Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

في قياسات المختبر من انقباض القصبة الهوائية باستخدام الفئران

Published: June 25, 2012 doi: 10.3791/3703
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, UT Health Science Center, San Antonio

Summary

وكانت الفئران المعدلة وراثيا مفيدة للغاية في وظيفة فسيولوجية يرجع إلى الجينات. كما بحث، هذه بصورة عامة، والدراسات الفنية للمجرى الهواء، على وجه الخصوص، شهدت تحولا ملحوظا نحو نماذج الفئران. هنا نقدم بروتوكولات لل

Protocol

1. معدات

ويبين المكونات الرئيسية للانكماش جهاز قياس تخطيطي في الشكل 2A).

  1. وهناك حمام الأنسجة، وحمام الأنسجة يحافظ على حل الاوكسيجين الفسيولوجية في درجة حرارة دافئة. لحلقات القصبة الهوائية الفئران، ونحن نستخدم منديل 10 مل حمام يحتوي على سترة المياه للتعميم على حل الاحترار، وهو مدخل زجاج fritted إلى فقاعة الأكسجين (95٪ / 5٪ O 2 / CO 2 خليط) ومدخل والموانئ منفذ لتغيير الحلول. يتم تخزين حل جهاز الأمن الوقائي مع خزان محتدما ثابت من 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2 الخليط في درجة حرارة 37 م حمام ماء (لا يظهر). للتبادلات حل، ويتم ضخ حل جهاز الأمن الوقائي من الخزان إلى النسيج مدخل حمام (منفذ القاع) في ما يقرب من 100 دقيقة في الدوري الامريكي للسماح سريع نسبيا تبادل حل. المأخذ الحل هو من خلال منفذ تجاوز السعة (ميناء رأس) الذي يسمح حجم ثابت (~ 10 مل) في الخفافيش الأنسجةح خلال تبادل حل. نستخدم شكل دائري التدفئة Haake على ضخ المياه الدافئة من خلال النسيج سترة حمام (للحفاظ على 37 درجة مئوية). ويمكن الحصول على حمامات الأنسجة من عدد من الموردين ويأتي في مجموعة متنوعة من الأحجام والأنماط لتناسب احتياجات التجريبية للمحقق.
  2. محول قوة. لقياس التوتر متساوي القياس، هي الخيوط أنبوب القصبة الهوائية فوق على شكل حرف L ينتهي من اثنين من قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 2A). ينبغي الحرص على استخدام نوع الفولاذ المقاوم للصدأ والتي تتوافق مع المواد البيولوجية. يتم توصيل قضيب أعلى عبر مقطع لمحول قوة متساوي القياس. العصا أسفل يحمل القصبة الهوائية في وضع ثابت، ويتم تركيبه على ميكرومتر لتسوية التوتر السلبي و / أو طول العضلات. تقلص القصبة الهوائية يخلق التوتر في محول قوة، والتي يتم تحويلها إلى إشارة الجهد في المضخم. ويمكن أيضا القضيب أسفل يتم تكوين لتشمل اثنين من لوحات مستطيلة البلاتين (4 ملم بعيدا) ر قبعة الجناح القصبة الهوائية (الشكل 2B). والسلكية لوحات البلاتين الى مشجعا S88 العشب الذي يسمح بتسليم مجال كهربائي عبر القصبة الهوائية. والمغلفة الأسلاك مفتوحة وجندى مع Sylgard (Sylgard إلاستومر سيليكون 184، داو كورنينج كورب، ميدلاند، MI)، لمنع غسل المعادن في حل حمام.
  3. وتسجل A / محول البرمجيات والكمبيوتر واكتساب د. إشارات من preamplifiers على MacLab 8 A نظام / د. هذا هو الإصدار القديم من الأجهزة ADInstrument Powerlab الحالي. نستخدم الرسم البياني برنامج (ADInstruments) التي تسمح للتسجيل المستمر للتوتر في كافة مراحل التجربة. جيل من توتر العضلات القصبة الهوائية بطيئة جدا، ولذا نجد أن الحصول على 100 نقطة في الثانية الواحدة كافية. يتم معايرة وقياس توتر استخدام الأوزان المعروفة (حتى 5 غرام) قبل كل تجربة. نظم مماثلة متاحة من بائعى الأخرى (على سبيل المثال، BioPac، آلات GW).
عنوان "> 2 العزلة القصبة الهوائية.

