Summary
En hurtig og effektiv metode til at integrere fremmed DNA af interesse i præfremstillede acceptor stammer, betegnet landingsplads stammer, er beskrevet. Fremgangsmåden tillader stedspecifik integration af et DNA-kassette i det konstruerede landingsplads locus af en given stamme, gennem konjugation og ekspression af det ΦC31 integrase.
Abstract
Det bakterielle kromosom, kan anvendes til stabilt at opretholde fremmed DNA i mega-base mellem 1. Integration i kromosomet omgår emner såsom plasmidreplikation, plasmidstabilitet, plasmid uforenelighed, og antallet af plasmidkopier varians. Denne metode anvender den stedspecifikke integrase fra Streptomyces fagen (Φ) C31 2,3. Den ΦC31 integrase katalyserer en direkte rekombination mellem to specifikke DNA steder: attB og attP (34 og 39 bp, henholdsvis) 4. Denne rekombination er stabilt og ikke vende tilbage 5. En "landing pad" (LP) sekvensen bestående af en spectinomycin-resistens gen, Aada (SPR) og E. coli ß-glucuronidase-genet (uidA) flankeret af attP sites er blevet integreret i kromosomerne i Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi og Agrobacterium tumefaciens i en intergenisk region, ampC locus, og den tetA locus, hhv. S. meliloti anvendes i denne protokol. Mobiliserbar donor vektorer indeholdende attB-sites flankerer en stuffer rødt fluorescerende protein (RFP) gen og en antibiotisk resistens-gen er også blevet konstrueret. I dette eksempel gentamicin resistent plasmid pJH110 anvendes. RFP gen 6 kan erstattes med en ønsket konstruktion med Sph I og Pst I. Alternativt kan en syntetisk konstruktion flankeret af attB-sites kan være sub-klonet ind i en mobiliserbar vektor, såsom pK19mob 7. Ekspressionen af ΦC31 integrase-genet (klonet fra pHS62 8) drives af lac-promotoren på en mobiliserbar bredt værtsspektrum plasmid pRK7813 9.
En tetraparental parring protokol anvendes til at overføre donor kassetten i LP-stammen derved erstatte markører i LP-sekvensen med donor kassetten. Disse celler er trans-integranter. Trans-integranter er udformet med en typisk effektivitet på 0,5%. Trans-integranter er typisk inden for de første 500-1000 kolonier screenet ved antibiotisk følsomhed eller blå-hvid-screening ved anvendelse af 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucuronsyre (X-gluc). Denne protokol indeholder de parring og udvælgelse procedurer for at skabe og isolere trans-integranter.
Protocol
1. Produktion af Kultur
- Fremstille sterile flydende medier: TY 10 (5 g / l trypton, 3 g / l gærekstrakt, 0,44 g / l calciumchlorid dehydrat) og LB 11 (10 g / l trypton, 5 g / l gærekstrakt, 5 g / natriumchlorid, pH 7).
- Podes fra en enkelt koloni: SmUW227 (S. meliloti LP-stammen: konstruktion vil blive beskrevet andetsteds, stamme konstruktionsdetaljer til rådighed efter anmodning) () i 5 ml TY medier med 50 pg / ml spectinomycin. Inokulere følgende stammer i 5 ml LB flydende medier, til supplering med givet antibiotikum: E. coli DH5a 12 indeholdende pJC2, integrase ekspressionsplasmidet med 10 ug / ml tetracyclin, E. coli MT616 13, mobilizer med 10 ug / ml chloramphenicol, og E. coli DH5a, der indeholder pJH110, donor kassetten plasmid med 5 ug / ml gentamicin.
- Inkuber E. coli-stammer natten over ved 37 &grader; C med konstant omrystning. Inkuber S. meliloti stamme ved 30 ° C i to dage med omrystning. Det er muligt at opnå en S. meliloti kultur natten over med en større inokulum (1:500 subkultur af en mættet kultur).
2. Kultur Forberedelse og Blanding
- Vask 1,5 ml af kulturen for hver stamme ved opsamling af cellepelleten ved centrifugering ved 17.000 x g i 30 sekunder og resuspendering i 1 ml steril 0,85% NaCI; gentagelse gang.
- Resuspender pellet i 100 ul sterilt 0,85% NaCI.
- Individuelt øje 10 ul vasket kultur for hver stamme på en almindelig TY agar plade. Disse spots er kontrol pletter.
- Tilsæt 40 gl af hver stamme foruden E. coli DH5a 12 indeholdende pJC2 i et sterilt rør, blandes og plet 120 ul af denne blanding på en almindelig TY agar plade. Dette sted er no-integrase negativ kontrol.
- Tilsæt 40 gl af hver stamme i en steril tUbe, mix og plet 160 ul af denne blanding på en almindelig TY agar plade. Dette sted er IMCE parringen stedet.
- Tillader pletter at tørre i et stinkskab med sideværts luftstrømning.
- Forsegling og inkuber ved 30 ° C natten over.
3. Isolering af Trans-integranterne
- Streak kontrol pletter og IMCE stedet på TY-agarplader suppleret med 200 ug / ml streptomycin (SmUW227 er baseret på Rm1021 som bærer en mutation giver højt niveau resistens over for streptomycin 14) og 30 ug / ml gentamicin.
- Ved beregning af IMCE effektivitet, opblande ca ¼ af IMCE parring stedet i 500 ul sterilt 0,85% NaCl. Gøre 10-fold seriefortyndinger til 10 -7. Plade fortyndinger 10 -2 til 10 -5 på TY-agarplader suppleret med 200 ug / ml streptomycin og 30 ug / ml gentamicin, at selektere for trans-integranter. Plate fortyndinger 10 -3 through 10 -7 på TY-agar plader suppleret med 200 mg / ml streptomycin, for at vælge både trans-integranterne og potentielle modtagere, dvs alt modtagere.
- Til isolering af markerless trans-integranter resuspendere cirka en fjerdedel af IMCE parring stedet i 500 ul sterilt 0,85% NaCI. Gøre 10-fold seriefortyndinger til 10 -6. Plade fortyndinger 10 -4 til 10 -6 fire TY-agarplader suppleret med 200 ug / ml streptomycin og 200 ug / ml X-gluc.
- Pladerne inkuberes ved 30 ° C i 3 dage.
- View RFP trans-integranter under grønt lys (525 nm) og gennem et rødt filter (> 610 nm) 15.
- Beregne procent IMCE effektivitet som CFU af trans-integranter i forhold til CFU af de samlede modtagere. Omkring halvdelen af trans-integranterne vil have undergået sandt kassette udveksling gøre dem hvide og spectinomycin følsomme.
- For at finde de markerless trans-integranterne (wHer donor vektoren ikke indeholder Gm r som i pJH110) screening for en hvid koloni (en længere inkubationstid, 1-2 ekstra dage ved stuetemperatur, vil øge differentieringen af kolonier gennem X-gluc, det er nødvendigt i S. meliloti SmUW227), bekræfter koloniens spectinomycin følsomhed ved screening af en TY agar plade uden antibiotika og en TY agar-plade indeholdende 100 ug / ml spectinomycin.
4. Repræsentative resultater
Efter tre dages inkubation på TY suppleret med streptomycin og gentamicin kontrollen striber bør ikke have nogen vækst. Den IMCE streak bør have sammenflydende vækst på hovedet streak og mange kolonier på den anden stribe, som det ses i figur 2. Effektiviteten af trans-integration, udtrykt som procentdelen af trans-integranter de samlede modtagere, bør være i området fra 0,5%. Omkring halvdelen af trans-integranterne vil være spectinomycin følsom og hvidviser, at de har gennemgået en sand kassette udveksling. Trans-integranter, der indeholder testeren RFP donor kassetten fra pJH110 bør vise skelnelig RFP fluorescens, når de betragtes under grønt lys (525 nm) og gennem et rødt filter (> 610 nm) 15.
. Figur 1 Konjugering blanding illustration: Ved hjælp af ekspression af overføre gener fra pRK600, er alle plasmiderne overført tilfældigt fra celle til celle. Denne overførsel resulterer i dannelsen af trans-integranter i blandingen gennem LP-stammen erhvervelse af de to plasmider, der kræves for IMCE, integrase (int) hjælper-plasmid pJC2 og donorplasmidet pJH110. Donoren kassetten fra det ikke-replikerende donorplasmid (pJH110) udveksles via ΦC31 integrase-aktivitet med markører for LP-kassetten på kromosomet, hvilket resulterer i tab af LP-markører (SpR og uidA) og opretholdelse af donor kassetten (RFP og GM r) i den resulterende trans-integrant.
Figur 2. A:. Parringen spot plade på en ikke-selektivt TY skilt tørret celleblandinger på agaroverfladen B: Parring pletter udstrøget på streptomycin-gentamicin-X-gluc plade, fra øverst til venstre uret uden integrase kontrol IMCE i S. meliloti, E. coli DH5a, der indeholder pJC2 kontrol E. coli DH5a, der indeholder pJH110 kontrol E. coli MT616 kontrol, og S. . meliloti UW227 kontrol C: 10 -2 fortynding af sammenpassende plet resuspension på TY streptomycin-X-gluc agar D. 10 -2 fortynding af sammenpassende plet resuspension på TY streptomycin-gentamicin-X-gluc agar (blå kolonier er enkelte rekombinanter, hvide kolonier har undergået sandt. kassette udveksling) E: 10 -2 fortynding af sammenpassende plet resuspension på TY streptomycin-X-gluc agar viser mangel på fluorescens F: 10. -2 fortynding af sammenpassende plet resuspension på TY streptomycin-gentamicin-X-gluc agar viser to niveauer af fluorescens (lysere kolonier svarer til blå kolonier og har højere RFP ekspression formodentlig på grund af promotor læse-men fra vektorsekvens, hvor kolonier har undergået sand-kassette udveksling indeholder RFP med kun den umiddelbare promotor uden read-through fra lac-promotoren i vektoren, som er fraværende.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den IMCE teknik muliggør effektiv integration af en enkelt attB flankeres DNA'et kassetten i LP-locus af en tidligere udviklet stamme. Når den ønskede konstruktion klones i stedet for RFP at skabe donor kassetten, er teknikken ikke kræver efterfølgende DNA-oprensning og transformation, hvilket gør det meget robust. Det er vigtigt, at passende vækst kontroller er indbefattet, for at være sikker på antibiotikaresistens skyldes indførelsen af trans-integranter og ikke andre faktorer.
IMCE producerer trans-integranterne på cirka 0,5% effektivitet. I modsætning hertil sker dobbelt overkrydsning via homolog rekombination med en frekvens på 10 -6 ca. Recombineering via λ-rød 16, et andet fag baseret system, kræver særlig homologi, og har varieret effektivitet uden for E. coli 17. En anden mulighed, Tn7 site-specifik rekombination kræver attTn7 sites 18 4,19. Selv om anvendelsen af ΦC31 integrase kræver forudgående konstruktion af en vært, er den ikke begrænset til visse phyla. IMCE har fordelene ved effektivitet og modularitet da enhver donor kassette potentielt kan integreres i en LP-stamme. Den er ideel til studier, hvor en enkelt klon Biblioteket skal være funktionelt screenes i flere værter på grund af genekspression krav eller genetisk komplementering i ét eksemplar ønskes.
Størrelsen af konstruktionen, der skal integreres, er begrænset af størrelsen af DNA, der med held kan klones ind i donorvektoren via ligering. Donor vektorer indeholdende Gateway destinationer 20 kan anvendes, og er særligt anvendelige til store insert fosmid / cosmid biblioteker. De antibiotiske resistensmarkører i donor vektorer kan også anvendes til at selektere for than samling af overlappende DNA-fragmenter indlæg IMCE ved at krydse to forskellige trans-integranterne via transduktion, eller genomisk elektroporation 21. Denne konstruktion Man bør muliggøre samling af meget store konstruktioner ved LP-locus i LP-stammen. Dette kan være særligt anvendelig til inkorporering af syntetiske genkonstruktioner til anvendelser i den metaboliske teknik eller syntetisk biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
For at Margaret CM Smith for venlig at give integrase klon
Økonomisk støtte fra:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery og strategiske projekt tilskud
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
