Summary
En snabb och effektiv metod för att integrera främmande DNA av intresse i färdiga acceptor stammar, sk landning pad stammar, beskrivs. Metoden tillåter platsspecifik integration av ett DNA-kassett in i den konstruerade landningsplats lokus för en given stam, genom konjugering och uttryck av ΦC31 integras.
Abstract
Den bakteriella kromosomen kan användas för att stabilt hålla främmande DNA i mega-basen intervallet 1. Integrering i kromosomen kringgår frågor som plasmidreplikation, plasmidstabilitet, plasmid inkompatibilitet och plasmidkopieantalet varians. Denna metod används platsspecifika integras från Streptomyces fag (Φ) C31 2,3. Den ΦC31 integras katalyserar en direkt rekombination mellan två specifika DNA webbplatser: attB och attP (34 och 39 bp respektive) 4. Denna rekombination är stabil och inte återgå 5. En "landning dyna" (LP)-sekvens bestående av en spektinomycin-resistensgen, aadA (SPR), och E. coli ß-glukuronidasgenen (uidA) flankerad av ATTP ställen har integrerats i kromosomerna i Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi och Agrobacterium tumefaciens i en intergenregion, AMpC-lokuset och den tetA-lokuset, respektive. S. meliloti används i detta protokoll. Mobiliserbara donator vektorer innehållande attB-ställen som flankerar en stuffer röd fluorescerande protein (RFP)-genen och en gen för antibiotikaresistens har också konstruerats. I detta exempel är gentamicin resistenta plasmiden pJH110 används. RFP-genen 6 kan ersättas med en önskad konstruktion med användning av Sphl-och Pstl Alternativt en syntetisk konstruktion flankerad av attB ställen kan vara sub-klonades in i en mobiliserbar vektor såsom pK19mob 7. Uttrycket av ΦC31 integras-genen (klonad från pHS62 8) drives av lac-promotorn, på en mobiliserbar brett värdområde plasmiden pRK7813 9.
En tetraparental parning protokoll används för att överföra givaren kassetten in i LP-stam därigenom ersätta markörer i LP-sekvensen med givaren kassetten. Dessa celler är trans-integranter. Trans-integranter är utformade med en typisk effektivitet av 0,5%. Trans-integranter normalt återfinns inom de första 500-1,000 kolonier screenades genom antibiotikakänslighet eller blå-vit screening med användning av 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-glukuronsyra (X-gluc). Detta protokoll innehåller parning och urvalsförfaranden för att skapa och isolera trans-integranter.
Protocol
1. Produktion av kultur
- Framställa sterila flytande media: TY 10 (5 g / I trypton, 3 g / I jästextrakt, 0,44 g / liter kalciumklorid dehydrat) och LB-11 (10 g / I trypton, 5 g / I jästextrakt, 5 g / natriumklorid, pH 7).
- Inokulera från en enda koloni: SmUW227 (S. meliloti LP-stam: konstruktion kommer att beskrivas på annat håll, stamkonstruktion information tillgänglig på begäran) () i 5 ml TY media med 50 pg / ml spektinomycin. Ympa följande stammar i 5 ml medium LB vätska, som kompletterar den givet antibiotikum: E. coli DH5a innehållande 12 pJC2, integraset expressionsplasmid, med 10 | ig / ml tetracyklin; E. coli MT616 13, den mobiliseringsmedel, med 10 | ig / ml kloramfenikol, och E. coli DH5a innehållande pJH110, givaren kassetten plasmiden, med 5 | ig / ml gentamicin.
- Inkubera E. coli-stammar över natten vid 37 &°; C med konstant skakning. Inkubera S. meliloti töjning vid 30 ° C under två dagar med skakning. Det är möjligt att erhålla en S. meliloti kultur över natten med en större inokulum (1:500 subkultur av en mättad kultur).
2. Kultur Förberedelser och blandning
- Tvätta 1,5 ml kultur för varje stam genom uppsamling av cellpelleten genom centrifugering vid 17.000 xg under 30 sekunder och återsuspendering i 1 ml steril 0,85% NaCl; upprepa en gång.
- Återsuspendera pelleten i 100 | il sterilt 0,85% NaCl.
- Individuellt Spot 10 pl tvättat kultur för varje stam på en slätt TY agarplatta. Dessa fläckar är kontroll fläckar.
- Tillsätt 40 pl av varje stam med undantag av E. coli DH5a innehållande 12 pJC2 i ett sterilt rör, blanda och fläck 120 | il av denna blandning på en vanlig TY agarplatta. Denna plats är ingen integraset negativ kontroll.
- Tillsätt 40 pl av varje stam i en steril tUbe, blanda och plats 160 pl av denna blandning på en slätt TY agarplatta. Denna plats är IMCE parningen plats.
- Låt fläckar torka i ett dragskåp med laminärt flöde.
- Tätning plattorna och inkuberas vid 30 ° C över natten.
3. Isolering av Trans-integranter
- Svepkameror kontroll fläckar och IMCE plats på TY-agarplattor kompletterade med 200 | ig / ml streptomycin (SmUW227 är baserad på Rm1021 som bär en mutation som ger höggradig resistens mot streptomycin 14) och 30 pg / ml gentamicin.
- För beräkning av IMCE effektivitet, resuspendera ungefär ¼ av IMCE parningen plats i 500 ul steril 0,85% NaCl. Göra 10-faldiga serieutspädningar till 10 -7. Plattan utspädningar 10 -2 10 genom -5 på TY-agarplattor kompletterade med 200 | ig / ml streptomycin och 30 ng / ml gentamicin, för att selektera för trans-integranter. Plate utspädningar 10 -3 thrgrundlig 10 -7 på TY-agarplattor kompletterade med 200 | ig / ml streptomycin, för att selektera för de båda trans-integranter och potentiella mottagare, dvs totala mottagare.
- För isolering av markerless trans-integranter återsuspendera ungefär en fjärdedel av IMCE parning platsen i 500 | il sterilt 0,85% NaCl. Göra 10-faldiga serieutspädningar till 10 -6. Plattan utspädningar 10 -4 till 10 -6 på fyra TY-agarplattor kompletterade med 200 | ig / ml streptomycin och 200 | ig / ml X-gluc.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C under 3 dagar.
- Visa RFP trans-integranter enligt grönt ljus (525 nm) och genom ett rött filter (> 610 nm) 15.
- Beräkna effektiviteten procent IMCE som CFU trans-integranter jämfört med CFU totala mottagare. Ungefär hälften av trans-integranter kommer att ha genomgått sant kassett utbytet gör dem vita och spektinomycin känslig.
- För att hitta markerless trans-integranter (wHär givaren vektorn inte innehåller Gm r som i pJH110) skärm för en vit koloni (en längre inkubationstid, 1-2 extra dagar vid rumstemperatur, kommer att öka differentieringen av kolonier via X-gluc, är detta nödvändigt i S. meliloti SmUW227), bekräftar kolonins spektinomycin känsligheten genom screening på en TY agarplatta utan antibiotika och en TY agarplatta innehållande 100 pg / ml spektinomycin.
4. Representativa resultat
Efter tre dagars inkubering på TY kompletteras med streptomycin och gentamicin kontrollsystemen ränder bör inte ha någon tillväxt. Den IMCE strimma bör ha konfluent växt på huvudet strimma och många kolonier på den andra rad, såsom visas i fig 2. Effektiviteten av trans-integrering, uttryckt som procentandelen av trans-integranter till totala mottagare, bör vara inom intervallet 0,5%. Ungefär hälften av trans-integranter kommer att vara spektinomycin känslig och vittvisar att de har genomgått sanna kassett utbyte. Trans-integranter innehåller testaren RFP givaren kassetten från pJH110 ska visa märkbara RFP fluorescens när den betraktas under grönt ljus (525 nm) och genom ett rött filter (> 610 nm) 15.