  1. قبل عزلة الأنسجة ومعايرة محول قوة مع الأوزان المعروفة، ويتم تعبئة حمام الأنسجة مع PSS طبيعي (انظر الجدول الأول). يتم ضبط فتحة الهواء للحصول على تيار ضوء O 2 / CO 2.
  2. القصبات من شهرين أو أكثر الفئران هي الأمثل. ويمكن استخدام الحيوانات الأصغر سنا لكن القصبات التي تم الحصول عليها من هذه تتطلب مزيدا من المهارة في التصاعد على الأسلاك محول قوة بسبب صغر حجمها. قبل التشريح، وتحت التخدير العميق مع الفئران isoflurane. يتم الوصول إلى مستوى مناسب من التخدير عندما الأصابع قرصة مع ملقط غير قادر للحصول على رد. وضحت فورا الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم ملاحظة هامة: لقد لاحظت أن AVERTIN (ثلاثي بروم إيثانول)، والمسكنات التي تستخدم عادة في الفئران، وآثار ارتخاء العضلات قوي في مجرى الهواء على نحو سلس، وبالتالي لا ينبغي أن تستخدم للدراسات انقباض القصبة الهوائية.
  3. تتم إزالة الجلد (والفراء) من الصدر إلى الحلق. Rيتم قطع الرابطة من قاعدة القص، أفقيا (على الجانبين) إلى الجزء العلوي من القلب. يتم سحبها ثم القص والأضلاع إلى الأمام إلى الحلق للكشف عن القلب / الرئتين والغدة الصعترية، القصبة الهوائية (بطني) والمريء (المرفقة - وظهري إلى القصبة الهوائية).
  4. يتم استئصاله القصبة الهوائية من خلال خفض أقل من التشعب والشعب الهوائية فوق البلعوم. يتم وضع القصبة الهوائية الى حل مثلج الاوكسيجين جهاز الأمن الوقائي (95/5) (التكوين الواردة في الجدول الأول).
  5. يتم تشريح القصبة الهوائية نظيفة من الأنسجة المحيطة بها. أثناء التنظيف، ويمكن عقد القصبة الهوائية في البلعوم أو أدنى من التشعب. ومع ذلك، ينبغي اتخاذ الحذر في عدم تطبيق مباشرة ملقط إلى القصبة الهوائية نفسها. ويمكن استخدام مقص غرامة لقطع الأنسجة المحيطة بها، ولكن ينبغي دائما أن يتم خفض مواز للالقصبة الهوائية لتجنب الضرر. ومما يسهل هذا الجزء من الاجراء في حال علقت إعداد القصبة الهوائية أسفل التشعب وفوق البلعوم على طبق Sylgard المغلفة (Sylgard 184 سيليكونالمطاط الصناعي، شركة داو كورنينج، ميدلاند، MI).
  6. بعد إزالة الأنسجة المحيطة بها، وقطع القصبة الهوائية أسفل البلعوم وفوق والتشعب والشعب الهوائية التي شنت بلطف على الأسلاك محول قوة.
  7. هي الخيوط القصبة الهوائية أكثر من شوكات معدنية على شكل حرف L (الشكل 2A). يتم توصيل واحدة الشق إلى محول قوة الإزاحة لتسجيل المستمر للتوتر متساوي القياس. يتم توصيل آخر الشق إلى ميكرون. ومن ثم أثار حمام النسيج بحيث يتم مغمورة القصبة الهوائية في جهاز الأمن الوقائي. وينبغي أن يتم التركيب من القصبة الهوائية في أسرع وقت ممكن لتقليل الوقت الذي تقام خارج القصبة الهوائية من جهاز الأمن الوقائي. مع الممارسة، يمكن أن يتم التركيب من القصبة الهوائية خلال دقيقة واحدة لكننا عموما تجنب مرات أطول من 3 دقائق لتجنب فقدان قدرتها على البقاء.
  8. يتم ضبط ميكرومتر ببطء للحصول على التوتر السلبي من ~ 10 دقيقة (~ 1 غرام في القوة). تم تحديد التوتر الأمثل يستريح تجريبيا، ونحن قد وجدت أن التوتر السلبي من ~ 5-10 نتائج دقيقة في رد فعل، أي ما يعادل الحد الأقصى لتحفيز البوتاسيوم عالية. وهذا يتفق مع عدد من الدراسات الأخرى التي تستخدم التوتر الكامن في هذا النطاق 16،17،18. خلال الدقائق 5-10 الأولى، القصبة الهوائية التوتر السلبي يميل إلى الانخفاض إلى حد ما (الإجهاد الاسترخاء ظاهرة)، ويتم استخدام ميكرومتر لضبط التوتر السلبي على مينيسوتا 10 ~ خلال موازنة. ولا يسمح للالقصبة الهوائية لتتوازن ما لا يقل عن 1 ساعة قبل التحديات التجريبية.

