Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

במדידות חוץ גופית של היצרות קנה הנשימה באמצעות עכברים

Published: June 25, 2012 doi: 10.3791/3703
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, UT Health Science Center, San Antonio

Summary

העכברים הטרנסגניים להיות שימושי מאוד ייחוס תפקיד פיזיולוגי ל הגנים. כמו מחקר, כגון בכלל, מחקרים תפקודיות של דרכי הנשימה, במיוחד, עברו שינוי מדהים לכיוון מודלים Murine. כאן אנו מספקים פרוטוקולים

Abstract

מהונדס לבין עכברים בנוקאאוט היו כלים רבי עוצמה לחקר הפיזיולוגיה ו פתופיזיולוגיה של דרכי הנשימה 1,2. ב tensometry חוץ גופית ההכנות לקנה הנשימה מבודדים הוכיחה להיות שימושי assay של השריר החלק בדרכי הנשימה (ASM) בתגובה כויץ בעכברים מהונדסים גנטית. אלה בהכנות חוץ גופית לקנה הנשימה הם פשוטים יחסית, לתת מענה חזקים, ולשמור את שני קצות העצבים הכולינרגית תפקודית ותגובות שרירים, גם לאחר incubations ארוכים.

Tensometry קנה הנשימה מספקת גם assay תפקודית ללמוד מגוון רחב של השני איתות המסלולים שליח המשפיעות על התכווצות של שריר חלק. התכווצות של קנה הנשימה מתווכת בעיקר על ידי, העצבים הפאראסימפתטית כולינרגית המשחררים אצטילכולין על ASM (איור 1). קולטני אצטילכולין ASM הגדולים הם M2 ו M3 muscarinic שהם G I / O ו GQ קולטנים מצמידים, בהתאמה 3,6,7. M2 / G I / O איתות הוא האמין כדי לשפר את הצירים על ידי עיכוב של cyclase adenylate מובילה לירידה ברמות הסכמי קמפ 5,8,9,10. מסלולים אלה מהווים את מה שנקרא "pharmaco-התכווצות צימוד" של השריר החלק בדרכי הנשימה 11. בנוסף, איתות כולינרגית באמצעות קולטנים מסוג M2 (ו מווסתת על ידי איתות M3) כוללת מסלולים depolarize ASM אשר בתורו להפעיל מסוג L, מתח תלויי תעלות סידן (איור 1) ואת זרימת סידן (מה שנקרא "עירור-התכווצות צימוד" ) 4,7. סקירות מפורטות יותר על איתות המסלולים השליטה היצרות דרכי הנשימה ניתן למצוא 4,12. המסלולים הנ"ל נראה כי שימור בין עכברים ומינים אחרים. עם זאת, וקנה הנשימה עכבר שונים מינים אחרים אניn חלק איתות המסלולים. הבולט ביותר הוא חוסר התגובה כויץ ל 13,14 ו היסטמין אדנוזין, שניהם ידועים מאפננים ASM בבני אדם ומינים אחרים 5,15.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים הבידוד של טבעות לקנה הנשימה של Murine ואת במדידה חוץ גופית התפוקה כויץ שלהם. כללו תיאורים של תצורת ציוד, בידוד קנה הנשימה טבעת ומדידות ההתכווצות. דוגמאות ניתנות לעורר התכווצויות בעקיפין באמצעות גירוי אשלגן גבוהה של עצבים ישירות על ידי שלילת קוטביות של שריר ASM להפעיל מתח תלוי זרם סידן (1. גבוהה K +, איור 1). בנוסף, שיטות מוצגים גירויים של העצבים לבד באמצעות גירוי שדה חשמלי (2. EFS, איור 1), או גירוי ישיר של השריר ASM באמצעות מוליך עצבי אקסוגני להחיל אמבטיה (3. אקסוגני אח, איור 1). זה flexibility וקלות ההכנה הופך את המודל טבעת מבודדת קנה הנשימה assay חזק ומתפקד במשך מספר איתות מפלי המעורבים התכווצות שרירים דרכי הנשימה חלקה.

