Summary
Önceden hazırlanmış alıcı suşlar olarak adlandırılan iniş takımı suşları, içine faiz yabancı DNA entegre hızlı ve verimli bir yöntem tarif edilmiştir. Metodu ΦC31 integraz konjugasyonu ve ifadesi ile, belirli bir lamine suşun iniş pedi odağına içine bir DNA kasetinin site-specific entegrasyon sağlar.
Abstract
Bakteriyel kromozom stably Mega baz aralığında 1 yabancı DNA korumak için de kullanılabilir. Kromozom entegrasyon gibi plazmid çoğaltma, plazmid istikrar, plazmid uyumsuzluk ve plazmid kopya sayısı varyans gibi konular circumvents. Bu yöntem, Streptomyces faj (Φ) C31 2,3 den site-specific integraz kullanır. AttB ve attP (sırasıyla 34 ve 39 bp) 4: ΦC31 integraz iki spesifik DNA bölgeleri arasında doğrudan bir rekombinasyon katalizler. Bu rekombinasyon istikrarlı ve 5 geri almaz. Bir spectinomycin-direnç geninden, Aada (SPR), ve E. oluşan A "tampon iniş" (LP) sekansı attP siteleri çevrili coli ß-glukuronidaz geni (uidA) Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi ve bir intergenik bölgede Agrobacterium tumefaciens kromozomlarını entegre edilmiştir, duyuyorumsırasıyla pC odağı ve teta odağı,. S. meliloti Bu protokolde kullanılır. Bir stuffer kırmızı floresan proteini (rfp) geni ve antibiyotik direnç geni kuşatan attB siteleri içeren Mobilizable donör vektörler aynı zamanda inşa edilmiştir. Bu örnekte gentamisin dirençli plazmid pJH110 kullanılır. RFP geni 6 SPH I ve Pst I ile istenen yapı ile ikame edilebilir Alternatif attB siteleri tarafından çevrili sentetik bir yapı gibi pK19mob 7 gibi bir mobilizable vektörüne alt-klonlandı olabilir. ΦC31 integraz geni (pHS62 8 den klonlanmış) ile ifade pRK7813 9 plazmid bir mobilizable geniş bir aralığı üzerinde ana, lac promotör tarafından tahrik edilir.
Bir eşleşme tetraparental protokolü LP suşu böylece donör kaset ile LP sırayla değiştirme belirteçler içine donör kaset transfer etmek için kullanılır. Bu hücreler vardır trans-integrants. Trans-integrants% 0.5 arasında, tipik bir verim ile oluşturulanlardır. Trans-integrants tipik olarak 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-glukuronik asit (X-gluc) kullanılarak antibiyotik duyarlılığı veya mavi-beyaz tarama ile taranmıştır olanlar 500-1,000 koloniler içinde bulunurlar. Bu protokol, trans-integrants oluşturma ve izole etmek için çiftleşme ve seçme işlemleri içerir.
Protocol
1. Kültür Üretimi
- TY 10 (5 g / l tripton, 3 g / l maya ekstresi, 0.44 g / l kalsiyum klorid dihidrat), ve LB 11 (10 g / l tripton, 5 g / L maya ekstresi, 5 g /: steril sıvı ortam hazırlamak sodyum klorid, pH 7).
- SmUW227: 50 mg / ml spectinomycin ile TY medya (S. meliloti LP-suşu: inşaat kodlanabilir, istek üzerine inşaat detayları zorlanma) () 5 ml içine tek bir koloni inoküle. E.: verilen antibiyotik ile ilave aşağıdaki suşlar LB sıvı ortamları 5 ml içine inoküle coli DH5α 12 10 ug / ml tetrasiklin pJC2, plazmid integraz ifadesi, içeren; E. coli 10 ug / ml Kloramfenikol ile MT616 13, harekete geçirici, ve E. coli DH5α 5 ug / ml gentamisin ile pJH110, plazmid donör kaset, içeren.
- Inkübe E. 37 ve geceleme colideg; sürekli sarsıntı C. Inkübe S. çalkalama ile, iki gün süre ile 30 ° C 'de meliloti suşu. Bir S. elde etmek mümkündür Daha büyük bir inokulum (doymuş bir kültür alt kültürü 1:500) ile bir gece kültüre meliloti.
2. Kültür Hazırlama ve Karıştırma
- 30 saniye süreyle 17,000 x g'de santrifüj ile hücre peleti toplanması ve 1 ml steril% 0.85 NaCl içinde resuspending her bir suş için kültür 1.5 ml yıkanır; tekrarlanan bir kez.