3. البوتاسيوم تحفيز ارتفاع

موازنة التالي، يتم الطعن في القصبة الهوائية مرتين بمحلول البوتاسيوم PSS عالية (67 ملي بوكل، الجدول الأول). الانكماش يتطلب عموما 5-10 دقائق ~ لتصل إلى حالة استقرار في الوقت الذي يتم شطفها وحمام الأنسجة عدة مرات مع جهاز الأمن الوقائي الطبيعي للاسترخاء تماما القصبة الهوائية. يتم تكرار الانكماش البوتاسيوم للمرة الثانية، ويتم الحصول عليها للمرة الثالثة (عند الضرورة) حتى تقلصات استنساخه.

ويحيط القصبة الهوائية من قبل اثنين من لوحات مستطيلة البلاتين (أقطاب كهربائية) التي تسمح للتحفيز الكهربائي حقل (EFS) في التحضير. استجابة مقلص إلى EFS هي وظيفة من وتيرة والجهد. ويتأثر أيضا من قبل المعلمات المادية مثل منطقة الأقطاب الكهربائية والمسافة بينهما. خصائص قوة محفز يؤثر أيضا على أن هذه الاستجابات عند ارتفاع الفولتية والمخرجات الحالية مشجعا يمكن أن تصل إلى الحد الأقصى. وينبغي أن تحدد خصائص أي نظام EFS من خلال دراسة ردود الانقباض في العضلات في فترات مختلفة من الحوافز، الترددات، والفولتية، وفترات النبض. من أجل الإعداد لدينا التجريبية، وجدنا أن أقطاب مفصولة ملم 4 ~، والسعة التحفيز من 44 V (0.5 مللي البقول)، وهناك 30 هرتز الأمثل لتحقيق استنساخه شبه القصوى ردود مقلص.

5. انكماش عدoked بواسطة تحفيز الكوليني

يتم تقييم مدى استجابة القصبة الهوائية إلى خارج إطار المركبات تطبق إما عن طريق إضافة جرعة واحدة من الدواء أو مصلحة، من قبل إضافات متعددة من المخدرات بطريقة جرعة تراكمية. لالقصبة الهوائية، مختبرنا تستخدم بشكل روتيني كرباكول لتنشيط المستقبلات الكولينية لأنه، خلافا للأستيل كولين، كرباكول ليس تدهورت بفعل أستيل. ومعقول بين الجرعة والاستجابة النطاق من 10 -8 الى 10 كرباكول م -5. المناسب للدخول [كرباكول] منحنى الاستجابة مقلص مع معادلة من نوع هيل يسمح للتقدير من المفوضية الأوروبية 50 (نصف تركيز فعال القصوى) التي هي مقياس لحساسية القصبة الهوائية من الانكماش إلى ناهض الكوليني 19. تجدر الإشارة إلى أن جرعة معينة من كرباكول سيعطي استجابة أكبر قليلا في جرعة واحدة من كجزء من استجابة منحنى جرعة تراكمية.

6. ممثل النتائج ويرد مثال على استجابة مقلص إلى البوتاسيوم عالية في 3A الشكل. انكماش يصل إلى الحد الأقصى في غضون 10 دقائق تقريبا ولكن قد تظهر انخفاض طفيف بعد ذلك. أثناء الغسل في وقت مبكر من البوتاسيوم عالية، قد العضلات تظهر زيادة عابرة في الانكماش الذي يرجع إلى انخفاض في درجة الحرارة، حيث بلغ حجم صغير من حل جهاز الأمن الوقائي غير مدفأة في خطوط حل perfuses عابر إعداد. يمكن التقليل من هذا من خلال وجود الحد الأدنى من حجم القتلى في الأنبوب الذي يربط خزان PSS ساخنة وحمام الأنسجة، وأيضا من خلال تبادل حل بسرعة نسبيا (عموما نحن ضخ الحلول في 100 مل / دقيقة). وسوف يكون كل إعداد بعض الاختلافات في استجابة مقلص بسبب وجود خلافات في كتلة العضلات أو التلف أثناء تشريح. 3B ويبين الشكل 2 القصبات من كتلة العضلات مع مختلف تحدى البوتاسيوم عالية وكرباكول. وعلى الرغم من انكماش الكوليني، أثار تختلف، إلا أنذ مماثلة بعد تطبيع للاستجابة مع حل البوتاسيوم عالية (الشكل 3C).

ويبين الشكل 4 مثالا للانكماش (الكوليني) كرباكول أثار استخدام جرعة واحدة (A)، والزيادة التراكمية (B). تضاف الحلول كرباكول مباشرة إلى الحمام والغاز انفجر يساعد في خلط سريع. تجدر الإشارة إلى أن إضافة جرعة واحدة (أي 1 ميكرومتر، الشكل 4A) لديها استجابة أكبر قليلا من تركيز يعادل خلال منحنى الاستجابة للجرعة تراكمية (1 ميكرومتر، الشكل 4B). 4C ويبين الشكل قطعة من قوة انقباض بوصفها وظيفة من تركيزات كرباكول باستخدام بيانات من الشكل 4B. آثار كرباكول تشبع في 10 تركيز M -5. على الرغم من ناهضات الكوليني يبدأ الانكماش من خلال آليات إطلاق الكالسيوم، وتوسط أيضا عنصر كبير من الانكماش من الاستقطاب وتفعيل قنوات الكالسيوم التي تعتمد على الجهد 20.

5A يبين الشكل مثالا للتقلصات، EFS أثار. يتم تحفيز القصبات باستخدام 0،5 ميلي ثانية واحدة مدتها، 40 فولت وحتى البقول تقلصات التوصل الى هضبة (انظر أقحم A1). زيادة في وتيرة التحفيز يؤدي إلى زيادة استجابة مقلص (يتم رسم منحنى استجابة التردد في الشكل 5B). وقد تبين التحفيز الكهربائي مجال لإثارة تقلصات في الغالب عن طريق تنشيط الاعصاب قبل المشبكي. ويتجلى ذلك من خلال تأثير سم البوتولينيوم، وهو مانع من الافراج عن العصبي الذي يمنع الأغلبية من تقلصات EFS-استحضر من القصبة الهوائية 21. وعلاوة على ذلك، سم الأسماك الرباعية الأسنان، وكيلا يمنع نا + قنوات يمنع أيضا نشاط الأعصاب ويزيل استجابة من القصبة الهوائية لEFS.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط رانه يشير الى مسارات رئيسية في إعداد القصبة الهوائية المعزولة. أظهرت هو محطة محور عصبي الكوليني التعصيب 1 القصبة الهوائية الخلية العضلات الملساء. مسارات الإشارات الرئيسية هي M3 ومستقبلات أستيل M2-المسكارينية التنشيط (mACHR) أن يؤدي إلى إطلاق الكالسيوم من خلال مستقبلات IP3 (M3) والحد من مخيم (M2). مستقبلات M2 (وبعض مساهمة مستقبلات M3) أيضا أن يسبب الاستقطاب الكوليني، أثار التي ينشط نوع L-قنوات الجهد التي تعتمد على تدفق الكالسيوم والكالسيوم. وكلاء مقلص المشتركة والمستجيبات هم 1. ارتفاع البوتاسيوم (يزيل الاستقطاب الخلية العضلات الملساء ومحور عصبي الكوليني)، 2. التحفيز الكهربائي حقل (EFS، depolarizes الكوليني محور عصبي) و 3. تطبيق خارجية من وكلاء الكوليني مثل أستيل أو كرباكول (ينشط المستقبلات المسكارينية مباشرة).

الشكل 2
الشكل 2. مخطط من المعدات المستخدمة لقياس تقلصات القصبة الهوائية. هي التي شنت ألف محول قوة و، ميكرومتر وحمام الأنسجة على دعم قضبان عبر المشابك المسمار. هي الخيوط الحلبة القصبة الهوائية خلال قضبان أعلى وأسفل. في المخطط، يتم وضع حمام الأنسجة تحت الإعداد (أي خلال تصاعد من القصبة الهوائية على محول للقوة). خلال دراسات الانكماش، يتم نقل الأنسجة عموديا حمام ليستحم إعداد. يتم تعديل باء لتنشيط الحقل الكهربائي للقضيب أسفل لتشمل لوحات والبلاتين اللذين هي التي شنت أفقيا على السلك عقد القصبة الهوائية. وترتبط لوحات البلاتين بواسطة الأسلاك الكهربائية لتحفيز.