Protocol

1. ציוד

הרכיבים העיקריים של מכשיר המדידה התכווצות מוצגים באופן סכמטי באיור 2 א).

  1. אמבטיה רקמות. אמבטיה הרקמה שומרת על פתרון פיזיולוגי מחומצן בטמפרטורה חמימה. עבור טבעות עכברים קנה הנשימה, אנו משתמשים ברקמת 10 מ"ל אמבט המכיל מים מעיל במחזור פתרון להתחממות, כניסת הזכוכית fritted לחמצן בועה (95% / 5% O 2/2 CO תערובת) לבין כניסת ויציאות מוצא שינוי פתרונות. פתרון PSS המאגר מאוחסן עם מבעבעת מתמיד של% 95/5% O 2/2 CO תערובת של 37 ° C אמבט מים (לא מוצג). לחילופי פתרון, פתרון PSS נשאבים מן המאגר אל כניסת רקמות אמבטיה (יציאת למטה) ברגע כ 100 עבור ה-MLS כדי לאפשר חילופי פתרון מהיר יחסית. מוצא הפתרון הוא דרך נמל גלישה (יציאת העליון) המאפשר נפח קבוע (~ 10 מ"ל) בבת רקמותח במהלך פתרון חילופי. אנו משתמשים circulator חימום Haake להזרים מים חמים מבעד למעיל אמבטיה רקמות (כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס). אמבטיות רקמות ניתן לקבל מספר הספקים מגיעים במגוון גדלים וסגנונות לענות על הצרכים של הניסוי החוקר.
  2. מתמר כוח. כדי למדוד מתח איזומטרי, צינור לקנה הנשימה הוא מושחל על L בצורת הקצוות של שני מוטות נירוסטה (איור 2 א). יש להקפיד להשתמש בסוג נירוסטה התואם את חומר ביולוגי. המוט העליון מחובר באמצעות קליפ כדי מתמר כוח איזומטרי. המוט התחתון מחזיק את קנה הנשימה במיקום קבוע, והוא רכוב על מיקרומטר על התאמת המתח הפסיבי ו / או אורך השריר. ההתכווצות של קנה הנשימה יוצר מתח על מתמר כוח, אשר מומר האות המתח מגבר קדם. המוט התחתון יכול גם להיות מוגדר כוללים שני לוחות פלטינה מלבני (4 מ"מ בנפרד) T האגף הכובע קנה הנשימה (איור 2 ב). הצלחות פלטינה מחווטים כדי ממריץ גראס S88 שמאפשר משלוח של שדה חשמלי על פני קנה הנשימה. חוטים פתוחים הלחמה מכוסים Sylgard (Sylgard 184 אלסטומר סיליקון, Dow Corning Corp, Midland, MI), כדי למנוע שטיפת מתכות אל הפתרון אמבטיה.
  3. / D, הממיר למחשב ורכישת תוכנה. אותות preamplifiers נרשמות על MacLab 8 מערכת / D. זוהי גרסה ישנה יותר של החומרה הנוכחית ADInstrument Powerlab. אנו משתמשים תרשים התוכנית (ADInstruments) המאפשר הקלטה רציפה של מתח לאורך כל הניסוי. הדור מתח שריר קנה הנשימה הוא איטי למדי, ועל כן אנו מוצאים כי הרכישה של 100 נק '2 היא נאותה. מדידת המתח הוא מכויל באמצעות משקולות ידועות (עד 5 גרם) לפני כל ניסוי. מערכות דומות זמינים venders אחרים (למשל, BioPac, מכשירים GW).
הכותרת "> 2. קנה הנשימה בידוד

