Summary
ووصف طريقة سريعة وفعالة لدمج الحمض النووي الأجنبية ذات الاهتمام إلى سلالات متقبل مسبقة الصنع، ووصف سلالات مهبط،. أسلوب يسمح للموقع المحدد التكامل من شريط الحمض النووي في مكان الهبوط وسادة هندسيا من سلالة معينة، من خلال تصريف الافعال والتعبير عن integrase ΦC31.
Abstract
ويمكن استخدام الكروموسوم البكتيري للحفاظ على ستابلي الحمض النووي الأجنبية في نطاق الضخمة قاعدة 1. الاندماج في كروموسوم تلتف حول قضايا من قبيل التكرار البلازميد والاستقرار البلازميد، عدم التوافق البلازميد، والبلازميد التباين في عدد النسخ. هذا الأسلوب يستخدم integrase في مواقع محددة من بالعاثية المتسلسلة (Φ) C31 2،3. وintegrase ΦC31 يحفز إعادة التركيب مباشرة بين موقعين DNA محددة: attB وattP (34 و BP 39، على التوالي) 4. هذا التوحد هو مستقر ولا تعود 5. A "مهبط" (LP) التي تتكون من تسلسل الجين سبكتينوميسين للمقاومة، aadA (SPR)، وهاء في تم دمج القولونية ß غلوكورونيداز الجين (uidA) يحيط بها مواقع attP في صبغيات meliloti Sinorhizobium، anthropi Ochrobactrum، والأجرعية المورمة في المنطقة بين الجينات، وأناPC مكان، ومكان تيتا، على التوالي. س. ويستخدم meliloti في هذا البروتوكول. كما تم ناقلات المانحة للتعبئة التي تحتوي على مواقع attB المرافقة أحمر فلوري ستوفير بروتين (RFP) الجينات والجينات المقاومة للمضادات الحيوية التي شيدت. في هذا المثال يتم استخدام الجنتاميسين pJH110 البلازميد المقاوم. قد يتم استبدال الجين RFP 6 مع تأنشا المطلوب باستخدام SPH أنا أولا والباسيفيكي بدلا من ذلك قد تأنشا الاصطناعية يحيط بها مواقع attB تكون شبه مستنسخ في ناقلات للتعبئة مثل pK19mob 7. هو الدافع وراء التعبير عن الجينات integrase ΦC31 (المستنسخة من pHS62 8) من قبل مروج أمريكا اللاتينية والكاريبي، على نطاق واسع المضيفة للتعبئة البلازميد pRK7813 9.
ويستخدم بروتوكول التزاوج tetraparental لنقل كاسيت المانحة إلى سلالة ليرة لبنانية وبذلك يحل محل علامات في تسلسل ليرة لبنانية مع كاسيت المانحة. هذه الخلايا هي ترانS-integrants. وتتشكل عبر integrants مع كفاءة نموذجي من 0.5٪. وتوجد عادة عبر integrants ضمن المستعمرات 500-1،000 1 فحص الحساسية للمضادات الحيوية أو بواسطة فحص الأزرق والأبيض باستخدام 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl بيتا-D-حمض الغلوكورونيك (X-الحلاوة). هذا البروتوكول يتضمن إجراءات التزاوج واختيار لخلق وعزل عبر integrants.
Protocol
1. إنتاج الثقافة
- إعداد وسائل الاعلام سائل معقم: TY 10 (5 جم / لتر تريبتون (3)، خلاصة الخميرة غرام / لتر، 0،44 كلوريد الكالسيوم غرام / لتر يذوى)، وLB 11 (10 جم / لتر تريبتون (5)، خلاصة الخميرة غرام / لتر، 5 ز / كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7).
- تطعيم من مستعمرة واحدة: SmUW227 (S. meliloti LP-السلالة: سيتم وصف البناء في مكان آخر، توتر تفاصيل البناء متوفرة عند الطلب) () في 5 مل من وسائل الاعلام TY مع 50 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين. تطعيم السلالات التالية في 5 مل من وسائل الاعلام سائل LB، المكمل مع مضاد حيوي معين: E. كولاي DH5α 12 التي تحتوي على pJC2، والتعبير integrase البلازميد، مع 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين، E. كولاي MT616 13، والتعبئة، مع 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول، وهاء. كولاي DH5α تحتوي على pJH110، وكاسيت المانحة البلازميد، مع 5 ميكروغرام / مل الجنتاميسين.
- احتضان E. سلالات بكتيريا بين عشية وضحاها في 37 ودرجة؛ C مع الهز المستمر. احتضان س. meliloti السلالة في درجة حرارة 30 مئوية لمدة يومين مع اهتزاز. فمن الممكن الحصول على س. meliloti ثقافة بين عشية وضحاها مع أكبر اللقاح (1:500 ثقافة فرعية من ثقافة مشبعة).
2. التحضير والثقافة، وخلط
- غسل 1.5 مل من ثقافة لكل سلالة من خلال جمع بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي في 17000 XG لمدة 30 ثانية وresuspending في 1 مل من كلوريد الصوديوم العقيمة 0.85٪، كرر مرة واحدة.
- Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم العقيمة 0.85٪.
- بقعة على حدة 10 ميكرولتر من ثقافة المغسول لكل من الضغط على لوحة سهل أجار TY. هذه البقع هي بقع السيطرة.
- اضافة 40 ميكرولتر من كل سلالة باستثناء E. كولاي DH5α 12 التي تحتوي على pJC2 في أنبوب معقم، مزيج، وبقعة 120 ميكروليتر من هذا الخليط على طبق سهل أجار TY. هذا المكان هو التحكم عدم integrase سلبي.
- اضافة 40 ميكرولتر من كل سلالة في تي معقمUBE، مزيج، وبقعة 160 ميكروليتر من هذا الخليط على طبق سهل أجار TY. هذا المكان هو المكان التزاوج IMCE.
- السماح للبقع لتجف في غطاء محرك السيارة تدفق رقائقي.
- لوحات ختم واحتضانها في 30 درجة مئوية خلال الليل.
3. من العزلة عبر integrants
- بقع سيطرة خط وبقعة IMCE على لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل ستربتوميسين (يستند على SmUW227 Rm1021 الذي يحمل طفرة تمنح رفيع المستوى المقاومة للستربتومايسين 14) و 30 جنتاميسين ميكروغرام / مل.
- لحساب كفاءة IMCE، resuspend ما يقرب من ربع من بقعة التزاوج IMCE في 500 كلوريد الصوديوم العقيمة ميكروليتر 0.85٪. جعل 10 أضعاف التخفيفات المسلسل إلى 10 -7. التخفيفات لوحة خلال 10 -2 10 -5 على لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 30 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، لاختيار لعبر integrants. التخفيفات لوحة 10 عبتي -3ough 10 -7 على لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، لاختيار لintegrants على حد سواء عبر والمستفيدين المحتملين، أي مجموع المتلقين.
- لعزل integrants عبر markerless resuspend ما يقرب من ربع بقعة التزاوج IMCE في 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم العقيمة 0.85٪. جعل 10 أضعاف التخفيفات المسلسل إلى 10 -6. التخفيفات لوحة 10 -4 إلى 10 -6 على أربع لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 200 ميكروغرام / مل X-الحلاوة.
- احتضان لوحات في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 3 أيام.
- رأي RFP عبر integrants تحت الضوء الأخضر (525 نانومتر)، وخلال مرشح أحمر (> 610 نانومتر) 15.
- حساب كفاءة IMCE في المئة كما CFU العابرة للintegrants مقارنة CFU من مجموع المستفيدين. سيكون قد مر ما يقرب من نصف عبر integrants صحيح تبادل كاسيت جعلها بيضاء وسبكتينوميسين الحساسة.
- للعثور على markerless عبر integrants (ثهنا الموجه من الجهات المانحة لا يحتوي على جم R مثل في pJH110) شاشة لمستعمرة بيضاء (فترة الحضانة الطويلة، 1-2 أيام إضافية في درجة حرارة الغرفة، من شأنها تعزيز التفريق بين المستعمرات عبر X-الحلاوة، وهذا أمر ضروري في س. meliloti SmUW227)، يؤكد حساسية للمستعمرة سبكتينوميسين بواسطة فحص على صفيحة أجار TY بدون المضادات الحيوية، والتي تحتوي على لوحة أجار TY 100 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين.
4. ممثل النتائج
بعد ثلاثة أيام من حضانة في TY تستكمل مع الستربتوميسين والجنتاميسين ينبغي أن الشرائط السيطرة على أي نمو. يجب أن يكون خط IMCE نمو متكدسة على خط الرأس والعديد من المستعمرات على خط الثاني، كما رأينا في الشكل رقم 2. وينبغي أن كفاءة التكامل العابر، معبرا عنه كنسبة مئوية من عبر integrants للمتلقين مجموع، يكون في حدود 0.5٪. ما يقرب من نصف عبر integrants سبكتينوميسين تكون حساسة وأبيضيصور خضعوا لمدى صحتها تبادل كاسيت. وينبغي عبر integrants يحتوي على الجهات المانحة طلب تقديم العروض اختبار كاسيت من pJH110 عرض ملموس RFP مضان عند عرضها تحت الضوء الأخضر (525 نانومتر)، وخلال مرشح أحمر (> 610 نانومتر) 15.
. الرقم خليط الإقتران 1 التوضيح: بمساعدة من التعبير عن الجينات نقل من pRK600، يتم نقل كل من البلازميدات عشوائيا من خلية الى أخرى. هذا نقل النتائج في خلق عبر integrants في الخليط، من خلال اكتساب ليرة لبنانية، وسلالة من البلازميدات 2 اللازمة لIMCE، وintegrase (INT) pJC2 المساعد البلازميد وpJH110 المانحة البلازميد. يتم تبادل كاسيت المانحة من الجهة المانحة عدم تكرار البلازميد (pJH110) عن طريق النشاط integrase ΦC31 مع علامات للكاسيت ليرة لبنانية على الكروموزوم، مما أدى إلى خسارة من العلامات، ليرة لبنانية (SPص وuidA) والحفاظ على كاسيت المانحة (RFP و r جنرال موتورز) في مكمل العابر الناتج.