- Steril% 0.85 NaCl 100 ul yılında Pastör pipetiyle pelet.
- Bireysel düz TY Agar yüzeyindeki her bir suş için yıkanmış kültür 10 ul nokta. Bu lekeler kontrol noktalar vardır.
- E. hariç her bir suş 40 ul ekleme coli DH5α 12 steril bir tüp, mix ve düz TY agar Bu karışımı spot 120 ul yılında pJC2 içeren. Bu nokta hiç integraz negatif kontrolüdür.
- Steril bir t, her bir suş 40 ul eklemeUbe, mix ve spot düz TY Agar yüzeyindeki bu karışımın 160 ul. Bu nokta IMCE çiftleşme yerdir.
- Noktalar bir laminer akış kaputu kurumasını bekleyin.
- Contası plakalar ve 30 ° C'da gece boyunca inkübe.
3. Trans-integrants İzolasyonu
- TY agar plaklarına Streak kontrol noktaları ve IMCE nokta 200 mikrogram / ml streptomisin (SmUW227 streptomisin 14 yüksek düzey direnç sağlayan bir mutasyon taşıdığı Rm1021 dayanmaktadır) ve 30 mg / ml gentamisin ile desteklenmiş.
- IMCE verimlilik hesaplanması için, yaklaşık tekrar süspansiyon ¼ 500 ul steril% 0.85 NaCl IMCE çiftleşme spot. 10 -7 ile 10 kat seri dilüsyonlar olun. Plaka dilüsyonları 10 -2 trans-integrants için seçmek için 200 mikrogram / ml streptomisin ve 30 mg / ml gentamisin, takviye TY Agar plaklarda -5 ile 10. Plaka dilüsyonları 10 -3 through trans-integrants ve potansiyel alıcılar, yani toplam alıcı hem de seçmek için 200 mg / ml streptomisin ile desteklenmiş TY agar 10 -7.
- Markerless trans-integrants izolasyonu için steril% 0.85 NaCl 500 ul yaklaşık IMCE çiftleşme nokta dörtte tekrar süspansiyon. 10 -6 10 kat seri dilüsyonlar olun. 200 ug / ml streptomisin ve 200 ug / ml X-gluc ile desteklenmiş dört TY agar plakalar üzerine 10 -6 ila 10 -4 plakası dilüsyonları.
- 3 gün süreyle 30 ° C'de inkübe.
- Yeşil ışık (525 nm) altında ve kırmızı bir filtre (> 610 nm) 15 üzerinden Profil RFP trans-integrants.
- Trans-integrants koloni sayısı toplam alıcı CFU kıyasla yüzde IMCE verimini hesaplayın. Trans-integrants yaklaşık yarısı duyarlı bunları beyaz ve spectinomycin yapım gerçek kaset değişim geçirmiş olacak.
- Markerless trans-integrants (w bulmak içinBurada donör vektör beyaz bir koloni (genişletilmiş bir inkübasyon süresi, oda sıcaklığında 1-2 gün fazladan, X-gluc ile koloniler farklılaşma artıracaktır için ekranda) pJH110 gibi Gm r içermez, bu S. gereklidir meliloti SmUW227), antibiyotikler ve 100 mg / ml spectinomycin içeren bir TY agar olmadan TY agar plaka tarama ile koloninin spectinomycin hassasiyeti onaylayın.
4. Temsilcisi Sonuçlar
TY üzerinde inkübasyon üç gün streptomisin ile desteklenmiş ve gentamisin sonra kontrolü çizgiler hiçbir büyüme olmalıdır. IMCE çizgi başı çizgi ve Şekil 2'de görüldüğü ikinci çizgi, birçok koloniler üzerinde birleşik büyüme olmalıdır. Toplam alıcıya trans-integrants bir yüzdesi olarak ifade trans-entegrasyon verimi,% 0.5 aralığında olmalıdır. Yaklaşık trans-integrants yarısı spectinomycin hassas ve beyaz olacakOnlar gerçek kaset döviz uğramıştır gösteren. Yeşil ışık (525 nm) altında ve kırmızı bir filtre (> 610 nm) 15 bakıldığında pJH110 gelen test rfp donör kaset içeren Trans-integrants ayırt RFP floresans göstermesi gerekir.
. Şekil 1 Konjugasyon karışımı çizimde: pRK600 gelen transfer genlerinin ifadesi tarafından Destekli, tüm plazmitler hücreden hücreye rastgele aktarılır. IMCE, integraz (int) yardımcı plazmid pJC2 ve donör plazmid pJH110 için gerekli iki plazmit LP-suşu satın alma yoluyla karışımı içinde trans-integrants oluşturulması, bu aktarma sonuçlanır. Plazmid olmayan kopyalayan donör (pJH110) gelen donör kaset (LP-marker kaybına neden kromozom üzerinde LP-kaset işaretleri ile ΦC31 integraz aktivite ile değiştirilir SpR ve uidA) ve sonuçta elde edilen trans-tamamlayıcı olarak donör kaseti (RFP ve GM r) bakım.
