты
После трех дней инкубации на TY дополнить стрептомицин и гентамицин контроль полосы не должно быть роста. IMCE полоса должна быть сплошной рост на полосу головы и многих колониях на вторую полосу, как показано на рисунке 2. Эффективность транс-интеграции, выраженное как доля транс-интегрантов к общему получателей, должна быть в пределах 0,5%. Примерно половина из транс-интегрантов будет спектиномицину чувствительные и белыхпоказывая, что они прошли истинный обмен кассету. Транс-интегрантов содержащие доноры тестер ППП кассету с pJH110 должен отображать заметной флуоресценции ППП, если смотреть под зеленым светом (525 нм) и через красный светофильтр (> 610 нм) 15.
На рис. 1 Сопряжение смесь иллюстрации: С помощью выражения передачи генов от pRK600, все плазмиды передаются случайно от клетки к клетке. Эта передача результатов в создании транс-интегрантов в смеси, за счет приобретения LP-штамма из двух плазмид, необходимых для IMCE, интегразы (INT) вспомогательные плазмиды pJC2 и доноров плазмиды pJH110. Донорами кассету с не-доноров репликации плазмиды (pJH110) обменивается через ΦC31 интегразы деятельности с маркерами LP-кассеты на хромосоме, в результате чего потери LP-маркеров (Spг, uidA) и содержание доноров кассеты (RFP и Gm г) в появившемся транс-интегрирующий.
Рисунок 2. . Спаривание месте табличку на неселективные TY пластина показывает сухие смеси ячейки поверхность агара B: Спаривание пятна штрихом на стрептомицин-гентамицин-X-Gluc пластины, из левого верхнего угла по часовой стрелке, не интегразы контроля, IMCE в S. meliloti, Е. палочки DH5α содержащие pJC2 контроль, Е. палочки DH5a содержащие pJH110 контроль, Е. палочки MT616 контроля и С. . meliloti UW227 контроль C: 10 -2 разведения спаривания ресуспендирования пятно на стрептомицин TY-X-Gluc агар D:. 10 -2 разведения спаривания ресуспендирования пятно на TY стрептомицин-гентамицин-X-Gluc агар (синие колонии одного рекомбинантов, белые колонии прошли истинной. кассеты обмен) E: 10 -2 разведения спаривания место ресуспендирования на TY стрептомицин-X-агар Gluc указывает на отсутствие флуоресценции F:. 10 -2 разведения спаривания ресуспендирования пятно на TY стрептомицин-гентамицин-X-Gluc агар с изображением двух уровней флуоресценции (ярче колонии соответствуют синих колоний и имеют более высокую ЗП выражение предположительно из-за промоутера для чтения, хотя из векторных последовательностей, где колонии пройдя истинного кассеты обмен содержать ППП только с непосредственной промоутер, не для чтения через от промоутера в лак вектор, который отсутствует.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IMCE техника позволяет эффективно интегрировать одного attB окружении ДНК кассету в LP-локус ранее инженерии штамм. Как только желаемый конструкция клонированных вместо ППП для создания доноров кассеты, техника не требует последующей очистки ДНК и трансформации, что делает его очень прочным. Очень важно, чтобы соответствующие меры контроля роста включены, чтобы быть уверенным, устойчивость к антибиотикам связан с созданием транс-интегрантов а не другие факторы.
IMCE производит транс-интегрантов примерно на 0,5% эффективности. В отличие от двойных кроссоверов через гомологичной рекомбинации происходит на частоте около 10 -6. Recombineering через λ-красный 16, еще один фаг система, требует особой гомологии, и изменилась эффективность вне Е. палочки 17. Еще один вариант, Tn7 конкретного участка рекомбинации требует attTn7 сайты 18 4,19. Хотя использование ΦC31 интегразы требует предварительного инженерного хозяина, он не ограничен определенным типам. IMCE имеет преимущества эффективности и модульности при условии, что любой донор кассета потенциально могут быть интегрированы в любую LP-напряжение. Он идеально подходит для исследований, в которых одной библиотеке клонов должны быть функционально показаны в нескольких хостов благодаря экспрессии генов или генетических требованиям дополнения в единственном экземпляре желательно.
Размер конструкции должны быть интегрированы ограничен размер ДНК, которые могут быть успешно клонировали в вектор с помощью доноров труб. Донор векторов, содержащих шлюз направления 20 могут быть использованы, и особенно полезно для больших вставки fosmid / космидный библиотек. Маркеров устойчивости к антибиотикам в донорской векторов также может быть использован, чтобы выбрать для тОн сборка перекрытия фрагментов ДНК после IMCE путем скрещивания двух разных транс-интегрантов помощью трансдукции, или геномной электропорации 21. Этот проект должен позволить рассмотрение для сборки очень больших конструкций на LP-локуса в LP-напряжение. Это может быть особенно полезно для включения синтетические конструкции гена для применения в метаболической инженерии или синтетической биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Для Маргарет Смит CM за любезно предоставленные интегразы клон
Финансирование поддержки:
Геном Канада / Геном Prairie
NSERC Discovery и стратегических проектов гранты
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
