Summary
एक त्वरित और कुशल पूर्व स्वीकर्ता उपभेदों, करार दिया लैंडिंग पैड उपभेदों में ब्याज की विदेशी डीएनए एकीकृत विधि वर्णित है. विधि एक भी तनाव के इंजीनियर लैंडिंग पैड ठिकाना में विकार और ΦC31 इंटिग्रेस की अभिव्यक्ति के माध्यम से एक डीएनए कैसेट की साइट विशेष एकीकरण की अनुमति देता है.
Abstract
बैक्टीरियल गुणसूत्र stably मेगा आधार सीमा 1 में विदेशी डीएनए बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. गुणसूत्र में एकता प्लाज्मिड प्रतिकृति, प्लाज्मिड स्थिरता, प्लाज्मिड असंगति, और प्लाज्मिड प्रतिलिपि संख्या विचरण जैसे मुद्दों circumvents. इस विधि Streptomyces फेज (Φ) C31 2,3 से इंटिग्रेस साइट विशेष का उपयोग करता है. AttB और attP (34 और 39 बीपी, क्रमशः) 4: ΦC31 इंटिग्रेस दो विशिष्ट डीएनए साइटों के बीच एक सीधा पुनर्संयोजन catalyzes. यह पुनर्संयोजन स्थिर है और करता है 5 वापस लौटने नहीं है. (LP) एक "लैंडिंग पैड" जीन spectinomycin प्रतिरोध, aadA (SPR), और ई से मिलकर अनुक्रम कोलाई एसएस glucuronidase (uidA) जीन attP साइटों द्वारा flanked Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, और एक intergenic क्षेत्र में Agrobacterium tumefaciens के गुणसूत्रों में एकीकृत किया गया है हूँ,पीसी ठिकाना, और teta ठिकाना, क्रमशः एस. meliloti इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. दाता गतिक्षम्य attB साइटों flanking एक stuffer लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) जीन और एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन युक्त वैक्टर भी निर्माण किया गया है. Gentamicin प्रतिरोधी प्लाज्मिड pJH110 इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता है. RFP 6 जीन एक वांछित Sph मैं और pst मैं का उपयोग करते हुए निर्माण के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है वैकल्पिक रूप से एक कृत्रिम निर्माण attB साइटों द्वारा flanked उप क्लोन ऐसे 7 pK19mob के रूप में एक गतिक्षम्य वेक्टर में हो सकता है. ΦC31 इंटिग्रेस जीन (8 pHS62 क्लोन है) के अभिव्यक्ति लाख प्रमोटर द्वारा संचालित है, एक गतिक्षम्य व्यापक मेजबान 9 pRK7813 प्लाज्मिड सीमा पर,.
एक tetraparental संभोग प्रोटोकॉल के एल.पी. तनाव जिससे दाता कैसेट के साथ एल.पी. अनुक्रम में मार्कर की जगह में दाता कैसेट हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन कोशिकाओं को ट्रॅनएस integrants. ट्रांस integrants 0.5% की एक विशिष्ट दक्षता के साथ गठन कर रहे हैं. ट्रांस integrants आम तौर पर पहले 500-1,000 एंटीबायोटिक संवेदनशीलता या नीला सफेद स्क्रीनिंग 5 - ब्रोमो - 4 - क्लोरो - 3 indolyl बीटा - डी - ग्लुकुरोनिक एसिड (एक्स gluc) का उपयोग करके जांच की कालोनियों के भीतर पाए जाते हैं. इस प्रोटोकॉल बनाने और अलग पार integrants के लिए संभोग और चयन प्रक्रिया में शामिल है.
Protocol
1. संस्कृति का उत्पादन
- 10 TY (5 ग्राम / एल tryptone है, 3 जी / एल निकालने खमीर, 0.44 छ / एल कैल्शियम क्लोराइड निर्जलीकरण), और 11 पौंड (10 छ / l tryptone, 5 खमीर छ / l निकालने, 5 / छ: बाँझ तरल मीडिया तैयार सोडियम क्लोराइड, 7 पीएच).
- : SmUW227 50 μg / spectinomycin मिलीलीटर के (एस एल.पी. तनाव meliloti: निर्माण कहीं वर्णित किया जाएगा, निर्माण अनुरोध पर उपलब्ध जानकारी के तनाव) (5) में TY मीडिया की मिलीलीटर एक एकल कॉलोनी से टीका लगाना. ई.: लेग तरल मीडिया की 5 मिलीलीटर में निम्नलिखित उपभेदों, टीका लगाना दिया एंटीबायोटिक के साथ सप्लीमेंट कोलाई 12 DH5α pJC2, में इंटिग्रेस प्लाज्मिड अभिव्यक्ति, जिसमें 10 μg / मिलीलीटर टेट्रासाइक्लिन के साथ, ई. और MT616, ई. 13, mobilizer, 10 μg / मिलीलीटर chloramphenicol साथ कोलाई कोलाई DH5α 5 μg / मिलीलीटर gentamicin, के साथ युक्त pJH110, दाता प्लाज्मिड कैसेट,.
- अंडों पर बैठना ई. 37 और रात भर कोलाई उपभेदोंडिग्री, लगातार झटकों के साथ सी. सेते हैं एस. झटकों के साथ दो दिनों के लिए 30 ° C पर meliloti तनाव. यह संभव है एक एस प्राप्त meliloti संस्कृति एक बड़ा inoculum (एक संतृप्त संस्कृति के उपसंस्कृति 1:500) के साथ रात भर.
2. संस्कृति तैयार करना और मिश्रण
- प्रत्येक तनाव के लिए centrifugation द्वारा सेल गोली 17,000 XG में 30 सेकंड के लिए इकट्ठा करने और 1 मिलीलीटर बाँझ 0.85% NaCl में resuspending धोकर संस्कृति के 1.5 मिलीलीटर, एक बार दोहराने.
- के बाँझ 0.85% NaCl 100 μl में resuspend गोली.
- व्यक्तिगत रूप से एक सादे TY अगर प्लेट पर प्रत्येक तनाव लिए धोया संस्कृति की 10 μl हाजिर. इन स्थानों नियंत्रण धब्बे होते हैं.
- प्रत्येक तनाव को छोड़कर ई. के 40 μl जोड़ें कोलाई DH5α 12 एक बाँझ ट्यूब, मिश्रण, और स्थान एक सादे TY अगर प्लेट पर 120 इस मिश्रण की μl में pJC2 युक्त. इस मौके नहीं इंटिग्रेस नकारात्मक नियंत्रण है.
- एक बाँझ टी में प्रत्येक तनाव के 40 μl जोड़ेंयूबे, मिश्रण, और स्थान एक सादे TY अगर प्लेट पर इस मिश्रण के 160 μl. इस मौके IMCE संभोग स्थान है.
- स्पॉट एक लामिना का प्रवाह हुड में शुष्क करने की अनुमति दें.
- सील प्लेटें और 30 ° रात भर सी सेते हैं.
3. ट्रांस integrants का अलगाव
- लकीर नियंत्रण धब्बे और IMCE स्थान TY अगर प्लेट पर 200 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (SmUW227 Rm1021 पर आधारित है जो एक 14 स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए उच्च स्तर के प्रतिरोध प्रदान उत्परिवर्तन किया जाता है) और 30 / μg मिलीलीटर gentamicin, के साथ पूरक हैं.
- IMCE दक्षता की गणना के लिए, लगभग 500 μl बाँझ 0.85% NaCl में IMCE संभोग स्थान की ¼ resuspend. -7 10 से 10 गुना धारावाहिक dilutions के बनाओ. प्लेट dilutions के 10 -2 10 TY अगर प्लेट 200 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 30 μg / एमएल gentamicin, के साथ पूरक के पार integrants के लिए चयन पर -5 के माध्यम से. प्लेट 10 -3 thr dilutionsough 10 -7 TY अगर प्लेट 200 μg / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, साथ पूरक करने के लिए दोनों पार integrants और संभावित प्राप्तकर्ताओं, यानी कुल प्राप्तकर्ताओं के लिए चयन पर.
- Markerless पार integrants के अलगाव के लिए लगभग के बाँझ 0.85% NaCl 500 μl में IMCE संभोग स्थान की एक तिमाही resuspend है. -6 10 से 10 गुना धारावाहिक dilutions के बनाओ. प्लेट चार TY अगर 200 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 200 μg / में मिलीलीटर एक्स - gluc है के साथ पूरक प्लेटों पर 10 -6 10 -4 dilutions के.
- 30 ° C पर 3 दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं.
- देखें आरएफपी हरी बत्ती (525 एनएम) के नीचे और एक लाल (> 610 एनएम) 15 फिल्टर के माध्यम से पार integrants.
- प्रतिशत IMCE दक्षता गणना के रूप में CFU पार integrants की कुल प्राप्तकर्ताओं की CFU करने की तुलना में. ट्रांस integrants के लगभग आधा सच कैसेट विनिमय आया है उन्हें सफेद और spectinomycin संवेदनशील बना रही है.
- Markerless - पार integrants w (खोजनेयहाँ दाता वेक्टर ग्राम आर pJH110 में) की तरह एक सफेद कालोनी (एक विस्तारित ऊष्मायन अवधि, कमरे के तापमान पर 1-2 दिन अतिरिक्त, एक्स gluc के माध्यम से कालोनियों के भेदभाव को बढ़ाने के लिए स्क्रीन को शामिल नहीं करता है, यह एस में आवश्यक है SmUW227 meliloti), TY अगर प्लेट पर एंटीबायोटिक दवाओं और एक TY अगर प्लेट 100 μg / मिलीलीटर spectinomycin युक्त बिना कॉलोनी की स्क्रीनिंग द्वारा spectinomycin संवेदनशीलता की पुष्टि.
4. प्रतिनिधि परिणाम
TY पर ऊष्मायन के तीन दिनों के बाद स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ पूरक और gentamicin नियंत्रण धारियाँ कोई विकास नहीं होना चाहिए. IMCE लकीर सिर लकीर और दूसरी लकीर, के रूप में चित्रा 2 में देखा पर कई कालोनियों पर मिला हुआ विकास होना चाहिए. पार एकीकरण की दक्षता, पार integrants की कुल प्राप्तकर्ताओं को प्रतिशत के रूप में व्यक्त की, 0.5% की सीमा में होना चाहिए. लगभग ट्रांस integrants के आधे spectinomycin संवेदनशील और सफेद हो जाएगावे सच दिखाना कैसेट विनिमय आया है. ट्रांस integrants परीक्षक RFP दाता कैसेट pJH110 से युक्त discernable आरएफपी प्रतिदीप्ति जब हरी बत्ती (525 एनएम) के तहत और एक लाल (> 610 एनएम) 15 फिल्टर के माध्यम से देखा जाना चाहिए.
चित्रा संयुग्मन एक मिश्रण उदाहरण: pRK600 से हस्तांतरण जीन की अभिव्यक्ति के द्वारा सहायता प्राप्त, प्लास्मिड की सभी बेतरतीब ढंग से सेल से सेल करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. मिश्रण में ट्रांस integrants के निर्माण में दो IMCE, (int) इंटिग्रेस सहायक प्लास्मिड pJC2 और दाता प्लाज्मिड pJH110 है के लिए आवश्यक plasmids के एल.पी. - तनाव के अधिग्रहण के माध्यम से, इस हस्तांतरण का परिणाम है. गैर नकल प्लाज्मिड दाता (pJH110) के दाता कैसेट, एल.पी. - कैसेट के गुणसूत्र पर मार्कर के साथ ΦC31 इंटिग्रेस गतिविधि के माध्यम से बदल जाता है, एल.पी. मार्करों के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप (सपाअनुसंधान और uidA) और परिणामस्वरूप पार अविभाज्य में दाता कैसेट (RFP ग्राम और आर) के रखरखाव.
चित्रा 2. एक: एक गैर चयनात्मक TY अगर सतह पर सूखे सेल मिश्रण दिखा प्लेट पर संभोग स्थान प्लेट बी संभोग स्ट्रेप्टोमाइसिन - gentamicin एक्स - gluc प्लेट पर रेखादार धब्बे, ऊपर से दक्षिणावर्त नहीं इंटिग्रेस नियंत्रण छोड़ दिया, एस में IMCE meliloti, ई. कोलाई DH5α pJC2 नियंत्रण वाले ई., कोलाई pJH110 नियंत्रण, ई युक्त DH5a कोलाई MT616 नियंत्रण, और एस. 10 TY डी स्ट्रेप्टोमाइसिन एक्स gluc अगर -2 संभोग स्थान मेजबान के कमजोर पड़ने meliloti UW227 नियंत्रण सी 10 TY अगर स्ट्रेप्टोमाइसिन - gentamicin, एक्स - gluc (नीले कालोनियों एकल recombinants है पर -2 संभोग स्थान मेजबान के कमजोर पड़ने, सफेद कालोनियों सच आया हैकैसेट) विनिमय ई -2 कमजोर पड़ने संभोग TY स्ट्रेप्टोमाइसिन एक्स gluc प्रतिदीप्ति की कमी दिखा अगर मौके पर मेजबान के 10 एफ: 10 TY स्ट्रेप्टोमाइसिन - gentamicin, एक्स - gluc दिखा अगर दो स्तरों पर -2 संभोग स्थान मेजबान के कमजोर पड़ने प्रतिदीप्ति (उज्जवल कालोनियों नीले कालोनियों के अनुरूप और उच्च RFP अभिव्यक्ति संभवतः वेक्टर अनुक्रम, जहां कालोनियों आया सच कैसेट विनिमय केवल अपने तत्काल प्रमोटर के साथ कोई में लाख प्रमोटर से पढ़ने के माध्यम से के साथ आरएफपी होते हैं - हालांकि पढ़ने के प्रमोटर से की वजह से है वेक्टर है, जो अनुपस्थित है). है.
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Discussion
IMCE तकनीक एकल attB चारों पहले इंजीनियर तनाव की एल.पी. बिन्दुपथ में डीएनए कैसेट के कुशल एकीकरण के लिए अनुमति देता है. एक बार वांछित निर्माण rfp की जगह दाता कैसेट बनाने में क्लोन है, तकनीक के बाद डीएनए शुद्धि और परिवर्तन की आवश्यकता नहीं करता, यह बहुत मजबूत बनाने. यह महत्वपूर्ण है कि उचित विकास नियंत्रण शामिल हैं, के लिए कुछ एंटीबायोटिक प्रतिरोध पार integrants और नहीं अन्य कारकों के निर्माण की वजह से है.
IMCE लगभग 0.5% की दक्षता पर पार integrants पैदा करता है. इसके विपरीत, मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से डबल विदेशी लगभग 10 -6 के एक आवृत्ति पर होता है. 16 λ - लाल, एक और फेज आधारित प्रणाली के माध्यम से Recombineering विशिष्ट अनुरूपता की आवश्यकता है, और ई. के बाहर प्रभाव विविध 17 कोलाई. अभी तक एक और विकल्प, Tn7 साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन attTn7 18 साइटों की आवश्यकता 4,19 मेजबान में कुशल गतिविधि का प्रदर्शन किया है. हालांकि ΦC31 इंटिग्रेस के उपयोग के एक मेजबान के पहले इंजीनियरिंग की आवश्यकता है, यह निश्चित संघों तक सीमित नहीं है. IMCE दक्षता और प्रतिरूपकता दिया कि किसी भी दाता कैसेट संभावित किसी भी एल.पी. तनाव में एकीकृत किया जा सकता है का लाभ है. यह अध्ययन है जहां एक ही क्लोन पुस्तकालय कार्यात्मक कई आवश्यकताओं जीन की अभिव्यक्ति या एक प्रति में आनुवंशिक complementation वांछित है के कारण सेनाओं में जांच की जानी चाहिए के लिए आदर्श है.
एकीकृत किया जा निर्माण के आकार कि ligation के माध्यम से दाता वेक्टर में सफलतापूर्वक क्लोन किया जा सकता है डीएनए के आकार के द्वारा सीमित है. दाता गेटवे 20 गन्तव्य स्थानो युक्त वैक्टर, इस्तेमाल किया जा सकता है और विशेष रूप से बड़े डालने / fosmid cosmid पुस्तकालयों के लिए उपयोगी होते हैं. दाता वैक्टर में एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों भी टी के लिए चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैवह विधानसभा पारगमन, या जीनोमिक 21 electroporation के माध्यम से दो अलग अलग पार integrants पार से डीएनए टुकड़े पोस्ट IMCE अतिव्यापी की. इस डिजाइन विचार एल.पी. तनाव में एल.पी. ठिकाना पर बहुत बड़ी constructs की विधानसभा के लिए अनुमति चाहिए. यह विशेष रूप से चयापचय इंजीनियरिंग या सिंथेटिक जीव विज्ञान में आवेदन के लिए कृत्रिम जीन constructs के समावेश के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
कृपया इंटिग्रेस क्लोन प्रदान करने के लिए मार्गरेट मुख्यमंत्री स्मिथ
से समर्थन अनुदान:
जीनोम / कनाडा जीनोम Prairie
से NSERC डिस्कवरी और सामरिक परियोजना अनुदान
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
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