  1. לפני בידוד רקמות מתמר כוח מכויל עם משקולות ידועות, ואת רקמות אמבטיה מלא PSS רגילים (ראה טבלה I). כניסת אוויר מותאם לקבל זרם לאור O 2 / CO 2.
  2. וקנה הנשימה מהחודש 2 או עכברים מבוגרים הם אופטימליים. בעלי חיים צעירים יותר ניתן להשתמש אך וקנה הנשימה המתקבלים אלה דורשות מיומנות גבוהה יותר כדי לעלות על חוטים מתמר כוח בגלל גודלם הקטן. לפני לנתיחה, עכברים הם מורדמת עם isoflurane. רמה תקינה של הרגעה הוא הגיע כאשר הבוהן קמצוץ עם מלקחיים אינו מסוגל לעורר תגובה. עכברים הם הקריבו מיד פריקה צוואר הרחם הערה חשובה:. ראינו כי Avertin (Tribromoethanol), סם הרגעה נפוץ עכברים, יש השפעות חזקות על להרפיית השריר החלק בדרכי הנשימה ולכן אין להשתמש בו ללימודים קנה הנשימה התכווצות.
  3. העור (פרווה) היא להסיר את החזה אל הגרון. Rתסמונת המעי הרגיז נחתכים מבסיס עצם החזה, רוחבית (משני הצדדים) לחלק העליון של הלב. עצם החזה והצלעות נמשכים אז קדימה אל הגרון כדי לחשוף את הלב / ריאות, בלוטת התימוס, קנה הנשימה (הגחון) והוושט (מצורף - ואת הגב אל קנה הנשימה).
  4. קנה הנשימה הוא נכרת על ידי חיתוך מתחת הסתעפות הסימפונות ומעלה הלוע. קנה הנשימה מכניסים פתרון קר כקרח מחומצן PSS (95/5) (הרכב נתון טבלה I).
  5. קנה הנשימה הוא גזור נקי של הרקמות הסובבות. במהלך ניקוי, קנה הנשימה ניתן לערוך הלוע או מתחת הסתעפות. עם זאת, יש לנקוט זהירות שלא להחיל את מלקחיים ישירות לקנה הנשימה עצמה. מספריים עדינים ניתן להשתמש כדי לנתק את הרקמות הסובבות, אבל לחתוך תמיד צריך להתבצע במקביל קנה הנשימה כדי למנוע נזק. בחלק זה של ההליך הוא הקל אם הוא הצמיד את הקנה לקראת הסתעפות מתחת ומעל הלוע אל צלחת Sylgard מצופה (184 Sylgard סיליקוןאלסטומר, Dow Corning Corp, Midland, MI).
  6. לאחר הסרת הרקמה שמסביב, קנה הנשימה נחתך מתחת הלוע ומעלה הסתעפות הסימפונות וטיפס בעדינות על חוטים מתמר כוח.
  7. קנה הנשימה הוא מושחל על שני L בצורת שיני מתכת (איור 2 א). אחת שיניים מחובר מתמר כוח תזוזה של הקלטה רציפה של מתיחות איזומטרי. שיניים אחר מחובר מיקרומטר. אמבטיה רקמות עולה אז כך קנה הנשימה הוא שקוע בתוך PSS. הרכבה של קנה הנשימה יש לעשות זאת מהר ככל האפשר כדי לצמצם את הזמן הזה קנה הנשימה מתקיימים מחוץ PSS. בעזרת תרגול, הרכבה של קנה הנשימה יכול להיעשות תוך דקה אחת אבל אנחנו בדרך כלל להימנע פעמים יותר מ 3 דקות כדי למנוע אובדן של כדאיות.
  8. מיקרומטר מותאם לאט להשיג מתח פסיבי של ~ 10 mn (~ 1 גרם כוח). מתח המנוחה האופטימלי נקבע באופן אמפירי מצאנו כי מתח פסיבי של ~ 5-10 mn תוצאות בתגובה, שווה ערך מקסימלי לגירוי אשלגן גבוהה. זה עולה בקנה אחד עם מספר מחקרים אחרים לנצל את המתח הפסיבי בטווח זה 16,17,18. במשך 5-10 דקות הראשונות, מתח קנה הנשימה פסיבית נוטה לרדת מעט (מתח והרפיה התופעה) ואת מיקרומטר משמש כדי להתאים את המתח פסיבית ~ 10 mn במהלך איזון. קנה הנשימה מותר לאזן לפחות שעה 1 לפני אתגרים ניסיוניים.

