Summary
미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.
Abstract
박테리아 염색체가 안정적으로 메가베이스 범위의 1에 외국의 DNA를 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 염색체에 통합은 플라스미드 복제, 플라스미드 안정성, 플라스미드 호환성 및 플라스미드 사본 번호 분산 등의 문제를 circumvents. 이 방법은 Streptomyces 파지 (Φ) C31 2,3에서 특정 사이트 integrase를 사용합니다. attB 및 attP (각각 34 39 BP) 4 : ΦC31 integrase 두 개의 특정 유전자 사이트 간의 직접적인 재조합을 catalyzes. 이러한 재조합은 안정하고 5 되돌릴 수 없습니다. spectinomycin - 저항 유전자, aadA (SpR), 그리고 E. 구성된 "방문 패드"(LP) 시퀀스 attP 사이트의 어귀 대장균 SS-glucuronidase 유전자가 (uidA) Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi 및 intergenic 지역의 Agrobacterium tumefaciens의의 염색체에 통합되었고, 오전각각 PC 현장, 그리고 tetA 현장. S. meliloti이 프로토콜에서 사용됩니다. stuffer 적색 형광 단백질 (RFP) 유전자와 항생제 내성 유전자 측면을 노릴 attB 사이트가있는 Mobilizable 기증자 벡터도 구축되었습니다. 이 예제에서는 gentamicin 내성 플라스미드 pJH110이 사용됩니다. RFP 유전자 6 SPH I 및 PST 나를 사용하여 원하는 구조로 대체될 수 있습니다 또는 attB 사이트의 어귀 합성 구조는 pK19mob 7과 mobilizable 벡터에 서브 복제있을 수 있습니다. ΦC31 integrase 유전자 (pHS62 8 일부터 복제)의 표현은 pRK7813 9 플라스미드 mobilizable 광범위한 호스트 범위에 LAC 프로 모터에 의해 구동됩니다.
tetraparental 짝짓기 프로토콜은 LP 변형이 됨으로써 기증자 카세트와 LP 시퀀스에서 마커를 교체로 기증자 카세트를 전송하는 데 사용됩니다. 이러한 세포는 트란입니다S-integrants. 횡단 integrants은 0.5 %의 전형적인 효율을 형성하고 있습니다. 횡단 integrants는 일반적으로 5 - 브로모 -4 - 클로로 -3 - 인돌릴 - 베타-D-glucuronic 이상해진 (X-gluc)을 사용하여 항생제 감수성이나 청색 - 흰색 심사에 의해 상영 첫 500-1,000 식민지 내에 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 횡단 integrants를 생성하고 분리를위한 짝짓기 및 선정 절차가 포함되어 있습니다.
Protocol
1. 문화 생산
- 타이 10 (5g / L tryptone, 3g / L 효모 추출물, 0.44 g / L 칼슘 염화물 탈수) 및 LB 11 (10g / L tryptone, 5g / L 효모 추출물, 5 G / : 무균 액체 매체를 준비합니다 나트륨 염화물, 산도 7).
- SmUW227 : 50 μg / ML의 spectinomycin와 타이의 미디어 (S. meliloti 천자 - 변형 : 건설 다른 곳에서 설명한 것이다는 요청시 사용 가능한 건축 세부 변형) () 5에 ML 단일 콜로니 접종. E. : 주어진 항생제와 보완 다음과 같은 변종 LB 액체 매체의 5 ML로를 접종 대장균은 DH5α 12 10 μg / ML 테트라 사이클린과 pJC2, 플라스미드 integrase 표현식을 포함하는, E. 대장균 10 μg / ML의 chloramphenicol과 MT616 13 mobilizer, 및 E. 대장균 DH5α 5 μg / ML의 gentamicin과 pJH110, 플라스미드 기증자 카세트를 포함하는.
- 품어 E. 37 AT & 하룻밤 대장균의 변종있길; 지속적인 진동과 C #. 품어 S. 떨고있는 이틀 동안 30 ° C에서 meliloti 변형. 그것은 S.를 얻을 수 있습니다 큰 inoculum (포화 문화 1:500 subculture)와 하룻밤 meliloti 문화.
2. 문화의 준비 및 혼합
- 30 초 동안 17000 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛를 수집하고 1 ML 멸균 0.85 % NaCl에 resuspending하여 각 변형에 대한 문화의 1.5 ML 씻으십시오, 반복을 한 번.
- 멸균 0.85 % NaCl을 100 μl의 Resuspend 펠릿.
- 개별적으로 일반 타이 한천 플레이트의 각 변형에 대한 형편없는 문화 10 μl을 더럽힐. 이들 명소는 제어 명소입니다.
- E.을 제외한 각 변형의 40 μl를 추가하십시오 대장균 DH5α 12 멸균 튜브, 믹스, 그리고 평범한 타이 한천 플레이트에이 혼합물의 장소 120 μl에 pJC2를 포함. 이 지점이 노 integrase 부정적인 컨트롤입니다.
- 멸균 t 각 변형의 40 μl를 추가하십시오ube, 믹스, 그리고 장소 평범한 타이 한천 플레이트에이 혼합물 160 μl. 이 지점이 IMCE 짝짓기 장소입니다.
- 장소는 층류 후드에서 건조하도록 허용합니다.
- 인감 플레이트 30 ° C에서 하룻밤 사이에서 품어.
3. 횡단 integrants의 분리
- 타이 한천 플레이트를 향해 행진 제어 명소와 IMCE 장소는 200 μg / ML의 스트렙토 마이신 (SmUW227가 스트렙토 마이신 14 높은 수준의 저항을 부여 돌연변이를 운반하는 Rm1021에 기초) 30 μg / ML gentamicin과 보충.
- IMCE 효율의 계산의 경우 약 resuspend ¼ 500 μl 멸균 0.85 % NaCl에서 IMCE 짝짓기 장소로. 10 -7로 10 배 시리얼 dilutions하십시오. 플레이트 dilutions 10 -2 횡단 integrants위한 선택 200 μg / ML의 스트렙토 마이신과 30 μg / ML gentamicin와 보충 타이 한천 플레이트에 -5 ~ 10. 플레이트 dilutions 10 -3 through 횡단 integrants하고 잠재받는 사람, 즉 총받는 사람 모두를 위해 선택 200 μg / ML의 스트렙토 마이신과 보완 타이 한천 플레이트 10 -7.
- markerless 횡단 integrants의 절연 위해 멸균 0.85 % NaCl 500 μl에 약 IMCE 짝짓기 장소의 4 분의 1을 resuspend. 10 -6으로 10 배 시리얼 dilutions하십시오. 200 μg / ML의 스트렙토 마이신 200 μg / ML X-gluc과 보완 네 타이 한천 플레이트 10 -6 ~ 10 -4 플레이트 dilutions.
- 3 일간 30 ° C에서 번호판을 품어.
- 녹색 표시등 (525 nm의) 아래와 빨간색 필터 (> 610 nm의) 15 조회수 RFP 횡단 integrants.
- 트랜스 integrants의 CFU 총받는 CFU에 비해 퍼센트 IMCE 효율을 계산합니다. 트랜스 integrants의 약 절반이 민감한 그들이 흰색과 spectinomycin 만드는 진정한 카세트 교환을받은 것입니다.
- markerless 횡단 integrants (W를 찾으려면여기 기증자 벡터가 하얀 식민지 (오랜 잠복기, 상온에서 1-2 여분의 일, X-gluc 통해 식민지의 차별을 향상시킬 것입위한 화면) pJH110에서처럼 GM R을 포함하지 않으며, 이것은 S.에 필요 meliloti SmUW227), 항생제 및 100 μg / ML의 spectinomycin를 포함하는 타이 한천 플레이트없이 타이 한천 플레이트에서 심사하여 식민지의 spectinomycin 감도를 확인합니다.
4. 대표 결과
타이에서 부화 3 일간은 스트렙토 마이신과 보완 및 gentamicin 후 제어 줄무늬가 더 성장을 할 필요가 거의 없습니다. IMCE의 행진은 헤드 탄력과 그림 2에서 본 두 번째 행진,에 많은 식민지에 합류 성장이 있어야합니다. 총받는 사람에게 횡단 integrants의 백분율로 표시 횡단 통합의 효율성은 0.5 %의 범위에 있어야합니다. 약 횡단 integrants의 절반은 spectinomycin 민감한과 흰색이 될 것입니다그들은 진정한 카세트 교환을받은 보여주는. 녹색 표시등 (525 nm의) 아래와 빨간색 필터 (> 610 nm의) 15을 통해 볼 때 pJH110에서 테스터 RFP 기증자 카세트를 포함하는 횡단 integrants는 뚜렷한 RFP의 형광을 표시해야합니다.
. 그림 1 활용 혼합물 일러스트 : pRK600에서 전송 유전자의 표현에 의해 주었는 plasmids의 모든 세포에서 세포로 무작위로 전송됩니다. IMCE, integrase (INT) 헬퍼 플라스미드 pJC2 및 기증자 플라스미드 pJH110에 필요한 두 plasmids의 LP - 변형의 인수를 통해 혼합물의 횡단 integrants의 생성,이 전송 결과입니다. 플라스미드 아닌 복제 기증자 (pJH110)에서 기증자 카세트 (LP-마커의 손실의 결과로, 염색체의 LP-카세트의 마커로 ΦC31 integrase 활동을 통해 교환되는 SPR과 uidA) 및 그 결과 횡단 필요 불가결의 기증자 카세트 (RFP와 GM R)의 유지.
그림 2. :. 한천 표면에 건조 세포 섞어 보여주는 비 선택적 타이 플레이트의 번식 장소 플레이트 B : 위로부터 스트렙토 마이신-gentamicin-X-gluc 플레이트에 streaked 번식 장소는 S.으로, 시계 방향으로 IMCE을 더 integrase 제어를 떠난 적이 meliloti, E. 대장균은 DH5α pJC2 컨트롤을 포함하는, E. 대장균은 pJH110 제어, E를 포함하는 DH5a 대장균 MT616 제어 및 S. . meliloti UW227 컨트롤 C :. 타이 스트렙토 마이신-X-gluc 한천 D의 짝짓기 현장 resuspension 10 -2 희석 : 타이 스트렙토 마이신-gentamicin-X-gluc 한천 (파란색 식민지가 단일 recombinants 위치에서 짝짓기 현장 resuspension 10 -2 희석, 하얀 식민지 사실받은. 카세트 교환) E : 형광의 부족을 보여주는 타이 스트렙토 마이신-X-gluc 한천의 짝짓기 현장 resuspension 10 -2 희석 F :. 두 가지 수준을 보여주는 타이 스트렙토 마이신-gentamicin-X-gluc 한천의 짝짓기 현장 resuspension 10 -2 희석 형광 (밝은 식민지가 청색 식민지에 해당하며 읽기 비록 식민지 사실 - 카세트 교환없이에서의 LAC업자로부터 읽기를 통해서만 그 즉시 발기인으로 RFP를 포함 겪은 것에 벡터 시퀀스에서 발기인으로 인해 아마도 높은 RFP 표현을 가지고 백터는 어느 결석입니다.).
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Discussion
IMCE 기술은 이전에 설계 변형율의 LP-현장으로 단일 attB 어귀의 DNA 카세트의 효율적인 통합을 허용합니다. 원하는 구조가 기증자 카세트를 만드는 RFP 자리에 복제되면 기술은 매우 강력하고, 이후 DNA를 정제 및 변환을 필요로하지 않습니다. 그것은 항생제 저항이 횡단 integrants 및 기타 아니라 요소의 생성에 의한 특정 말하면, 적절한 성장 컨트롤이 포함되어있는 것이 중요합니다.
IMCE은 약 0.5 %의 효율로 횡단 integrants을 생산하고 있습니다. 대조적으로, 동종 재조합을 통해 더블 크로스 오버는 -6 약 10의 주파수에서 발생합니다. λ-빨강 16, 또 다른 파지 기반 시스템을 통해 Recombineering 것은 특정 상동 있어야하고, E.의 외부 효과를 다양했습니다 대장균 17. 또 다른 옵션은 Tn7 사이트 구체적인 재조합은 attTn7 사이트 18이 필요합니다 4,19에 효율적인 활동을 보여주었다. ΦC31 integrase의 사용은 호스트의 사전 기술이 필요하지만, 그것은 특정 phyla에만 국한되지 않습니다. IMCE 효율성 및 기증자 카세트가 잠재적으로 어떤 천자 - 변형 통합될 수있다는 주어진 모듈화의 장점을 가지고 있습니다. 그것은 단일 클론 라이브러리는 기능적으로 유전자 발현 요건이나 단일 사본 유전자 complementation이 원하는됩니다 인해 여러 호스트에서 상영되어야 연구에 이상적입니다.
통합되는 구조의 크기는 성공적 결합을 통한 기증자 벡터로 복제 수있는 DNA의 크기에 의해 제한됩니다. 게이트웨이 목적지 20 포함하는 기증자 벡터를 사용하고, 대형 삽입 cosmid / fosmid 도서관을 위해 특히 유용합니다. 기증자 벡터에있는 항생 저항 마커는 t을 선택하는 데 사용할 수 있습니다그 형질 도입, 또는 게놈 electroporation 21을 통해 두 개의 서로 다른 횡단 integrants를 횡단하여 DNA 파편 포스트 IMCE을 중복의 조립. 이 디자인 고려 사항 천자 - 변형의 LP-현장에서 매우 큰 구조의 조립을 위해 허용해야합니다. 이것은 신진 대사 공학이나 합성 생물학 애플 리케이션을위한 합성 유전자 구조의 설립에 특히 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
친절 integrase의 클론을 제공하는 마가렛 CM 스미스에게
부터 지원 자금 :
게놈 캐나다 / 게놈 프레리
NSERC 발견과 전략적 사업 보조금
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
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