. Figur 1 Konjugering blandning illustration: Med hjälp av uttrycket av överföringsfunktionerna gener från pRK600, är alla av de plasmider som överförs slumpmässigt från cell till cell. Denna överföring resulterar i skapandet av trans-integranter i blandningen genom LP-stammen: s förvärv av de två plasmider som krävs för IMCE den integras (int) hjälpprogram plasmid pJC2 och donatorplasmid pJH110. Donatorn kassetten från den icke-replikerande donatorplasmid (pJH110) utbyts via ΦC31 integrasaktivitet med markörer av LP-kassetten på kromosomen, vilket resulterar i förlust av LP-markörer (Spr och uidA) och upprätthållande av givaren kassetten (RFP och Gm r) i den resulterande trans-integrant.
Figur 2. A:. Parning spot plattan på en icke-selektiv TY plattan visar torkade cell blandningar på agarytan B: Parning fläckar ströks ut på streptomycin-gentamicin-X-gluc plattan, från övre vänstra medurs inte integras kontroll IMCE i S. meliloti, E. coli DH5a innehållande pJC2 kontroll, E. coli DH5a innehållande pJH110 kontroll, E. coli MT616 kontroll, och S. . meliloti UW227 kontroll C: 10 -2 utspädning av parning spot resuspension på TY streptomycin-X-gluc agar D:. 10 -2 utspädning av parning spot resuspension på TY streptomycin-gentamicin-X-gluc agar (blå kolonier är ensamstående rekombinanter, vita kolonier har genomgått sant. kassett växel) E: 10 -2 utspädning av parning spot resuspension på TY streptomycin-X-gluc agar visar brist på fluorescens F:. 10 -2 utspädning av parning spot resuspension på TY streptomycin-gentamicin-X-gluc agar visar två nivåer av fluorescens (ljusare kolonier motsvarar blå kolonier och har högre RFP uttryck förmodligen på grund av promotor läs-om än från vektorsekvens, där kolonier som genomgått sann kassett utbytet innehåller RFP med endast dess omedelbara promotor utan read-through från lac-promotorn i vektorn, vilket är frånvarande.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den IMCE Tekniken möjliggör effektiv integrering av ett enda flankerad attB DNA-kassett till LP-platsen för en tidigare konstruerad stam. När den önskade konstruktionen klonas i stället för RFP för att skapa givaren kassetten kräver tekniken inte efterföljande DNA rening och transformation, vilket gör det mycket robust. Det är viktigt att lämpliga tillväxt kontroller ingår, för att vara säker på att antibiotikaresistens beror på skapandet av trans-integranter och inte andra faktorer.
IMCE producerar trans-integranter cirka 0,5% effektivitet. I motsats härtill förekommer dubbel överkorsning via homolog rekombination vid en frekvens av omkring 10 -6. Recombineering via λ-röd 16, en annan fag system, kräver specifik homologi, och har varierat effektivitet utanför E. coli 17. Ännu ett annat alternativ, kräver Tn7 platsspecifik rekombination attTn7 webbplatser 18 4,19. Även om användningen av ΦC31 integras kräver ett föregående konstruktion av en värd, är den inte begränsad till vissa phyla. IMCE har fördelarna med verkningsgrad och modularitet eftersom varje donator kassetten kan potentiellt vara integrerad i en LP-stam. Det är idealiskt för studier där en enda klon biblioteket måste vara funktionellt screenas i flera värdar på grund av krav genuttryck eller genetisk komplementering i en enda kopia önskas.
Storleken av konstruktionen som skall integreras begränsas av storleken av DNA som med framgång kan klonas in i donator-vektorn via ligering. Donator vektorer innehållande Gateway destinationer 20 kan användas, och är särskilt användbar för stora insert fosmid / kosmid-bibliotek. De markörer för antibiotikaresistens i donator-vektorer kan också användas för att selektera för tHan montering av överlappande DNA-fragment efter IMCE genom att korsa två olika trans-integranter via transduktion eller genomisk elektroporation 21. Denna konstruktion man bör göra det möjligt för montering av mycket stora konstruktioner vid LP-locus i LP-stammen. Detta kan vara särskilt användbara för införlivande av syntetiska genkonstruktioner för tillämpningar inom metabolisk eller syntetiska biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Margaret CM Smith vänligt ge integras klonen
Finansiering stöd från:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery och strategiska projektbidrag
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