3. גירוי אשלגן גבוהה

איזון הבאה, קנה הנשימה הוא קרא תיגר פעמיים עם פתרון PSS אשלגן גבוהה (67 mM KCl, לוח ט). התכווצות בדרך כלל דורש 5-10 דקות ~ כדי להגיע היציב שבו זמן אמבטיה רקמות שטף מספר פעמים עם PSS נורמליים לחלוטין להירגע קנה הנשימה. התכווצות אשלגן חוזר על עצמו בפעם השנייה, בפעם השלישית (במידת הצורך) עד התכווצויות לשחזור מתקבלים.

קנה הנשימה מוקפת שתי צלחות פלטינה מלבני (אלקטרודות) המאפשרים גירוי שדה חשמלי (EPS) על ההכנה. בתגובה כויץ כדי EFS היא פונקציה של תדר ומתח. זה מושפע גם פרמטרים גופניים כגון בתחום האלקטרודות ואת המרחק ביניהם. המאפיינים של כוח ממריץ להשפיע גם על תגובות כאלה במתח גבוה ו פלטי הנוכחי ממריץ יכול להגיע למקסימום. המאפיינים של כל מערכת EFS ​​צריך להיקבע על ידי בחינת התגובות שרירים ההתכווצות על משכי זמן שונים גירוי, תדרים, מתח ו משכי זמן הדופק. להתקנה ניסיונית שלנו, מצאנו כי אלקטרודות מופרדות 4 מ"מ ~ ו משרעת גירוי של 44 V (0.5 MS פולסים) ו -30 הרץ הם אופטימליים כדי להשיג לשחזור כמעט מקסימלי תגובות ההתכווצות.

5. התכווצות אווoked ידי גירוי כולינרגית

התגובה של קנה הנשימה כדי תרכובות להחיל exogenously מוערך גם על ידי תוספת של מנה אחת של תרופה או עניין, על ידי תוספות שונות של התרופה באופן מינון מצטבר. על קנה הנשימה, המעבדה שלנו בשימוש שגרתי carbachol להפעלת קולטנים כולינרגית משום שבניגוד אצטילכולין, carbachol לא מושפל על ידי acetylcholinesterase. טווח סביר מנה תגובה הוא מ -8 עד 10 10 -5 M carbachol. והתאמת התחבר [carbachol]-כויץ עקומת התגובה עם המשוואה היל מסוג מאפשרת הערכת EC 50 (חצי מקסימלי בריכוז אפקטיבי) כי הוא מדד הרגישות של כיווץ קנה הנשימה כדי אגוניסט כולינרגית 19. ראוי לציין כי מינון מסוים של carbachol ייתן מענה קצת יותר כמו מנה אחת יותר כחלק עקומת מינון מצטבר התגובה.

6. נציג תוצאות למשל התגובה כויץ כדי אשלגן גבוהה מוצג איור 3 א. הצמצום הוא מגיע לשיא תוך כ 10 דקות אך עשוי להראות על ירידה קטנה לאחר מכן. במהלך סחף מוקדם של אשלגן גבוהה, השריר עשוי להראות עלייה זמנית בצמצום כי בשל ירידה בטמפרטורה כמו נפח קטן של פתרון PSS מוסק בשורות פתרון זמני perfuses הכנה. זו ניתן למזער על ידי בעל נפח מת המינימום צינור המחבר את המאגר PSS מחוממת אמבטיה רקמות, וגם על ידי החלפת פתרון במהירות יחסית (בדרך כלל אנו לשאוב פתרונות ב 100 מ"ל / דקה). ההכנה תהיה לכל מספר הבדלים בתגובה כויץ בשל הבדלי מסת שריר או נזק שנגרם במהלך הניתוח. איור 3 ב מציג שני וקנה הנשימה של מסת שריר שונה תיגר עם אשלגן carbachol גבוהה. למרות התכווצויות כולינרגית-עוררו שונה,Y דומים לאחר נורמליזציה לתגובה פתרון אשלגן גבוהה (איור 3 ג).

איור 4 מראה דוגמה של התכווצות carbachol (כולינרגית) עורר שימוש במנות יחיד () ועלייה מצטברת (ב '). הפתרונות carbachol מתווספים ישירות האמבט, גז מבעבע מסייע ערבוב מהיר. ראוי לציין כי תוספת של מנה אחת (כלומר 1 מיקרומטר, תרשים 4 א) יש תשובה קצת יותר גדולה ריכוז שווה ערך במהלך עקומת מנה תגובה מצטבר (1 מיקרומטר, איור 4B). 4C איור מראה העלילה בכוח התכווצות כפונקציה של ריכוז carbachol באמצעות נתונים איור 4B. ההשפעות של carbachol להרוות בריכוז -5 10 מ '. למרות אגוניסטים כולינרגית יוזם התכווצות באמצעות מנגנוני שחרור סידן, מרכיב משמעותי של התכווצות מתווך גם על ידי שלילת קוטביות והפעלת מתח תלויי ערוצי סידן 20.

איור 5 א מציג דוגמה EFS למוצרי עוררו הצירים. וקנה הנשימה מגרים באמצעות 0.5 אלפית שנייה למשך 40 פעימות וולט ועד הצירים להגיע לרמה (ראה א 1 הבלעה). עלייה בתדירות הגירוי גורם לתגובה כויץ מוגברת (תדר תגובה עקומת הוא להתוות 5 ב איור). גירוי שדה חשמלי הוכח לעורר התכווצויות בעיקר על ידי הפעלת עצבים presynaptic. עדות לכך היא ההשפעה של בוטולינום טוקסין, חוסם את שחרור הנוירוטרנסמיטר שחוסמת את רוב הצירים EFS-עוררו קנה הנשימה 21. יתר על כן, tetrodotoxin, סוכן שחוסמת Na + ערוצי גם מעכב פעילות העצב ומונע את התגובה של קנה הנשימה כדי EFS.

איור 1
באיור 1. תרשים של Tהוא גדול מסלולי איתות לקראת קנה הנשימה מבודד. שתופיע היא מסוף האקסון כולינרגית innervating קנה הנשימה בתא השריר החלק. המסלולים העיקריים הם איתות M3 ו-M2-muscarinic קולטן האצטילכולין ההפעלה (mACHR) שגורמים לשחרור סידן דרך קולטנים IP3 (M3) והפחתה של המחנה (M2). קולטנים מסוג M2 (וחלקם תרומה של רצפטורים M3) לגרום גם שלילת קוטביות כולינרגית, עורר המפעיל L מסוג ערוצי מתח תלוי זרם סידן סידן. סוכני ההתכווצות נפוצות effectors שלהם 1. אשלגן גבוהה (depolarize תא שריר חלק האקסון כולינרגית), 2. בתחום גירוי חשמלי (EPS, depolarizes כולינרגית האקסון) ו 3. יישום אקסוגני של סוכנים כולינרגית כגון אצטילכולין או carbachol (מפעיל קולטנים muscarinic ישירות).

איור 2
איור 2. תרשים של ציוד למדידת הצירים לקנה הנשימה. א מתמר כוח, מיקרומטר ואמבטיה הרקמה הם רכובים על מוטות תמיכה באמצעות מהדק בורג. טבעת קנה הנשימה הוא מושחל על המוטות העליונים והתחתונים. בתרשים, אמבטיה רקמות ממוקם מתחת הכנה (כלומר, במהלך הרכבה של קנה הנשימה על מתמר כוח). במהלך לימודי התכווצות, אמבטיה רקמות מועבר אנכית לרחוץ הכנה. ב לגירוי שדה חשמלי מוט התחתונה היא שונה כדי לכלול שני לוחות פלטינה כי הם רכובים רוחבית לחוט החזקת קנה הנשימה. הצלחות פלטינה מחוברים באמצעות חוטי חשמל כדי ממריץ.

איור 3
איור 3. דוגמאות של אשלגן גבוהה (67 mM) תגובה כויץ של קנה הנשימה. (א) מראה כפולות, תגובות לשחזור ל אשלגן גבוהה. (ב) דוגמאות בתגובה כויץ כדי carbachol שני וקנה הנשימה שונים. (ג) תגובות ל את וקנה הנשימה ב B דומים כאשר לנרמלד לתגובה אשלגן גבוהה.

איור 4
איור 4. דוגמאות carbachol המושרה הצירים. (א) Carbachol המושרה הצירים באמצעות מנות בודדות לאחר מכן סחף. (ב) המצטבר דוגמה מנה תגובה עיקול על קנה הנשימה של א '(ג) התכווצויות שיא B נרשמות כפונקציה של ריכוז carbachol.

איור 5
איור 5. דוגמאות התכווצויות שעוררו גירוי שדה חשמלי. (א) גירוי השדה החשמלי של כיווץ קנה הנשימה באמצעות 0.5 MS הדופק, 40 וולט, ותדירות גירוי שונים כמצוין. השיבוץ הוא זמן מורחבת התכווצות של 30 הרץ. (ב) התכווצויות שיא הן plotteD כפונקציה של תדר הגירוי.

רגיל PSS

מלח קונצרט כלשהו. (מ"מ) סכום (ז / 2 ל ')
NaCl 119 13.91
KCl 4.7 0.7
KH 2 PO 4 1.18 0.32
MgSO 4 x 7H 2 O 1.17 0.58
NaHCO 3 18 3.02
EDTA 0.026 0.1 מ"ל של 0.5 M
גלוקוז 11 3.96
סוכרוז 12.5 8.56
CaCl 2 2 400 מ"ל של 10 מ"מ

גבוה K + PSS (NACאני והתאמות KCl)

מלח קונצרט כלשהו. (מ"מ) סכום (ז / 2 ל ')
NaCl 56.7 6.628
KCl 67 9.991

. טבלה 1 מתכון פתרונות PSS. הערה: פתרונות מורכבים טריים מדי שבוע, עם מים באיכות ultrapure, והם מאוחסנים במקרר לא יותר מ 5 ימים כדי למנוע זיהום הצמיחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מספק הכנה פיזיולוגית להערכת תפקוד דרכי הנשימה השריר. אנו פועלים בדרך כלל 3-4 אמבטיה ההכנות איברים בו זמנית, לעומת זאת, מערכות ארוזים מראש זמינים ממספר ספקים המאפשרים מדידה בו זמנית של עד 8 ההכנות (ADInstruments, דיוק מכשירים בעולם, ומכשירים הרווארד). ניצלנו מספר מתמרים בכוח איברים ורקמות אמבטיות עם תוצאות מקבילים. עם זאת, אנו מוצאים כי גירוי השדה החשמלי מספק כמה שונות בהתבסס על הבדלים קלים בין אלקטרודות גירוי גודל, מרחק בין לוחות אלקטרודה, ואת המיקום של ההכנה בתוך שדה חשמלי. לכן, טיפול נוסף צריך להתבצע כדי להפוך אלקטרודות שדה דומים ככל האפשר.

אחד הפרמטרים החשובים ביותר במדידות כוח שווי מידה הוא הנושא של נרמול הצירים כדי לפצות על שינויים מסת שריר, אוהבריאות של רקמת השריר בין הכנות שונות. בין השאר, ההבדלים ניתן למזער על ידי השוואת בעלי החיים בגיל דומה מאותו המין (נקבות עכברים נוטים ליצור מתח מופחת קנה הנשימה). יתר על כן, מצאנו כי נורמליזציה למשקל קנה הנשימה רטוב או יבש חסר דיוק מספיק, אולי בשל גודלו הקטן של העכבר קנה הנשימה. במקום זאת, השימוש מרובות, התכווצויות, אשלגן גבוהה יש יתרון די. התכווצויות אשלגן גבוהה לשרת שתי מטרות. התכווצות אשלגן גבוהה נראה "לעורר" את השריר קנה הנשימה ומבטיח כי ההתכווצויות הן לשחזור לפני שתמשיך עם אתגרים ניסיוניים. התכווצות אשלגן גבוהה גם נראה נורמליזציה מדויק על מסת השריר הפעיל שנמצא בהכנה. לכן, מדידות מתח הניסוי באים לידי ביטוי לעתים קרובות ככוח מנורמל לצמצום אשלגן גבוהה. בנוסף, איכות הכנה ניתן להעריך באמצעות חוזה אשלגן גבוהה הנגרמתיון. לדוגמה, אנו מוצאים כי 8 - 10 גברים ישנים בשבוע עכברים C57BL/6J יש התכווצות אשלגן גבוהה הנגרמת של 20 ± 3.8 MN (ממוצע ± סטיית תקן, n = 17). אם כמה חוזים הכנה קנה הנשימה גם מתחת לטווח זה (להלן 12 mn או שתי סטיות תקן מתחת לממוצע), אז זה נחשב בדרך כלל "פגום" ולא מנוצלים לניסויים. לחלופין, נורמליזציה של מתח למתח המקסימלי על אגוניסט להרוות כולינרגית ניתן להשתמש. זה שימושי לצפייה שינויים רגישות אגוניסט, אבל עלול להחמיץ שינויים שההשפעה התכווצות מקסימלית.