الشكل 2. ج: B التزاوج لوحة بقعة على طبق من ذهب TY غير انتقائية تظهر مخاليط خلية جافة على سطح أجار: ترك بقع التزاوج مجزع على الستربتومايسين جنتاميسين-X-الحلاوة لوحة، من أعلى في اتجاه عقارب الساعة لا سيطرة integrase، IMCE إلى س. meliloti، E. كولاي DH5α تحتوي على pJC2 مراقبة، E. كولاي DH5a تحتوي على pJH110 مراقبة، E. كولاي MT616 السيطرة، وS. . meliloti UW227 سيطرة C: 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج في TY الستربتومايسين-X-الحلاوة أجار D:. 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج على أجار الستربتومايسين، جنتاميسين-X-الحلاوة TY (المستعمرات الزرقاء هي recombinants واحد، خضعت المستعمرات البيضاء صحيح. تبادل كاسيت) E: 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج على أجار الستربتومايسين-X-الحلاوة TY تبين عدم وجود مضان F:. 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج على أجار الستربتومايسين، جنتاميسين-X-الحلاوة TY تظهر على مستويين من مضان (أكثر إشراقا المستعمرات تتوافق مع المستعمرات الزرقاء ويكون أعلى طلب تقديم العروض التعبير يفترض أن يعود إلى مروج للقراءة على الرغم من تسلسل ناقلات، حيث المستعمرات بعد أن خضع الحقيقية تبادل كاسيت تحتوي على طلب تقديم العروض مع مروج لها فقط مع فوري من خلال قراءة أي من المروج في أمريكا اللاتينية والكاريبي الناقل، والذي هو غائب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية IMCE يسمح التكامل الفعال للشريط الحمض النووي واحد attB يحيط في المكان، ليرة لبنانية من سلالة هندسيا سابقا. بمجرد أن يتم استنساخ التصور المطلوب بدلا من طلب تقديم العروض لإنشاء كاسيت المانحة، وهذه التقنية لا تتطلب اللاحقة تنقية الحمض النووي، وتحول، مما يجعلها قوية للغاية. فمن الأهمية بمكان أن يتم تضمين الضوابط نمو مناسب، لتكون على يقين من أن مقاومة المضادات الحيوية ويرجع ذلك إلى خلق عبر integrants وعوامل أخرى لا.
IMCE تنتج عبر integrants في كفاءة حوالي 0.5٪. في المقابل، عبر إعادة التركيب انتقال مزدوج مماثل يحدث على تردد حول 10 -6. Recombineering عبر λ الحمراء 16، نظام آخر بالعاثية القائم، يتطلب التماثل محددة، وتفاوتت فعالية خارج E. كولاي 17. حتى الآن خيار آخر، Tn7 إعادة التركيب موقع معين يتطلب attTn7 المواقع 18 4،19. على الرغم من أن استخدام ΦC31 integrase يتطلب هندسة من قبل مجموعة كبيرة، وهي ليست مقتصرة على بعض الفروع. IMCE والمزايا من الكفاءة ونمطية نظرا لاحتمال أن أي كاسيت المانحة أن تدمج في أي سلالة ليرة لبنانية. هذا هو المثل الأعلى للدراسات حيث يجب أن يكون مكتبة استنساخ واحد فحص وظيفيا في المضيفين متعددة نظرا إلى متطلبات التعبير الجيني أو الوراثي هو المطلوب تكامل في نسخة واحدة.
ويقتصر حجم التصور أن تكون متكاملة حسب حجم الحمض النووي التي يمكن استنساخها بنجاح في ناقلات عبر ربط الجهات المانحة. ويمكن استخدام ناقلات المانحة التي تحتوي على وجهات بوابة 20، وتكون مفيدة بشكل خاص للمكتبات كبيرة fosmid / cosmid إدراج. ويمكن أيضا علامات مقاومة المضادات الحيوية في ناقلات المانحين ستستخدم لاختيار لتيكان التجمع من تداخل الحمض النووي IMCE آخر شظايا من عبور مختلفين عبر integrants عبر تنبيغ، أو electroporation الجينومية 21. وينبغي تصميم هذا الاعتبار السماح للجمعية من بنيات كبير جدا في مكان الجريمة ليرة لبنانية، في سلالة ليرة لبنانية. وهذا قد يكون مفيدا بشكل خاص لإدماج البنى الجينات الاصطناعية للتطبيقات في الهندسة الأيضية أو البيولوجيا التركيبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
لسميث CM مارجريت لتوفير يرجى استنساخ integrase
بتمويل من:
الجينوم كندا / الجينوم المرج
NSERC اكتشاف ومنح المشروع الاستراتيجي
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