الشكل (3)
الشكل 3. أمثلة من البوتاسيوم عالية (67 ملم) استجابة مقلص من القصبة الهوائية. (أ) تبين مكررة، والاستجابات استنساخه إلى البوتاسيوم عالية. (ب) أمثلة من استجابة مقلص إلى كرباكول اثنين من القصبات المختلفة. (ج) الردود على القصبات في B مماثلة عندما تطبيعد إلى استجابة إلى البوتاسيوم عالية.

الشكل 4
الشكل 4. أمثلة من كرباكول الناجم عن تقلصات. (A)، يليه كرباكول الناجم عن تقلصات باستخدام جرعة واحدة من فشل. يتم رسم (B) مثال التراكمي بين الجرعة والاستجابة لمنحنى في القصبة الهوائية A. (C) من تقلصات الذروة ب بوصفها وظيفة من تركيز كرباكول.

الشكل 5
الشكل 5. أمثلة من الانقباضات التي حركها تنشيط الحقل الكهربائي. (أ) تنشيط حقل كهربائي من انقباض القصبة الهوائية باستخدام 0.5 مللي نبض، فولت 40، وتنشيط مختلف الترددات كما هو مبين. أقحم وقتا موسعة انكماش في 30 هرتز. (ب) انكماش الذروة من (أ) هي plotteد بوصفها وظيفة من وتيرة التحفيز.

طبيعي PSS

ملح اضرب. (مم) مبلغ (ز / 2 ليتر)
كلوريد الصوديوم 119 13.91
بوكل 4.7 0.7
KH 2 PO 4 1.18 0.32
MgSO 4 × 7H 2 O 1.17 0.58
NaHCO 3 18 3.02
EDTA 0،026 0.1 مل من 0.5 متر
جلوكوز 11 3.96
سكر القصب 12.5 8.56
CaCl 2 2 400 مل 10 ملم

ارتفاع K + جهاز الأمن الوقائي (NACل والتسويات بوكل)

ملح اضرب. (مم) مبلغ (ز / 2 ليتر)
كلوريد الصوديوم 56.7 6،628
بوكل 67 9،991

. الجدول 1 وصفة لحلول PSS ملاحظة: ويتم اتخاذ حلول جديدة أسبوعيا، مع نوعية المياه فائقة النقاء، ويتم تخزينها في الثلاجة لمدة لا تزيد عن 5 أيام لتجنب تلويث النمو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول المقدمة هنا يوفر إعداد فسيولوجية لتقييم مجرى الهواء وظيفة العضلات. نعمل عموما 3-4 محضرات الاستحمام الجهاز في وقت واحد، ومع ذلك، نظم الجاهزة المتوفرة من عدد من الموردين والتي تسمح للقياسات في وقت واحد يصل الى 8 التحضيرات (ADInstruments، أدوات دقيقة العالم، وجهاز هارفارد). وقد استخدمت لدينا عدد من محولات الطاقة قوة والحمامات الجهاز الأنسجة مع نتائج مماثلة. ومع ذلك، نجد أن التحفيز الكهربائي مجال توفر بعض التباين على أساس اختلافات طفيفة بين أقطاب تحفيز الحجم، والمسافة بين لوحات الكهربائي، والموقف من إعداد ضمن الحقل الكهربائي. وبالتالي، ينبغي اتخاذ المزيد من الحيطة لجعل أقطاب المجال حيث مماثلة قدر الإمكان.

واحدة من المعلمات الأكثر أهمية في قياس قوة متساوي القياس هو مسألة تطبيع تقلصات للتعويض عن الاختلافات في كتلة العضلات، أوالصحة من الأنسجة العضلية بين الاستعدادات المختلفة. في جزء، لا يمكن التقليل من الفوارق بمقارنة الحيوانات من نفس العمر ونفس الجنس (إناث الفئران تميل إلى توليد خفض التوتر القصبة الهوائية). علاوة على ذلك، وجدنا أن التطبيع إلى القصبة الهوائية الوزن الرطب أو الجاف يفتقر إلى الدقة الكافية، وربما يعود ذلك إلى صغر حجم القصبة الهوائية الماوس. بدلا من ذلك، استخدام، وارتفاع عدة تقلصات، والبوتاسيوم هو مفيد للغاية. تقلصات البوتاسيوم عالية تخدم غرضين. تقلص البوتاسيوم عالية ويبدو أن "توقظ" في عضلة القصبة الهوائية ويضمن أن تكون الانقباضات استنساخه قبل الشروع في التحديات التجريبية. تقلص ارتفاع البوتاسيوم ويبدو أيضا أن تكون دقيقة لتطبيع كتلة العضلات النشطة التي هي موجودة في إعداد. وبالتالي، كثيرا ما يتم التعبير عن القياسات التجريبية التوتر كقوة طبيعية للانكماش البوتاسيوم عالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم جودة لإعداد باستخدام ارتفاع البوتاسيوم الناجم عن العقدايون. على سبيل المثال، نجد أن 8-10 أسبوع من العمر من الذكور C57BL/6J الفئران لديها ارتفاع البوتاسيوم الناجم عن تقلص من 20 ± 3.8 مليون (يعني ± الانحراف المعياري، ن 17 =). إذا كان إعداد العقود القصبة الهوائية أقل بكثير من هذا النطاق (أقل من 12 دقيقة أو يعني اثنين الانحرافات القياسية أدناه)، ثم ينظر إليه عادة على أنها "تالفة" وليس استخدامها لالتجريب. بدلا من ذلك، قد يتم استخدام التطبيع من التوتر إلى أقصى التوتر في ناهض تشبع الكوليني. وهذا مفيد لمراقبة التغيرات التي تحدث في حساسية إلى ناهض، ولكن قد يغيب عن التغييرات التي تؤثر على انقباض أقصى.

وقدمت وسائل لتنشيط تقلص إما باستخدام ناهض الكوليني أو مع التحفيز الكهربائي. الكوليني تطبيق ناهض إلى الحمام مباشرة الأنسجة ينشط العضلات الملساء. في المقابل، مع تنشيط وتيرة معتدلة EFS (تصل إلى 25 هرتز) وتوسطت في الغالبية العظمى من الانكماش من خلال تنشيط الاعصاب والافراج عن neurotransmitter 22. وبالتالي المحقق لديه الفرصة للتحقيق في العوامل التي تؤثر قبل المشبكي / العصب بوساطة انقباض باستخدام EFS التحفيز. أخيرا، تشير الدراسات إلى أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا البدينة 23 عاما، والخلايا الظهارية 24 تؤثر أيضا على انقباض في إعداد القصبة الهوائية المعزولة. وهكذا، فإن في إعداد المختبر القصبة الهوائية الماوس يوفر تجربة قوية وظيفي لعدد من أنواع الخلايا التي تؤثر على انقباض العضلات الملساء الشعب الهوائية.

وباختصار، كان الفأر في إعداد المختبر القصبة الهوائية مفيدة بشكل خاص في تحليل التغيرات الجينية التي تؤثر على وظيفة مجرى الهواء. بعض الأمثلة على ذلك تحليل بالضربة القاضية جين من القنوات الأيونية 17،20،25،26، المستقبلات metabotropic 27،28،29،30، ويشير الى المصب الشلالات 31. وبالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما يستخدم الماوس مستضد تحدى للدراسات الربو 32 وفي المختبرالقصبة الهوائية إعداد يوفر تجربة مفيدة للتغيرات في انقباض تستتبعه هذه التنمية التالية من الربو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مركز للإبداع في منع وعلاج أمراض مجرى الهواء، NINDS منحة (NS052574)، و من برنامج ساندلر للأبحاث الربو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analogue-Digital Converter ADInstruments PowerLab 4/35
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) Sigma-Aldrich C4832 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C)
Charting Software ADInstrtuments LabChart
Heating Circulator Haake Mixer Mill MM400
Isometric Force Transducer Kent Scientific TRN001
Stimulator Grass Technologies S88 Dual Output Square Pulse Stimulator
Tissue Bath WPI 47264

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
  2. Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
  3. Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
  4. Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
  5. Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
  6. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  7. Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
  8. Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
  9. Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
  10. Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
  11. Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
  12. Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
  13. Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
  14. Garssen, J., Loveren, H. V. an, Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
  15. Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
  16. Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
  17. Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
  18. Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
  19. Kenakin, T. P. A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , 3rd edn, Academic Press/Elsevier. (2009).
  20. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
  21. Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
  22. Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
  23. Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
  24. Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
  25. Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
  26. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
  27. Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
  28. Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
  29. Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
  30. Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
  31. Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
  32. Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).

Tags

الطب، العدد 64، علم وظائف الأعضاء، القصبة الهوائية، القوة تنبيغ والخطوط العضلات الملساء، انقباض، مستقبلات الفعل الكوليني
<em>في</em> قياسات <em>المختبر</em> من انقباض القصبة الهوائية باستخدام الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Semenov, I., Herlihy, J. T.,… More

Semenov, I., Herlihy, J. T., Brenner, R. In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice. J. Vis. Exp. (64), e3703, doi:10.3791/3703 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter