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माप tracheal कसना का प्रयोग चूहे की इन विट्रो में

Published: June 25, 2012 doi: 10.3791/3703
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, UT Health Science Center, San Antonio

Summary

ट्रांसजेनिक चूहों जीन शारीरिक समारोह ascribing के में अत्यंत उपयोगी है. सामान्य रूप में इस तरह के अनुसंधान, और airway के कार्यात्मक अध्ययन के रूप में, विशेष रूप में, murine मॉडल की ओर एक उल्लेखनीय बदलाव आया है. यहाँ हम प्रोटोकॉल के लिए प्रदान करते हैं

Protocol

1. उपकरण

एक संकुचन माप उपकरण के प्रमुख घटक 2A चित्रा में रेखाचित्र के रूप में दिखाया जाता है).

  1. एक ऊतक स्नान ऊतक स्नान गर्म तापमान पर एक ऑक्सीजन शारीरिक समाधान का कहना है. चूहों ट्रेकिआ के छल्ले के लिए, हम एक वार्मिंग समाधान, एक fritted कांच बुलबुला ऑक्सीजन प्रवेश (95% / 5% ओ 2 / सीओ 2 मिश्रण) और इनलेट आउटलेट और बदलने के लिए बंदरगाहों परिसंचारी के लिए एक 10 मिलीलीटर ऊतक स्नान है कि एक पानी जैकेट का उपयोग करें समाधान. एक जलाशय PSS के समाधान 95% की लगातार बुदबुदाती / 5% 2 हे / CO 2 ° सी पानी स्नान (नहीं दिखाया गया है). 37 में मिश्रण के साथ संग्रहीत है समाधान आदान - प्रदान के लिए, पी एस एस समाधान जलाशय से लगभग 100 mls प्रति मिनट में ऊतक स्नान प्रवेश (तल बंदरगाह) पंप है अपेक्षाकृत तेजी से समाधान के विनिमय की अनुमति है. समाधान आउटलेट एक अतिप्रवाह शीर्ष बंदरगाह पोर्ट कि ऊतक बल्ले में निरंतर मात्रा (~ 10 मिलीलीटर) की अनुमति देता है के माध्यम से हैघंटे के दौरान समाधान विनिमय. हम एक Haake हीटिंग ऊतक स्नान जैकेट के माध्यम से गर्म पानी (37 डिग्री सेल्सियस बनाए रखने) फैलानेवाला पंप का उपयोग करें. ऊतक स्नान आपूर्तिकर्ताओं की संख्या से प्राप्त किया जा सकता है और अन्वेषक की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं फिट आकारों और शैलियों की एक किस्म में आते हैं.
  2. बल transducer. के सममितीय तनाव को मापने, ट्रेकिआ ट्यूब दो स्टेनलेस स्टील के छड़ (2A चित्रा) के एल आकार का छोर पर लड़ी पिरोया है. देखभाल के लिए एक स्टेनलेस स्टील प्रकार है कि जैविक सामग्री के साथ संगत है का उपयोग करने के लिए लिया जाना चाहिए. शीर्ष छड़ी एक isometric बल transducer का एक क्लिप के माध्यम से जुड़ा हुआ है. नीचे छड़ी एक निश्चित स्थिति में ट्रेकिआ रखती है, और निष्क्रिय तनाव और / या मांसपेशियों की लंबाई का समायोजन के लिए एक micrometer पर मुहिम शुरू की है. ट्रेकिआ के संकुचन बल ट्रांसड्यूसर, जो preamplifier में वोल्टेज संकेत करने के लिए परिवर्तित किया जाता है पर तनाव पैदा करता है. नीचे छड़ी भी दो आयताकार प्लैटिनम प्लेट (4 मिमी के अलावा) टी को शामिल करने के लिए कॉन्फ़िगर किया जा सकता है टोपी दिशा ट्रेकिआ (चित्रा 2B). प्लैटिनम प्लेटें एक घास S88 उत्तेजक औधधि है कि एक बिजली के क्षेत्र के ट्रेकिआ भर में वितरण की अनुमति देता है के लिए वायर्ड रहे हैं. खुले तार और मिलाप (Sylgard 184 सिलिकॉन elastomer, डॉव Corning कॉर्प, मिडलैंड, एमआई) Sylgard के साथ लेपित हैं, स्नान समाधान में धातुओं के leaching को रोकने के लिए.
  3. ए / डी कनवर्टर कंप्यूटर, और अधिग्रहण preamplifiers से. सॉफ्टवेयर सिग्नल एक 8 ए / डी प्रणाली MacLab पर दर्ज हैं. यह वर्तमान ADInstrument Powerlab हार्डवेयर के एक पुराने संस्करण है. हम कार्यक्रम (ADInstruments) चार्ट है कि तनाव का प्रयोग भर में सतत रिकॉर्डिंग की अनुमति देता का उपयोग करें. ट्रेकिआ मांसपेशियों का तनाव पीढ़ी काफी धीमी है, और इसलिए हम पाते हैं कि प्रति सेकंड 100 अंक के अधिग्रहण पर्याप्त है. तनाव माप प्रत्येक प्रयोग से पहले ज्ञात वजन (5 ग्राम) का उपयोग कर calibrated है. इसी तरह की प्रणाली अन्य venders के (जैसे, BioPac, गिनीकृमि उपकरण) से उपलब्ध हैं.
शीर्षक "> 2. ट्रेकिआ अलगाव

  1. ऊतक अलगाव से पहले transducer का बल ज्ञात वजन के साथ calibrated है, और ऊतक स्नान सामान्य PSS के साथ भरा है (तालिका देखें मैं). हवा प्रवेश 2 हे / सीओ 2 के एक प्रकाश धारा प्राप्त करने के लिए निकाला जाता है.
  2. दो महीने या बड़े चूहों से tracheas इष्टतम हैं. छोटे जानवरों पर इस्तेमाल किया जा सकता है इन से प्राप्त tracheas उनके छोटे आकार की वजह से बल transducer तारों पर माउंट करने के लिए अधिक से अधिक कौशल की आवश्यकता होती है. विच्छेदन के लिए पहले, चूहों गहरा isoflurane है के साथ बेहोश कर रहे हैं. बेहोश करने की क्रिया का उचित स्तर तक पहुँच जाता है जब एक संदंश के साथ पैर की अंगुली - चुटकी एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने में असमर्थ है. चूहे तुरंत गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था से बलिदान एक महत्वपूर्ण नोट: हमने देखा है कि Avertin (Tribromoethanol), आमतौर पर चूहों में इस्तेमाल शामक, की airway चिकनी मांसपेशियों को मजबूत आराम प्रभाव है और इसलिए ट्रेकिआ संकुचन अध्ययन के लिए नहीं किया जाना चाहिए.
  3. त्वचा और फर छाती से गले के लिए निकाल दिया जाता है. आरIBS उरोस्थि के आधार से, laterally (दोनों पक्षों पर) दिल के शीर्ष करने के लिए काट रहे हैं. उरोस्थि और पसलियों को फिर गले दिल / फेफड़ों, थाइमस, ट्रेकिआ (उदर) और घुटकी (और ट्रेकिआ के लिए पृष्ठीय से जुड़ी) प्रकट करने के लिए आगे खींच रहे हैं.
  4. ट्रेकिआ ब्रोन्कियल द्विभाजन नीचे और ग्रसनी ऊपर काटने से excised है. ट्रेकिआ एक बहुत ठंडा ऑक्सीजन (5/95) पी एस एस समाधान (मैं टेबल में दिए संरचना) में रखा गया है.
  5. यह ट्रेकिआ आसपास के ऊतकों साफ विच्छेदित है. सफाई के दौरान, ट्रेकिआ ग्रसनी में या द्विभाजन नीचे आयोजित किया जा सकता है. हालांकि, सतर्कता ट्रेकिआ ही नहीं के संदंश सीधे लागू करने के लिए लिया जाना चाहिए. ठीक है कैंची आसपास के ऊतकों में कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कटौती हमेशा की ट्रेकिआ करने के लिए समानांतर होना चाहिए क्षति से बचने के. प्रक्रिया के इस भाग अगर ट्रेकिआ तैयारी के द्विभाजन नीचे और ग्रसनी के ऊपर एक लेपित पकवान Sylgard पर टिकी है मदद की है (Sylgard 184 सिलिकॉनElastomer, डॉव Corning कॉर्प, मिडलैंड, एमआई).
  6. आसपास के ऊतकों को हटाने के बाद, ट्रेकिआ ग्रसनी नीचे कटौती और ब्रोन्कियल द्विशाखन से ऊपर है और धीरे बल transducer तारों पर घुड़सवार.
  7. ट्रेकिआ दो एल के आकार का धातु prongs के (2A चित्रा) में पिरोया है. एक शूल में सममितीय तनाव की सतत रिकॉर्डिंग के लिए एक transducer बल विस्थापन के लिए जुड़ा हुआ है. एक और शूल सुक्ष्ममापी से जुड़ा है. ऊतक स्नान उठाया है तो इतना है कि ट्रेकिआ पी एस एस में डूब जाता है. ट्रेकिआ के बढ़ते जल्दी के रूप में संभव किया जाना चाहिए करने के लिए समय है कि ट्रेकिआ पी एस एस के बाहर आयोजित कर रहे हैं कम से कम. अभ्यास के साथ, बढ़ते ट्रेकिआ के एक मिनट के भीतर किया जा सकता है, लेकिन हम आम तौर पर समय 3 मिनट से अधिक समय से बचने के लिए व्यवहार्यता के नुकसान से बचने के.
  8. यह सुक्ष्ममापी धीरे ~ 10 MN (~ 1 ग्राम बल) के एक निष्क्रिय तनाव प्राप्त करने के लिए निकाला जाता है. इष्टतम आराम तनाव अनुभव से निर्धारित किया गया था और हम 5 ~ की कि निष्क्रिय तनाव मिल गया है - 10 एक बराबर, उच्च पोटेशियम उत्तेजना के लिए अधिक से अधिक प्रतिक्रिया में MN परिणाम. यह अन्य अध्ययन है कि इस 16,17,18 रेंज में निष्क्रिय तनाव का उपयोग का एक संख्या के साथ संगत है. पहले 5-10 मिनट से अधिक, ट्रेकिआ निष्क्रिय तनाव कुछ हद तक गिरावट घटना तनाव - छूट और सुक्ष्ममापी संतुलन दौरान ~~ 10 करोड़ निष्क्रिय तनाव को समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है जाता है है. इस ट्रेकिआ प्रयोगात्मक चुनौतियों से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए अनुमति दी संतुलित करना है.

3. उच्च पोटेशियम उत्तेजना

संतुलन के बाद, ट्रेकिआ दो बार एक उच्च पोटेशियम PSS के समाधान (67 मिमी KCl, टेबल मैं) के साथ चुनौती दी है. संकुचन आम तौर पर ~ 5-10 मिनट की आवश्यकता है तक पहुँचने के लिए स्थिर राज्य जो समय पर ऊतक स्नान सामान्य PSS के साथ कई बार ट्रेकिआ के लिए पूरी तरह से आराम से rinsed है. पोटेशियम संकुचन एक दूसरी बार दोहराया है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकुचन जब तक एक तिहाई समय (यदि आवश्यक) प्राप्त कर रहे हैं.

ट्रेकिआ दो आयताकार प्लैटिनम प्लेट (इलेक्ट्रोड) कि तैयारी के लिए बिजली क्षेत्र उत्तेजना (EFS) की अनुमति के द्वारा flanked है. EFS के लिए सिकुड़ा प्रतिक्रिया आवृत्ति और वोल्टेज के एक समारोह है. यह इलेक्ट्रोड के क्षेत्र और उनके बीच की दूरी के रूप में शारीरिक मापदंडों के द्वारा भी प्रभावित होता है. उत्तेजक औधधि की शक्ति विशेषताओं को भी ऐसी है कि उच्च voltages और वर्तमान outputs पर उत्तेजक औधधि अपनी अधिकतम तक पहुँच सकते हैं प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं. किसी भी EFS प्रणाली की विशेषताओं मांसपेशी प्रोत्साहन durations के, आवृत्तियों, voltages और नाड़ी durations के भिन्न सिकुड़ा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करके निर्धारित किया जाना चाहिए. हमारे प्रयोगात्मक सेटअप के लिए, हमने पाया है कि ~ 4 मिमी से अलग इलेक्ट्रोड, और 44 वी (0.5 एमएस दालों) और 30 हर्ट्ज की उत्तेजना आयाम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पास अधिक से अधिक सिकुड़ा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए इष्टतम है.

