Summary
En rask og effektiv metode for å integrere fremmed DNA av interesse i pre-laget akseptor stammer, betegnes Matte stammer, er beskrevet. Metoden gjør at stedsspesifikk integrering av en DNA kassetten inn i konstruert landing puten locus av en gitt belastning, gjennom konjugering og uttrykk for ΦC31 integrase.
Abstract
Bakteriell kromosom kan brukes til stabilt opprettholde fremmed DNA i mega-basen rekkevidde en. Integrering i kromosomet omgår spørsmål som plasmid replikasjon, plasmid stabilitet, plasmid inkompatibilitet, og plasmid kopi nummer varians. Denne metoden bruker stedsspesifikk integrase fra Streptomyces phage (Φ) C31 2,3. Den ΦC31 integrase katalyserer en direkte rekombinasjon mellom to spesifikke DNA sider: attB og attP (34 og 39 bp, henholdsvis) 4. Dette rekombinasjon er stabil og ikke gå tilbake ikke fem. En "landing pad" (LP) sekvens bestående av en spektinomycin-motstand genet, aadA (SPR), og E. coli ß-glucuronidasesystemer genet (uidA) flankert av attP nettsteder har blitt integrert inn i kromosomene i Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, og Agrobacterium tumefaciens i en intergenic regionen, ampC locus, og tetA locus, henholdsvis. S. meliloti brukes i denne protokollen. Mobilizable donor vektorer som inneholder attB nettsteder flankerer en stuffer rød fluorescerende protein (RFP) genet og en antibiotikaresistens genet har også blitt konstruert. I dette eksempelet gentamicin motstandsdyktig plasmidet pJH110 brukes. Den RFP genet 6 kan erstattes med en ønsket konstruksjon med sph jeg og PST I. Alternativt kan en syntetisk konstruksjon flankert av attB nettsteder kan være sub-klonet inn i en mobilizable vektor som pK19mob 7. Uttrykket av ΦC31 integrase genet (klonet fra pHS62 8) er drevet av lac arrangøren, på en mobilizable bredt vertsområde plasmid pRK7813 9.
En tetraparental parring protokollen brukes til å overføre donor kassetten inn i LP belastningen dermed erstatte markørene i LP sekvens med donor kassett. Disse cellene er trans-integrants. Trans-integrants er dannet med en typisk virkningsgrad på 0,5%. Trans-integrants finnes vanligvis i løpet av de første 500-1000 koloniene filtrert av antibiotika følsomhet eller blå-hvite screening ved hjelp av 5-Bromo-4-klor-3-indolyl-beta-D-glukuronsyre (X-Gluc). Denne protokollen inneholder sammenføyningsflatene og utvalg prosedyrer for å lage og isolere trans-integrants.
Protocol
1. Produksjon av Kultur
- Forbered sterile flytende medier: TY 10 (5 g / l tryptone, 3 g / l gjærekstrakt, 0,44 g / l kalsiumklorid dehydrere), og LB 11 (10 g / l tryptone, 5 g / l gjærekstrakt, 5 g / natriumklorid, pH 7).
- Inokuler fra en enkelt koloni: SmUW227 (S. meliloti LP-stamme: konstruksjonen vil bli beskrevet andre steder, strain konstruksjonsdetaljer tilgjengelige på forespørsel) () til 5 ml TY media med 50 mikrogram / ml spektinomycin. Inokuler følgende stammer i 5 ml LB flytende medier, som supplerer med den gitte antibiotika: E. coli DH5α 12 inneholder pJC2, den integrase uttrykket plasmid, med 10 mikrogram / ml tetracyklin; E. coli MT616 13, mobilizer, med 10 mikrogram / ml kloramfenikol, og E. coli DH5α inneholder pJH110, donor kassett plasmid, med 5 mikrogram / ml gentamicin.
- Inkuber E. coli-stammer natten ved 37 &grader; C med konstant risting. Inkuber S. meliloti belastning ved 30 ° C i to dager med risting. Det er mulig å oppnå en S. meliloti kultur natten med en større podestoff (1:500 subkultur av en mettet kultur).
2. Kultur Klargjøring og Mixing
- Vask 1,5 ml av kultur for hver stamme ved å samle den cellepelleten ved sentrifugering på 17 000 xg i 30 sekunder og resuspending i 1 ml steril 0,85% NaCl, gjenta en gang.
- Resuspender pellet i 100 mL sterilt 0,85% NaCl.
- Individuelt øye 10 mL av vasket kultur for hver belastning på en vanlig TY agar plate. Disse flekkene er kontroll flekker.
- Legg 40 mL av hver stamme utenom E. coli DH5α 12 inneholder pJC2 i et sterilt rør, mix, og flekk 120 mL av denne blandingen på en vanlig TY agar plate. Dette punktet er det ingen integrase negativ kontroll.
- Legg 40 mL av hver stamme i et sterilt tUbe, mix, og flekk 160 mL av denne blandingen på en vanlig TY agar plate. Dette punktet er det IMCE paring spot.
- La flekker tørke i en laminær hette.
- Seal plater og Inkuber ved 30 ° C over natten.
3. Isolering av trans-integrants
- Streak kontroll flekker og IMCE spot-inn på TY agar plater supplert med 200 mikrogram / ml streptomycin (SmUW227 er basert på Rm1021 som bærer en mutasjon overdragelse høyt nivå mot streptomycin 14) og 30 mikrogram / ml gentamicin.
- For beregning av IMCE effektivitet, resuspender ca ¼ av IMCE parring sted i 500 mL sterilt 0,85% NaCl. Lag 10-fold seriefortynning til 10 -7. Plate fortynninger 10 -2 til 10 -5 på TY agar plater supplert med 200 mikrogram / ml streptomycin og 30 mikrogram / ml gentamicin, for å velge for trans-integrants. Plate fortynninger 10 -3 through 10 -7 på TY agar plater supplert med 200 mikrogram / ml streptomycin, for å velge både trans-integrants og potensielle mottakere, dvs. totalt mottakere.
- For isolering av markerless trans-integrants resuspender omtrent en fjerdedel av IMCE parring sted i 500 mL sterilt 0,85% NaCl. Lag 10-fold seriefortynning til 10 -6. Plate fortynninger 10 -4 til 10 -6 på fire TY agar plater supplert med 200 mikrogram / ml streptomycin og 200 mikrogram / ml X-Gluc.
- Inkuber skålene ved 30 ° C i 3 dager.
- Vis RFP trans-integrants etter grønt lys (525 nm) og gjennom en rød filter (> 610 nm) 15.
- Beregn prosent IMCE effektivitet som CFU av trans-integrants forhold til CFU av totalt mottakere. Omtrent halvparten av trans-integrants vil ha gjennomgått sann kassett utveksling gjør dem hvite og spektinomycin følsom.
- For å finne de markerless trans-integrants (wHer donor vektor ikke inneholder Gm r som i pJH110) skjerm for en hvit koloni (en lengre inkubasjonstid, 1-2 ekstra dager ved romtemperatur, vil øke differensieringen av koloniene via X-Gluc, er dette nødvendig i S. meliloti SmUW227), bekrefter koloniens spektinomycin følsomhet ved screening på en TY agar plate uten antibiotika og en TY agar plate inneholder 100 mikrogram / ml spektinomycin.
4. Representative Resultater
Etter tre dagers inkubasjon på TY supplert med streptomycin og gentamicin kontrollpunktene striper bør ikke ha vekst. Den IMCE strek bør ha konfluent vekst på hodet strek og mange kolonier på andre strek, sett i Figur 2. Effektiviteten av trans-integrasjon, uttrykt som prosentandelen av trans-integrants til totale mottakere, bør være i størrelsesorden 0,5%. Omtrent halvparten av trans-integrants vil være spektinomycin sensitiv og hvitviser at de har gjennomgått sanne kassett utveksling. Trans-integrants inneholder testeren RFP donor kassett fra pJH110 skulle vise merkes RFP fluorescens sett under grønt lys (525 nm) og gjennom en rød filter (> 610 nm) 15.
. Figur 1 Bøyning blanding illustrasjon: Ved hjelp av uttrykket av overføringen gener fra pRK600, er alle de plasmider overført tilfeldig fra celle til celle. Denne overføringen resulterer i etableringen av trans-integrants i blandingen, gjennom LP-stammen erverv av de to plasmider som kreves for IMCE, den integrase (int) hjelper plasmid pJC2 og donor plasmid pJH110. Giver kassetten fra den ikke-reproduserende donor plasmid (pJH110) utveksles via ΦC31 integrase aktivitet med markører for LP-kassetten på kromosom, noe som resulterer i tap av LP-markører (Spr og uidA) og vedlikehold av donor kassetten (RFP og Gm r) i den resulterende trans-integrant.
Figur 2. A:. Mating sted plate på en ikke-selektiv TY plate som viser tørkede celle blandinger på agaroverflaten B: sammenføyningsflatene flekker stripete på streptomycin-gentamicin-X-Gluc plate, fra øverst til venstre med klokken ingen integrase kontroll, IMCE inn S. meliloti, E. coli DH5α inneholder pJC2 kontroll, E. coli DH5a inneholder pJH110 kontroll, E. coli MT616 kontroll, og S. . meliloti UW227 kontroll C: 10 -2 fortynning av parring flekk resuspensjon på TY streptomycin-X-Gluc agar D:. 10 -2 fortynning av parring flekk resuspensjon på TY streptomycin-gentamicin-X-Gluc agar (blå kolonier er enslige rekombinantar, hvite kolonier har gjennomgått sant. kassett utveksling) E: 10 -2 fortynning av parring flekk resuspensjon på TY streptomycin-X-Gluc agar som viser mangel på fluorescens F:. 10 -2 fortynning av parring flekk resuspensjon på TY streptomycin-gentamicin-X-Gluc agar viser to nivåer av fluorescens (lysere kolonier tilsvarer blå kolonier og har høyere RFP uttrykk antakelig på grunn av arrangøren lese-skjønt fra vektor sekvens, hvor koloniene har gjennomgått sann-kassett utveksling inneholde RFP med bare dens umiddelbare promoter uten skrivebeskyttet gjennom fra lac arrangøren i vektoren, som er fraværende.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den IMCE teknikken gir mulighet for effektiv integrering av en enkelt attB flankert DNA kassetten inn i LP-locus av en tidligere utviklet belastning. Når ønsket konstruktet er klonet i stedet for RFP for å lage donor kassetten, ikke teknikken ikke krever etterfølgende DNA rensing og transformasjon, som gjør det svært robust. Det er viktig at egnede vekst kontroller er inkludert, for å være sikker på at antibiotikaresistens skyldes etableringen av trans-integrants og ikke andre faktorer.
IMCE produserer trans-integrants på ca 0,5% effektivitet. I motsetning oppstår dobbel crossover via homolog rekombinasjon med en frekvens på rundt 10 -6. Recombineering via 16 λ-rød, en annen phage basert system, krever spesifikk homologi, og har variert effektiviteten utenfor E. coli 17. Nok en alternativ, krever Tn7 stedsspesifikke rekombinasjon attTn7 områder 18 4,19. Selv om bruken av ΦC31 integrase krever forutgående prosjektering av en vert, er det ikke begrenset til visse phyla. IMCE har fordelene av effektivitet og modularitet gitt at enhver donor kassett kan potensielt bli integrert i alle LP-stammen. Det er ideell for studier hvor en enkelt klon bibliotek må funksjonelt vist i flere verter grunn genekspresjon krav eller genetisk complementation i ett eksemplar er ønsket.
Størrelsen på konstruksjonen for å bli integrert er begrenset av størrelsen på DNA som kan være vellykket klonet inn i donor vektoren via ligation. Donor vektorer som inneholder Gateway destinasjoner 20 kan brukes, og er spesielt nyttig for store insert fosmid / cosmid biblioteker. De antibiotikaresistens markører i donor vektorene kan også brukes til å velge for than montering av overlappende DNA fragmenter innlegg IMCE ved å krysse to ulike trans-integrants via transduksjon, eller genomisk electroporation 21. Denne utformingen vurdering bør tillate montering av meget store konstruksjoner på LP-locus i LP-stammen. Dette kan være spesielt nyttig for inkorporering av syntetiske genet konstruerer for applikasjoner i metabolsk ingeniørkunst eller syntetisk biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Hvis Margaret CM Smith for vennlig å gi integrase klone
Finansiering støtte fra:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery og strategisk prosjekt tilskudd
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin | BioShop Canada | STP101 | |
| Spectinomycin | BioShop Canada | SPE201 | |
| Gentamicin | BioShop Canada | GTA202 | |
| Choramphenicol | BioShop Canada | CLR201 | |
| Tetracycline | BioShop Canada | TET701 | |
| Kanamycin | BioShop Canada | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SOD001 | |
| Calcium Chloride | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In House | ||
| E. coli pJH110 strain | In House | ||
| SmUW227 strain | In House |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