Şekil 2. A:. Agar yüzeyinde kuru hücre karışımları gösteren bir non-selektif TY plaka üzerinde Çiftleşme nokta plaka B: yukarıdan streptomisin-gentamisin-X-gluc plaka üzerinde çizgili Çiftleşme noktalar, S. içine, saat yönünde IMCE hiçbir integraz kontrolü yapmamışlar meliloti, E. coli DH5α pJC2 kontrolü ihtiva eden, E. coli pJH110 kontrolü, E. içeren DH5a coli MT616 kontrolü, ve S. . meliloti UW227 kontrolü C:. TY streptomisin-X-gluc agar D çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon: TY streptomisin-gentamisin-X-gluc agar (mavi koloniler tek rekombinantlar vardır üzerinde çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon, beyaz koloniler gerçek geçirmiş. kaset değişimi) E: floresans eksikliği gösteren TY streptomisin-X-gluc agar çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon F:. iki seviye gösteren TY streptomisin-gentamisin-X-gluc agar çiftleşme nokta tabanda 10 -2 dilüsyon floresans (parlak kolonileri mavi koloniler karşılık gelir ve salt rağmen koloniler gerçek kaset döviz no lac promotöründen salt üzerinden sadece onun hemen promotor ile RFP içeren geçirmediyse vektör sırası gelen organizatörü nedeniyle muhtemelen daha yüksek rfp ifade var Vektör, hangi yoktur.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IMCE tekniği önceden tasarlanmış suşu LP-lokusunda tek bir attB çevrili DNA kaset verimli entegrasyon sağlar. Istenen yapı donör kaset oluşturmak için RFP yerine klonlanmış sonra, tekniğin son derece güçlü hale, müteakip DNA arıtma ve dönüşüm gerektirmez. Bu antibiyotik direnci trans-integrants ve diğer değil faktörlerin oluşturulması nedeniyle belirli olabilmesi için, uygun büyüme kontrolleri dahil olduğunu önemlidir.
IMCE yaklaşık% 0.5 verimle trans-integrants üretir. Bunun aksine olarak, homolog rekombinasyon yoluyla çift geçiti -6 10 çevresindeki bir frekansta oluşur. Λ-kırmızı 16, başka bir faj tabanlı sistem üzerinden Recombineering özel homoloji gerektirir ve E. dışındaki etkinliğini değişmiştir coli 17. Henüz başka bir seçenek, Tn7 sitesi spesifik rekombinasyon attTn7 siteleri 18 gerektirir 4,19 in etkin bir etkinlik kanıtlamıştır. ΦC31 integraz kullanımı bir dizi önceden mühendisliği gerektirir de, bazı filumlar ile sınırlı değildir. IMCE verimlilik ve herhangi bir donör kaset potansiyel olarak herhangi bir LP-deformasyon entegre edilebilir verilen modülerlik avantajları vardır. Tek bir klon kütüphanesi işlevsel gen ekspresyonu gereksinimleri ya da tek nüsha olarak genetik tamamlayamamakta isteniyorsa nedeniyle çok sayıda hosts taranması gereklidir çalışmaları için idealdir.
Entegre edilmesi için bir yapı ve boyutu başarılı bir şekilde bağlanması yoluyla donör vektörüne klonlanmış edilebilir DNA'nın boyutu ile sınırlıdır. Ağ geçidi destinasyonlarda 20 içeren donör vektörler kullanılabilir ve geniş uç kosmid / fosmid kütüphaneleri için özellikle yararlıdır edilebilir. Donör vektörler içinde antibiyotik direnci belirteçler t seçmek için kullanılabiliro iletimi, ya da genomik elektroporasyon 21 üzerinden iki farklı trans-integrants geçerek DNA parçalarının yazılan IMCE örtüşen montajı. Bu tasarım göz LP-nesilin LP-lokustaki çok büyük yapıların montajı için izin vermelidir. Bu metabolik mühendislik veya sentetik biyoloji uygulamaları için sentetik gen yapıları birleştirmek için özellikle yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Nazik integraz klon sağlamak için CM Margaret Smith
Destek finansmanı:
Genom Kanada / Genom Prairie
NSERC Discovery ve Stratejik Proje hibeleri
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