שיטות הוצגו להפעיל התכווצות או באמצעות אגוניסט כולינרגית או עם גירוי חשמלי. יישום אגוניסט כולינרגית לאמבטיה רקמות ישירות מפעיל שריר חלק. לעומת זאת, בתדירות EFS ​​גירוי בינוני (עד 25 הרץ) ברוב של התכווצות מתווכת באמצעות הפעלת עצב שחרור neurotransmitter 22. כך החוקר יש את ההזדמנות לחקור סוכני המשפיעים presynaptic / עצב בתיווך התכווצות באמצעות גירוי EFS. לבסוף, מחקרים מראים סוגי תאים אחרים, כגון תא הפיטום 23, ותאי אפיתל 24 גם להשפיע contractility בהכנת קנה הנשימה מבודד. לכן, כהכנה חוץ גופית קנה הנשימה העכבר מספק assay תפקודית חזקים במשך מספר סוגי תאים המשפיעים contractility וחלק דרכי הנשימה השריר.

לסיכום, העכבר כהכנה קנה הנשימה חוץ גופית הייתה שימושית במיוחד בניתוח של שינויים גנטיים המשפיעים על תפקוד דרכי הנשימה. כמה דוגמאות כוללות ניתוח knockouts גנים של תעלות יונים 17,20,25,26, קולטנים metabotropic 27,28,29,30, במורד איתות מפלי 31. בנוסף, העכבר אנטיגן תיגר משמש לעתים קרובות ללימודי אסתמה 32 ו במבחנהקנה הנשימה הכנה מספקת assay שימושי שינויים contractility כי מתפתח הפיתוח הבא של אסתמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם המרכז לחקר חדשנות מניעה וטיפול במחלות דרכי הנשימה, NINDS מענק (NS052574), ומתוך התוכנית סנדלר לחקר אסטמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analogue-Digital Converter ADInstruments PowerLab 4/35
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) Sigma-Aldrich C4832 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C)
Charting Software ADInstrtuments LabChart
Heating Circulator Haake Mixer Mill MM400
Isometric Force Transducer Kent Scientific TRN001
Stimulator Grass Technologies S88 Dual Output Square Pulse Stimulator
Tissue Bath WPI 47264

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
  2. Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
  3. Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
  4. Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
  5. Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
  6. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  7. Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
  8. Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
  9. Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
  10. Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
  11. Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
  12. Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
  13. Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
  14. Garssen, J., Loveren, H. V. an, Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
  15. Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
  16. Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
  17. Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
  18. Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
  19. Kenakin, T. P. A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , 3rd edn, Academic Press/Elsevier. (2009).
  20. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
  21. Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
  22. Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
  23. Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
  24. Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
  25. Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
  26. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
  27. Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
  28. Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
  29. Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
  30. Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
  31. Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
  32. Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).

Tags

רפואה גיליון 64 פיזיולוגיה קנה הנשימה התמרה כוח שרירים Airway חלק מועקה הקולטן כולינרגית
<em>במדידות חוץ גופית</em> של היצרות קנה הנשימה באמצעות עכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Semenov, I., Herlihy, J. T.,… More

Semenov, I., Herlihy, J. T., Brenner, R. In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice. J. Vis. Exp. (64), e3703, doi:10.3791/3703 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter