Summary
描述一个快速和有效的方法融入预制受体菌株，称为停机坪株，外源DNA的利益。该方法允许进入工程着陆垫一个给定的应变轨迹的站点特定的DNA盒的整合，通过共轭ΦC31整合表达。
Abstract
可用于细菌染色体的稳定保持在大型基地范围内1外源DNA。整合到染色体复制质粒，质粒稳定性，质粒不相容性和质粒拷贝数变异，如规避的问题。这种方法使用从链霉菌噬菌体（Φ）C31的2,3特定地点的整合。 ΦC31整合酶催化两个特定的DNA位点之间的直接重组：attB和attP（34和39个基点，分别）4。此重组是稳定的，并没有恢复5。一个“着陆垫”（LP）的1霉素抗性基因，AADA（SPR），和大肠杆菌组成的序列大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA基因 ）两侧attP网站已整合到苜蓿根瘤菌，Ochrobactrum anthropi，在区域间的农杆菌染色体， 上午PC轨迹和的TETA轨迹，分别与根瘤菌用于在该协议。捐助动员的载体侧翼1填塞红色荧光蛋白（RFP）基因和抗生素抗性基因的attB网站也已建成。在这个例子中使用庆大霉素的耐药质粒pJH110。使用SPH我和 Pst一所需的结构可能会被替换的RFP基因6另外attB网站两侧，可能是一种人工合成的构造子克隆到动员的载体，如pK19mob 7。由lac启动子驱动的ΦC31整合（克隆pHS62 8）基因的表达质粒pRK7813 9上动员的广泛的寄主范围。
一个tetraparental交配协议用于转移到捐助盒的LP菌株，从而取代捐助卡带在LP序列标记。这些细胞的移植S-稳定整合。横贯稳定整合，形成了0.5％的典型效率。横贯稳定整合通常是发现在第一500-1000菌落筛选抗生素的敏感性，或用5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X GLUC）蓝白筛选。该协议包含用于创建和隔离跨稳定整合的交配和选拔程序。
Protocol
1。文化生产
- 准备无菌液体介质：TY 10（5克/ L，蛋白胨，酵母提取物3克/升，0.44克/升的氯化钙脱水），11磅（10克/ L，蛋白胨，5 g / L酵母提取物，5克/氯化钠，pH值7）。
- 从一个单一的殖民地：TY传媒SmUW227（ 根瘤菌的 LP应变：建设将在别处描述，紧张施工细节要求）（）到5毫升50微克/毫升大观接种。接种以下株，到5毫升的LB液体培养基，给予抗生素补充： 大肠杆菌大肠杆菌 DH5α12 pJC2，整合表达载体，含10微克/毫升四环素; E。大肠杆菌 MT616 13日的动员，10微克/毫升氯霉素; 和 E。 大肠杆菌 DH5αpJH110，捐助卡带载体，含有5微克/毫升的庆大霉素。
- 孵育E。在37及隔夜大肠杆菌菌株度;ç不断晃动。孵育S。两天用颤抖的根瘤菌株在30°C。它有可能获得与根瘤菌文化具有较大的接种（1:500饱和文化的亚文化）过夜。
2。文化的制备和混合
- 每一株洗净文化1.5毫升离心收集细胞沉淀在17000 XG为30秒和1毫升无菌0.85％氯化钠重新悬浮;重复一次。
- 100无菌0.85％氯化钠液重悬沉淀。
- 个别发现每一个普通的TY琼脂平板上的应变10微升水洗文化。这些点是控制点。
- 加入40μL的每个菌株的大肠杆菌除外大肠杆菌 DH5α含有pJC2在无菌试管，混合，并当场这种混合物120μL纯TY琼脂平板上12。这点是没有整合阴性对照。
- 加入40μl每一株的无菌ţUBE，千姿百态，与现货160μL纯TY琼脂平板上这种混合物。这点是IMCE交配点。
- 允许点干层流罩。
- 密封板和30°C过夜孵育。
3。隔离跨稳定整合
- 连续控制点和IMCE点到TY平板补充200微克/毫升链霉素（SmUW227菌株Rm1021基于它带有一个突变赋予高级别抗链霉素14）和30微克/毫升的庆大霉素。
- 计算的IMCE效率的，悬浮约¼的的的IMCE交配点，在500μL无菌0.85％氯化钠。 10倍系列稀释至10-7。板稀释到10 10 -2 TY琼脂板补充200微克/毫升链霉素和30微克/毫升庆大霉素，选择跨稳定整合-5。板稀释度10 -3 THRough 10 -7补充200微克/毫升链霉素，选择反式稳定整合和潜在的受助人，即总受助TY琼脂板。
- 对于悬浮隔离的无标记转稳定整合约500μL无菌0.85％氯化钠一季度IMCE交配点。 10倍系列稀释至10-6。板稀释补充200微克/毫升链霉素和200微克/毫升的X GLUC四个TY琼脂板10-4到10-6。
- 3天在30°C孵育板。
- 查看RFP的反稳定整合在绿光（525纳米），并通过一个红色的过滤器（> 610 nm）的15。
- 计算％IMCE效率，反式稳定整合菌落形成单位相比，总受助人的菌落形成单位。大约一半的反式稳定整合将发生真正的磁带交换，使他们的白色和大观霉素敏感。
- 找到刘元反稳定整合（W，捐助向量在这里不包含像pJH110）屏幕为白色菌落（延长潜伏期，在室温下的额外1-2天，将加强分化的殖民地通过X GLUC的的通用汽车研究，这是必要的， 在 S 根瘤菌 SmUW227），TY琼脂平板上确认没有殖民地的筛选抗生素和TY琼脂板含有100微克/毫升大观霉素的敏感性。
4。代表结果
经过3天的潜伏期上TY辅以链霉素和庆大霉素控制条纹应该没有增长。 IMCE连胜应该有头连胜和图2可以看出，第二连胜的许多殖民地的融合发展。跨国整合的效率，跨稳定整合总受助人的百分比表示，应该在0.5％的范围内。约一半跨稳定整合，将大观霉素敏感和白色显示他们已经经历了真正的磁带交换。绿光（525纳米）下，通过一个红色的过滤器（> 610 nm）的15时，，横贯稳定整合包含从pJH110的测试RFP捐助卡带显示有迹可寻RFP的荧光。
图1共轭混合插图：质粒计算机辅助从pRK600转移基因的表达，都是随机从细胞到细胞转移。在混合物中的反式稳定整合创造IMCE，整合（int）的助手的质粒pJC2和捐助质粒pJH110所需的两个质粒通过的LP应变的收购，这种转移的结果。从非复制捐助质粒（pJH110）捐助卡带交换通过ΦC31整合活动的LP，磁带在染色体上的标记，造成损失的LP标记（SPr和uidA基因 ）和捐助卡带（RFP和通用汽车研究）中产生的反式完整之维护。
图2。答 ：非选择性的TY板琼脂表面上呈现出干细胞的混合物。接合点板A：链霉素，庆大霉素-X GLUC的板从顶部挑染的接合点，左顺时针没有整合控制，将与 IMCE 根瘤菌，E.大肠杆菌 DH5α， 大肠杆菌含有pJC2控制大肠杆菌 DH5a含有pJH110控制，E.大肠杆菌 MT616控制，S.根瘤菌 UW227 控制 C：10 -2稀释交配点悬浮上TY链霉素-X GLUC琼脂ð：10 -2上：TY链霉素，庆大霉素- X-GLUC琼脂（蓝色菌落是单一的重组稀释交配点悬浮，白色菌落的真实经历磁带交换） 电子邮件 ：10 -2的交配点悬浮TY链霉素-X GLUC的显示荧光不足的琼脂稀释传真：10 -2交配点悬浮TY链霉素，庆大霉素- X-GLUC两级琼脂稀释荧光（光明殖民地对应蓝色菌落，并具有较高的RFP表达大概是由于虽然读从向量序列，其中殖民地经历真正 的盒式交换包含只有立即启动与招标书没有读通过lac启动子载体，这是不存在的。）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该的IMCE技术允许为一个单一的attB两侧LP轨迹以前工程菌的DNA磁带的有效整合。一旦RFP创建捐助盒克隆所需的构造，该技术并不需要随后的DNA纯化和改造，使得它非常健壮。这是至关重要的，包括适当的生长控制，是某些抗生素耐药性是由于建立反稳定整合，而不是其他因素。
IMCE生产效率约0.5％的反式稳定整合。相反，通过同源重组的双重交叉发生在约10 -6的频率。 λ-红16，另一个噬菌体为基础的系统，通过重组工程，需要特定的同源性，并改变大肠杆菌以外的有效性大肠杆菌 17。另一种选择，Tn7转站点的具体重组需要attTn7网站18 4,19不同的主机。虽然使用ΦC31整合需要一个主机的前工程，它不仅限于某些门类。 IMCE有任何捐助卡带可能会被集成到任何LP应变的效率和模块化的优势。它是一个单一的克隆库的功能必须在多台主机由于基因表达的要求，或所需的单拷贝基因互补筛选研究的理想选择。
集成构造的规模是有限的，可以成功地通过结扎捐助载体克隆的DNA的大小。可用于捐助载体，包含网关目的地20，大型的插入fosmid /粘粒库特别有用。在捐助载体的抗生素抗性标记，也可能被用来选择为T他通过传导，或基因组电21跨越两个不同的反式-稳定整合重叠的DNA片段后IMCE大会。这样的设计应该考虑允许非常大的结构装配在在LP应变的LP轨迹。这可能是合成基因的结构，代谢工程或合成生物学的应用纳入特别有用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
请提供整合克隆玛格丽特厘米史密斯
资金支持：
加拿大基因组/基因组大草原
NSERC发现和战略项目赠款
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