5. संकुचन Evcholinergic उत्तेजना द्वारा oked

exogenously यौगिकों लागू करने के लिए ट्रेकिआ की जवाबदेही या तो ब्याज की दवा की एक खुराक के अलावा द्वारा मूल्यांकन किया जाता है या संचयी खुराक फैशन में दवा की कई परिवर्धन द्वारा,. ट्रेकिआ के लिए, हमारे प्रयोगशाला नियमित carbachol के इस्तेमाल के लिए cholinergic रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए, क्योंकि acetylcholine के विपरीत, carbachol acetylcholinesterase द्वारा अपमानित नहीं है. एक उचित खुराक - प्रतिक्रिया सीमा 10 -8 से 10 एम -5 carbachol है. लॉग इन के फिटिंग [carbachol] सिकुड़ा एक हिल प्रकार के समीकरण के साथ प्रतिक्रिया वक्र 50 चुनाव आयोग (आधा अधिक से अधिक प्रभावी एकाग्रता) कि cholinergic 19 agonist के सांस की नली संकुचन की संवेदनशीलता की एक उपाय है की एक अनुमान के अनुमति देता है. यह ध्यान देने योग्य बात है कि carbachol की एक खुराक दी एक संचयी खुराक प्रतिक्रिया वक्र के भाग के रूप में की तुलना में एक एक खुराक के रूप में थोड़ा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया दे देंगे लायक है.

6. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3A में उच्च पोटेशियम सिकुड़ा प्रतिक्रिया का एक उदाहरण दिखाया गया है. संकुचन लगभग 10 मिनट के भीतर एक अधिकतम तक पहुँच जाता है, लेकिन उसके बाद एक छोटी सी गिरावट दिखा सकते हैं. उच्च पोटेशियम के प्रारंभिक वार्शआउट के दौरान, मांसपेशियों में संकुचन में एक क्षणिक वृद्धि है कि तापमान में एक बूंद के रूप में समाधान लाइनों में unheated PSS के समाधान की छोटी मात्रा transiently तैयारी perfuses के कारण है दिखा सकते हैं. इस ट्यूबिंग गर्म PSS के जलाशय और ऊतक स्नान को जोड़ने में न्यूनतम मृत मात्रा होने से कम से कम किया जा सकता है, और द्वारा भी अपेक्षाकृत जल्दी समाधान का आदान प्रदान (आम तौर पर हम 100 / मिलीलीटर मिनट पर समाधान पंप). प्रत्येक तैयारी सिकुड़ा जवाब में कुछ मतभेद मांसपेशियों या विच्छेदन दौरान किए गए नुकसान में मतभेद के कारण चित्रा 3B विभिन्न मांसपेशियों उच्च पोटेशियम और carbachol के के साथ चुनौती दी द्रव्यमान का दो tracheas से पता चलता है. हालांकि cholinergic - पैदा संकुचन अलग है,y के सामान्य बाद उच्च पोटेशियम समाधान के (चित्रा 3C) के साथ प्रतिक्रिया के लिए इसी तरह की हैं.

चित्रा 4 carbachol (cholinergic) पैदा एकल खुराक (ए) और एक संचयी वृद्धि (बी) का उपयोग संकुचन का एक उदाहरण दिखाता है. carbachol समाधान सीधे स्नान करने के लिए जोड़ रहे हैं और bubbled गैस तेजी से मिश्रण में मदद करता है. यह एक खुराक (अर्थात 1 माइक्रोन, 4A चित्रा) की है कि इसके अलावा टिप्पण लायक एक संचयी खुराक प्रतिक्रिया वक्र (1 माइक्रोन, 4B चित्रा) के दौरान बराबर एकाग्रता की तुलना में एक थोड़ा बड़ा प्रतिक्रिया है चित्रा 4C संकुचन बल की एक साजिश को दर्शाता है. carbachol 4B चित्रा से डेटा का उपयोग सांद्रता के एक समारोह के रूप में. Carbachol का प्रभाव 10 -5 एम एकाग्रता में तर. हालांकि cholinergic agonists कैल्शियम रिलीज तंत्र के माध्यम से संकुचन शुरू, संकुचन का एक बड़ा घटक भी विध्रुवण द्वारा मध्यस्थता है औरवोल्टेज पर निर्भर कैल्शियम 20 चैनल के सक्रियण.

चित्रा 5A EFS के - पैदा संकुचन का एक उदाहरण से पता चलता है. Tracheas 0.5 millisecond अवधि, 40 वोल्ट की दालों का उपयोग कर जब तक संकुचन एक पठार (इनसेट a1 देखें) तक पहुँचने को प्रेरित कर रहे हैं. उत्तेजना आवृत्ति में वृद्धि हुई है एक वृद्धि सिकुड़ा प्रतिक्रिया (आवृत्ति प्रतिक्रिया वक्र चित्रा 5B में साजिश रची है) का कारण बनता है. बिजली के क्षेत्र उत्तेजना संकुचन को presynaptic तंत्रिकाओं को सक्रिय करने के द्वारा मुख्य रूप से पैदा करने के लिए दिखाया गया है. यह बोटुलिनम विष के प्रभाव, neurotransmitter रिहाई ब्लॉक ट्रेकिआ के 21 EFS के पैदा संकुचन के बहुमत के एक अवरोधक के द्वारा evidenced है. इसके अलावा, tetrodotoxin, एक एजेंट है कि ब्लॉक ना + चैनलों भी तंत्रिका गतिविधि को रोकता है और ट्रेकिआ के EFS के जवाब समाप्त.

चित्रा 1
चित्रा 1 टी के आरेख.वह एक अलग ट्रेकिआ तैयारी में संकेत दे रास्ते प्रमुख. दिखाया एक cholinergic एक ट्रैकियल चिकनी मांसपेशी कोशिका अक्षतंतु innervating टर्मिनल है. प्रमुख संकेत दे रास्ते एम 3-M2-muscarinic acetylcholine रिसेप्टर (mACHR) के सक्रियण है कि IP3 रिसेप्टर्स (एम 3) और शिविर की कमी (M2) के माध्यम से कैल्शियम की रिहाई के कारण हैं. M2 रिसेप्टर्स (और एम 3 रिसेप्टर्स की कुछ योगदान) भी cholinergic - पैदा विध्रुवण है कि एल वोल्टेज पर निर्भर प्रकार कैल्शियम चैनल और कैल्शियम बाढ़ सक्रिय हो. आम सिकुड़ा एजेंटों और उनके effectors हैं 1. उच्च पोटेशियम (चिकनी पेशी सेल और cholinergic अक्षतंतु चुम्बकत्व से वंचित करना), 2. बिजली के क्षेत्र (EFS, cholinergic अक्षतंतु depolarizes है) उत्तेजना और 3. acetylcholine या carbachol जैसे cholinergic एजेंट के exogenous आवेदन (muscarinic रिसेप्टर्स सीधे सक्रिय).

चित्रा 2
चित्रा 2 सांस की नली संकुचन को मापने के लिए उपकरणों का इस्तेमाल किया आरेख.. ए बल transducer सुक्ष्ममापी, और ऊतक स्नान पेंच clamps के माध्यम से समर्थन छड़ पर बढ़ रहे हैं. ऊपर और नीचे की छड़ पर सांस की नली अंगूठी को उसमें जोड़ दिया गया है. आरेख में, ऊतक स्नान तैयारी नीचे तैनात है (ट्रेकिआ के बल ट्रांसड्यूसर पर बढ़ते दौरान) अर्थात्. संकुचन अध्ययन के दौरान, स्नान ऊतक खड़ी तैयारी स्नान करने के लिए ले जाया जाता है. बिजली क्षेत्र उत्तेजना नीचे छड़ी के लिए बी दो प्लैटिनम प्लेटें कि laterally ट्रेकिआ होल्डिंग तार करने के लिए बढ़ रहे हैं को शामिल करने के लिए संशोधित किया गया है. प्लैटिनम प्लेटें एक उत्तेजक औधधि के लिए बिजली के तारों से जुड़े हुए हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 उच्च पोटेशियम के उदाहरण (67 मिमी) ट्रेकिआ के सिकुड़ा प्रतिक्रिया. (ए) डुप्लिकेट, उच्च पोटेशियम के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. (बी) के उदाहरण दो अलग tracheas के carbachol सिकुड़ा प्रतिक्रिया है. (सी) बी में tracheas जवाब करने के लिए समान हैं जब सामान्यउच्च पोटेशियम प्रतिक्रिया के लिए घ.

चित्रा 4
चित्रा 4 carbachol प्रेरित संकुचन के उदाहरण हैं. (ए) Carbachol प्रेरित एकल खुराक का उपयोग कर संकुचन वार्शआउट द्वारा पीछा किया. (बी) में ट्रेकिआ (सी) ए बी से चोटी संकुचन के लिए उदाहरण संचयी खुराक प्रतिक्रिया वक्र carbachol एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते हैं.

चित्रा 5
5 चित्रा बिजली क्षेत्र उत्तेजना के द्वारा पैदा की संकुचन के उदाहरण हैं. (ए) की ट्रेकिआ संकुचन 0.5 एमएस नाड़ी, 40 वोल्ट, और विभिन्न उत्तेजना आवृत्तियों का उपयोग बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के रूप में संकेत दिया. इनसेट 30 हर्ट्ज पर समय विस्तार संकुचन है. (बी) एक से पीक संकुचन plotteउत्तेजना आवृत्ति के एक समारोह के रूप में घ.

सामान्य PSS के

नमक सान्द्र. (मिमी) राशि (/ 2 ग्राम एल)
NaCl 119 13.91
KCl 4.7 0.7
2 के.एच. पीओ 4 1.18 0.32
4 MgSO एक्स 7 2 हे 1.17 0.58
3 NaHCO 18 3.02
EDTA 0.026 0.5 एम के 0.1 मिलीलीटर
ग्लूकोज 11 3.96
Sucrose 12.5 8.56
2 CaCl 2 10 मिमी की 400 मिलीलीटर

उच्च कश्मीर + पी एस एस (एनएसीएल और KCl समायोजन)

नमक सान्द्र. (मिमी) राशि (/ 2 ग्राम एल)
NaCl 56.7 6.628
KCl 67 9.991

PSS के समाधान के लिए टेबल पकाने की विधि 1 ध्यान दें: समाधान बना रहे हैं ताजा साप्ताहिक, ultrapure गुणवत्ता पानी के साथ, और contaminating के विकास से बचने के 5 दिनों की तुलना में नहीं के लिए एक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत कर रहे हैं.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत करने के लिए airway मांसपेशियों समारोह का आकलन करने के लिए एक शारीरिक तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान करता है. हम आम तौर पर 3-4 अंग स्नान की तैयारी एक साथ काम है, तथापि, prepackaged सिस्टम आपूर्तिकर्ताओं कि 8 तैयारियाँ (ADInstruments, विश्व परिशुद्धता उपकरण, और हार्वर्ड उपकरण) के ऊपर के युगपत माप की अनुमति के एक नंबर से उपलब्ध हैं. हम बल transducers और ऊतक अंग स्नान के बराबर परिणामों के साथ एक नंबर का उपयोग किया है. हालांकि, हम पाते हैं कि बिजली के क्षेत्र उत्तेजना कुछ उत्तेजक आकार इलेक्ट्रोड, इलेक्ट्रोड प्लेटों के बीच की दूरी, और बिजली के क्षेत्र के भीतर तैयार करने की स्थिति के बीच मामूली अंतर के आधार पर परिवर्तनशीलता प्रदान करता है. इस प्रकार, अतिरिक्त देखभाल के रूप में संभव के रूप में इसी तरह के क्षेत्र इलेक्ट्रोड बनाने के लिए किया जाना चाहिए.

एक सममितीय बल के मापन में सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर के संकुचन सामान्य मांसपेशियों में बदलाव के लिए क्षतिपूर्ति करने का मुद्दा है, याविभिन्न तैयारी के बीच मांसपेशियों के ऊतकों की स्वास्थ्य. भाग में, मतभेद समान उम्र और एक ही लिंग (मादा चूहों को कम ट्रेकिआ तनाव उत्पन्न करते हैं) के पशुओं की तुलना द्वारा कम किया जा सकता है. इसके अलावा, हमने पाया है कि ट्रेकिआ गीला या सूखी वजन सामान्य पर्याप्त परिशुद्धता, संभवतः माउस ट्रेकिआ के छोटे आकार के कारण का अभाव है. बल्कि, कई, उच्च पोटेशियम संकुचन, उपयोग काफी लाभदायक है. उच्च पोटेशियम संकुचन दो उद्देश्यों की सेवा. उच्च पोटेशियम संकुचन के सांस की नली मांसपेशी "जगाने" होता है और यह सुनिश्चित करता है कि संकुचन प्रयोगात्मक चुनौतियों के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. उच्च पोटेशियम संकुचन भी सक्रिय मांसपेशियों है कि तैयारी में मौजूद है के लिए एक सटीक सामान्य प्रतीत होता है. इस प्रकार, माप प्रयोगात्मक तनाव अक्सर उच्च पोटेशियम संकुचन सामान्य बल के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. इसके अलावा, एक तैयारी की गुणवत्ता में उच्च पोटेशियम प्रेरित अनुबंध का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता हैआयन. उदाहरण के लिए, हम पाते हैं कि 8-10 सप्ताह पुरानी C57BL/6J नर चूहों 20 के एक उच्च पोटेशियम प्रेरित संकुचन ± 3.8 MN (± मानक विचलन, n = 17) का अर्थ है. यदि इस रेंज (12 MN या दो मानक विचलन नीचे का मतलब है नीचे) नीचे अच्छी तरह से एक ट्रेकिआ तैयारी अनुबंध है, तो यह आम तौर पर "क्षतिग्रस्त" और नहीं प्रयोग के लिए उपयोग के रूप में माना जाता है. वैकल्पिक रूप से, saturating cholinergic agonist पर अधिकतम तनाव तनाव का सामान्य इस्तेमाल किया जा सकता है. यह agonist के लिए संवेदनशीलता में परिवर्तन के अवलोकन के लिए उपयोगी है, लेकिन परिवर्तन अधिकतम संकुचन प्रभाव के कि याद कर सकते हैं.

तरीकों संकुचन या तो सक्रिय cholinergic या बिजली की उत्तेजना के साथ agonist का उपयोग कर प्रस्तुत किए गए. Cholinergic agonist के ऊतक स्नान के लिए आवेदन सीधे चिकनी पेशी सक्रिय. इसके विपरीत, मध्यम EFS उत्तेजना आवृत्ति के साथ (25 हर्ट्ज) संकुचन की बहुमत तंत्रिका सक्रियण और neurotransmi की रिहाई के माध्यम से मध्यस्थता है22 tter. इस प्रकार अन्वेषक एजेंटों कि presynaptic / तंत्रिका मध्यस्थता EFS के उत्तेजना का उपयोग संकुचन को प्रभावित की जांच करने का अवसर है. अंत में, अध्ययन है कि मस्तूल 23 कोशिकाओं, और उपकला कोशिकाओं 24 भी पृथक ट्रेकिआ तैयारी में सिकुड़ना को प्रभावित के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं से संकेत मिलता है. इस प्रकार, इन विट्रो माउस ट्रेकिआ तैयारी में सेल प्रकार है कि airway चिकनी मांसपेशियों सिकुड़ना प्रभाव की एक संख्या के लिए एक मजबूत कार्यात्मक परख प्रदान करता है.

सारांश में, इन विट्रो ट्रेकिआ तैयारी में माउस विशेष रूप से उपयोगी है कि airway समारोह को प्रभावित आनुवंशिक परिवर्तन का विश्लेषण किया गया है. कुछ उदाहरणों में आयन चैनल 17,20,25,26, metabotropic रिसेप्टर्स 27,28,29,30 knockouts के जीन के विश्लेषण शामिल हैं, और नीचे की ओर 31 cascades संकेत. इसके अलावा 32, प्रतिजन को चुनौती दी माउस अक्सर अस्थमा अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है और इन विट्रो मेंट्रेकिआ तैयारी सिकुड़ना में परिवर्तन है कि अस्थमा के निम्न विकास ensues है के लिए एक उपयोगी परख प्रदान करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम से रोकथाम में अभिनव के लिए केंद्र और श्वासनली रोग, NINDS अनुदान (NS052574), के उपचार और अस्थमा के अनुसंधान के लिए सैंडलर कार्यक्रम से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analogue-Digital Converter ADInstruments PowerLab 4/35
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) Sigma-Aldrich C4832 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C)
Charting Software ADInstrtuments LabChart
Heating Circulator Haake Mixer Mill MM400
Isometric Force Transducer Kent Scientific TRN001
Stimulator Grass Technologies S88 Dual Output Square Pulse Stimulator
Tissue Bath WPI 47264

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References

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चिकित्सा अंक 64 फिजियोलॉजी ट्रेकिआ बल पारगमन श्वासनली चिकनी पेशी कसना cholinergic रिसेप्टर
माप tracheal कसना का प्रयोग चूहे की <em>इन विट्रो में</em>
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Semenov, I., Herlihy, J. T.,… More

Semenov, I., Herlihy, J. T., Brenner, R. In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice. J. Vis. Exp. (64), e3703, doi:10.3791/3703 (2012).

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