Summary
描述一个快速和有效的方法融入预制受体菌株,称为停机坪株,外源DNA的利益。该方法允许进入工程着陆垫一个给定的应变轨迹的站点特定的DNA盒的整合,通过共轭ΦC31整合表达。
Abstract
可用于细菌染色体的稳定保持在大型基地范围内1外源DNA。整合到染色体复制质粒,质粒稳定性,质粒不相容性和质粒拷贝数变异,如规避的问题。这种方法使用从链霉菌噬菌体(Φ)C31的2,3特定地点的整合。 ΦC31整合酶催化两个特定的DNA位点之间的直接重组:attB和attP(34和39个基点,分别)4。此重组是稳定的,并没有恢复5。一个“着陆垫”(LP)的1霉素抗性基因,AADA(SPR),和大肠杆菌组成的序列大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因(uidA基因 )两侧attP网站已整合到苜蓿根瘤菌,Ochrobactrum anthropi,在区域间的农杆菌染色体, 上午PC轨迹和的TETA轨迹,分别与根瘤菌用于在该协议。捐助动员的载体侧翼1填塞红色荧光蛋白(RFP)基因和抗生素抗性基因的attB网站也已建成。在这个例子中使用庆大霉素的耐药质粒pJH110。使用SPH我和 Pst一所需的结构可能会被替换的RFP基因6另外attB网站两侧,可能是一种人工合成的构造子克隆到动员的载体,如pK19mob 7。由lac启动子驱动的ΦC31整合(克隆pHS62 8)基因的表达质粒pRK7813 9上动员的广泛的寄主范围。
一个tetraparental交配协议用于转移到捐助盒的LP菌株,从而取代捐助卡带在LP序列标记。这些细胞的移植S-稳定整合。横贯稳定整合,形成了0.5%的典型效率。横贯稳定整合通常是发现在第一500-1000菌落筛选抗生素的敏感性,或用5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸(X GLUC)蓝白筛选。该协议包含用于创建和隔离跨稳定整合的交配和选拔程序。
Protocol
1。文化生产
- 准备无菌液体介质:TY 10(5克/ L,蛋白胨,酵母提取物3克/升,0.44克/升的氯化钙脱水),11磅(10克/ L,蛋白胨,5 g / L酵母提取物,5克/氯化钠,pH值7)。
- 从一个单一的殖民地:TY传媒SmUW227( 根瘤菌的 LP应变:建设将在别处描述,紧张施工细节要求)()到5毫升50微克/毫升大观接种。接种以下株,到5毫升的LB液体培养基,给予抗生素补充: 大肠杆菌大肠杆菌 DH5α12 pJC2,整合表达载体,含10微克/毫升四环素; E。大肠杆菌 MT616 13日的动员,10微克/毫升氯霉素; 和 E。 大肠杆菌 DH5αpJH110,捐助卡带载体,含有5微克/毫升的庆大霉素。
- 孵育E。在37及隔夜大肠杆菌菌株度;ç不断晃动。孵育S。两天用颤抖的根瘤菌株在30°C。它有可能获得与根瘤菌文化具有较大的接种(1:500饱和文化的亚文化)过夜。
2。文化的制备和混合
- 每一株洗净文化1.5毫升离心收集细胞沉淀在17000 XG为30秒和1毫升无菌0.85%氯化钠重新悬浮;重复一次。
- 100无菌0.85%氯化钠液重悬沉淀。
- 个别发现每一个普通的TY琼脂平板上的应变10微升水洗文化。这些点是控制点。
- 加入40μL的每个菌株的大肠杆菌除外大肠杆菌 DH5α含有pJC2在无菌试管,混合,并当场这种混合物120μL纯TY琼脂平板上12。这点是没有整合阴性对照。
- 加入40μl每一株的无菌ţUBE,千姿百态,与现货160μL纯TY琼脂平板上这种混合物。这点是IMCE交配点。
- 允许点干层流罩。
- 密封板和30°C过夜孵育。
3。隔离跨稳定整合
- 连续控制点和IMCE点到TY平板补充200微克/毫升链霉素(SmUW227菌株Rm1021基于它带有一个突变赋予高级别抗链霉素14)和30微克/毫升的庆大霉素。
- 计算的IMCE效率的,悬浮约¼的的的IMCE交配点,在500μL无菌0.85%氯化钠。 10倍系列稀释至10-7。板稀释到10 10 -2 TY琼脂板补充200微克/毫升链霉素和30微克/毫升庆大霉素,选择跨稳定整合-5。板稀释度10 -3 THRough 10 -7补充200微克/毫升链霉素,选择反式稳定整合和潜在的受助人,即总受助TY琼脂板。
- 对于悬浮隔离的无标记转稳定整合约500μL无菌0.85%氯化钠一季度IMCE交配点。 10倍系列稀释至10-6。板稀释补充200微克/毫升链霉素和200微克/毫升的X GLUC四个TY琼脂板10-4到10-6。
- 3天在30°C孵育板。
- 查看RFP的反稳定整合在绿光(525纳米),并通过一个红色的过滤器(> 610 nm)的15。
- 计算%IMCE效率,反式稳定整合菌落形成单位相比,总受助人的菌落形成单位。大约一半的反式稳定整合将发生真正的磁带交换,使他们的白色和大观霉素敏感。
- 找到刘元反稳定整合(W,捐助向量在这里不包含像pJH110)屏幕为白色菌落(延长潜伏期,在室温下的额外1-2天,将加强分化的殖民地通过X GLUC的的通用汽车研究,这是必要的, 在 S 根瘤菌 SmUW227),TY琼脂平板上确认没有殖民地的筛选抗生素和TY琼脂板含有100微克/毫升大观霉素的敏感性。
4。代表结果
经过3天的潜伏期上TY辅以链霉素和庆大霉素控制条纹应该没有增长。 IMCE连胜应该有头连胜和图2可以看出,第二连胜的许多殖民地的融合发展。跨国整合的效率,跨稳定整合总受助人的百分比表示,应该在0.5%的范围内。约一半跨稳定整合,将大观霉素敏感和白色显示他们已经经历了真正的磁带交换。绿光(525纳米)下,通过一个红色的过滤器(> 610 nm)的15时,,横贯稳定整合包含从pJH110的测试RFP捐助卡带显示有迹可寻RFP的荧光。
图1共轭混合插图:质粒计算机辅助从pRK600转移基因的表达,都是随机从细胞到细胞转移。在混合物中的反式稳定整合创造IMCE,整合(int)的助手的质粒pJC2和捐助质粒pJH110所需的两个质粒通过的LP应变的收购,这种转移的结果。从非复制捐助质粒(pJH110)捐助卡带交换通过ΦC31整合活动的LP,磁带在染色体上的标记,造成损失的LP标记(SPr和uidA基因 )和捐助卡带(RFP和通用汽车研究)中产生的反式完整之维护。
图2。答 :非选择性的TY板琼脂表面上呈现出干细胞的混合物。接合点板A:链霉素,庆大霉素-X GLUC的板从顶部挑染的接合点,左顺时针没有整合控制,将与 IMCE 根瘤菌,E.大肠杆菌 DH5α, 大肠杆菌含有pJC2控制大肠杆菌 DH5a含有pJH110控制,E.大肠杆菌 MT616控制,S.根瘤菌 UW227 控制 C:10 -2稀释交配点悬浮上TY链霉素-X GLUC琼脂ð:10 -2上:TY链霉素,庆大霉素- X-GLUC琼脂(蓝色菌落是单一的重组稀释交配点悬浮,白色菌落的真实经历磁带交换) 电子邮件 :10 -2的交配点悬浮TY链霉素-X GLUC的显示荧光不足的琼脂稀释传真:10 -2交配点悬浮TY链霉素,庆大霉素- X-GLUC两级琼脂稀释荧光(光明殖民地对应蓝色菌落,并具有较高的RFP表达大概是由于虽然读从向量序列,其中殖民地经历真正 的盒式交换包含只有立即启动与招标书没有读通过lac启动子载体,这是不存在的。)。
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Discussion
该的IMCE技术允许为一个单一的attB两侧LP轨迹以前工程菌的DNA磁带的有效整合。一旦RFP创建捐助盒克隆所需的构造,该技术并不需要随后的DNA纯化和改造,使得它非常健壮。这是至关重要的,包括适当的生长控制,是某些抗生素耐药性是由于建立反稳定整合,而不是其他因素。
IMCE生产效率约0.5%的反式稳定整合。相反,通过同源重组的双重交叉发生在约10 -6的频率。 λ-红16,另一个噬菌体为基础的系统,通过重组工程,需要特定的同源性,并改变大肠杆菌以外的有效性大肠杆菌 17。另一种选择,Tn7转站点的具体重组需要attTn7网站18 4,19不同的主机。虽然使用ΦC31整合需要一个主机的前工程,它不仅限于某些门类。 IMCE有任何捐助卡带可能会被集成到任何LP应变的效率和模块化的优势。它是一个单一的克隆库的功能必须在多台主机由于基因表达的要求,或所需的单拷贝基因互补筛选研究的理想选择。
集成构造的规模是有限的,可以成功地通过结扎捐助载体克隆的DNA的大小。可用于捐助载体,包含网关目的地20,大型的插入fosmid /粘粒库特别有用。在捐助载体的抗生素抗性标记,也可能被用来选择为T他通过传导,或基因组电21跨越两个不同的反式-稳定整合重叠的DNA片段后IMCE大会。这样的设计应该考虑允许非常大的结构装配在在LP应变的LP轨迹。这可能是合成基因的结构,代谢工程或合成生物学的应用纳入特别有用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
请提供整合克隆玛格丽特厘米史密斯
资金支持:
加拿大基因组/基因组大草原
NSERC发现和战略项目赠款
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
E. coli pJC2 strain | In House | ||
E. coli pJH110 strain | In House | ||
SmUW227 strain | In House |
References
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