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Medicine

Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice

Published: June 25, 2012 doi: 10.3791/3703

Summary

Topi transgenici sono stati estremamente utili per attribuire funzione fisiologica ai geni. Come tale, la ricerca in generale, e studi funzionali delle vie aeree, in particolare, hanno subito un notevole spostamento verso modelli murini. Qui forniamo protocolli per

Abstract

Transgenici e topi knockout sono potenti strumenti per lo studio della fisiologia e fisiopatologia delle vie aeree 1,2. In tensometry isolati in vitro di preparazioni tracheali ha dimostrato di essere un saggio utile della muscolatura liscia delle vie aeree (ASM) risposta contrattile nei topi geneticamente modificati. Questi preparati in vitro tracheali sono relativamente semplici, forniscono una risposta forte, e trattenere sia funzionali terminazioni nervose colinergiche e risposte muscolari, anche dopo lunghi incubazioni.

Tensometry tracheale fornisce inoltre un saggio funzionale per studiare una varietà di vie di segnalazione secondo messaggero che influenzano la contrazione della muscolatura liscia. Contrazione della trachea è mediato principalmente dai parasimpatici, nervi colinergici che rilasciano acetilcolina sulla ASM (Figura 1). I principali recettori muscarinici dell'acetilcolina ASM sono M2 e M3 che sono G e I / O GQ recettori accoppiati, rispettivamente 3,6,7. M2 / G i / o segnalazione è creduto per migliorare contrazioni mediante inibizione di adenilato ciclasi che porta ad una diminuzione dei livelli di cAMP 5,8,9,10. Questi percorsi costituiscono il cosiddetto "farmaco-contrazione" della muscolatura liscia delle vie aeree 11. Inoltre, colinergici segnalazione attraverso i recettori M2 e M3 modulata dal segnale) comporta percorsi che depolarizzare il ASM che a loro volta attivano L-type, voltaggio-dipendenti canali del calcio (Figura 1) e flusso di calcio (cosiddetto "eccitazione-contrazione" ) 4,7. Recensioni più dettagliate sulle vie di segnalazione che controllano costrizione delle vie respiratorie può essere trovato 4,12. Le vie di cui sopra sembrano essere conservati tra i topi e altre specie. Tuttavia, trachee topo differiscono da altre specie in alcuni percorsi di segnalazione. Il più importante è la loro mancanza di risposta contrattile di istamina e adenosina 13,14, entrambi i modulatori ASM ben noti negli esseri umani e altre specie 5,15.

Presentiamo qui protocolli per l'isolamento di murini anelli tracheali e la misura in vitro della loro produzione contrattile. Sono incluse le descrizioni della configurazione delle apparecchiature, l'isolamento anello di trachea e misure contrattili. Esempi sono forniti per evocare contrazioni indirettamente con elevata stimolazione dei nervi e potassio direttamente da depolarizzazione del muscolo ASM attivare il voltaggio-dipendenti influsso di calcio (1. Alto K +, Figura 1). Inoltre, i metodi sono presentati per stimolazioni di nervi solo utilizzando stimolazione di campo elettrico (2. EFS, Figura 1) stimolazione, o per diretta del muscolo ASM utilizzando neurotrasmettitore esogeno applicato alla vasca (3. Esogeno ACH, Figura 1). Questo FLExibility e facilità di preparazione rende il modello di anello trachea isolata un saggio robusto e funzionale per un numero di segnalazione cascate coinvolti nella contrazione muscolare liscia delle vie aeree.

Protocol

1. Attrezzatura

I componenti principali di un dispositivo di misurazione contrazione sono mostrate schematicamente in figura 2A).

  1. Un bagno tessuto. Il bagno tessuto mantiene una soluzione ossigenata fisiologica a temperatura calda. Per topi anelli trachea, si usa un bagno tessuto 10 ml contenente una camicia d'acqua per la circolazione di una soluzione di riscaldamento, un ingresso di vetro sinterizzato a bolle di ossigeno (95% / 5% O 2 / CO 2 miscela) e di ingresso e di uscita per cambiare soluzioni. Una soluzione PSS serbatoio viene memorizzato a ebollizione costante del 95% / 5% O 2 / CO 2 in miscela a 37 ° C in bagno di acqua (non mostrato). Per gli scambi, soluzione PSS viene pompata dal serbatoio verso l'ingresso bagno tessuto (porta inferiore) a circa 100 ml al minuto per consentire lo scambio di soluzione relativamente veloce. La soluzione è presa attraverso una porta troppopieno (apertura superiore) che permette volume costante (~ 10 ml) nel tessuto del bloccoh durante la soluzione di scambio. Usiamo un circolatore Haake riscaldamento per pompare acqua calda attraverso la camicia bagno di tessuto (per mantenere 37 ° C). Bagni dei tessuti può essere ottenuto da una serie di fornitori e sono disponibili in una varietà di formati e stili per soddisfare le esigenze sperimentali del ricercatore.
  2. Un trasduttore di forza. Per misurare la tensione isometrica, il tubo trachea viene infilato su L-forma estremità di due barre di acciaio inossidabile (Figura 2A). Si deve prestare attenzione ad utilizzare un tipo di acciaio inossidabile che è compatibile con materiale biologico. L'asta superiore è collegato tramite una clip a un trasduttore di forza isometrica. L'asta inferiore contiene la trachea in una posizione fissa, ed è montato su un micrometro per la regolazione della tensione passiva e / o lunghezza del muscolo. Contrazione della trachea crea tensione sul trasduttore di forza, che viene convertito in un segnale di tensione al preamplificatore. L'asta inferiore può anche essere configurato per includere due piastre rettangolari platino (4 mm di distanza) t cappello fianco della trachea (Figura 2B). Le piastre platino sono collegati ad uno stimolatore Grass S88 che consente l'erogazione di un campo elettrico attraverso la trachea. Fili aperti e saldatura sono rivestiti con Sylgard (Sylgard 184 elastomero di silicone, Dow Corning Corp, Midland, MI), per evitare la lisciviazione dei metalli nella soluzione del bagno.
  3. A / D converter software, computer e acquisizione. Segnali provenienti dai preamplificatori sono registrati su un MacLab 8 A / D del sistema. Questa è una versione precedente di hardware corrente ADInstrument PowerLab. Usiamo il programma grafico (ADInstruments) che consente la registrazione continua della tensione in tutto l'esperimento. Generazione di tensione del muscolo trachea è piuttosto lento, e quindi troviamo che l'acquisizione di 100 punti al secondo è sufficiente. La misura della tensione viene calibrato utilizzando pesi noti (fino a 5 grammi) prima di ogni esperimento. Sistemi simili sono disponibili presso i venditori di altri (ad esempio, BIOPAC, Instruments GW).
titolo "> 2. Trachea isolamento

  1. Prima di isolamento tessuto il trasduttore di forza viene calibrato con pesi noti, e il bagno tessuto viene riempito con PSS normali (vedi Tabella I). L'entrata dell'aria è regolata per ottenere un flusso di luce di O 2 / CO 2.
  2. Trachee da due mesi o topi più anziani sono ottimali. I piccoli animali possono essere usati ma trachee ottenuti da questi richiedono una maggiore abilità da montare sui cavi dei trasduttori di forza a causa delle loro piccole dimensioni. Prima di dissezione, i topi sono profondamente sedato con isoflurano. Il livello adeguato di sedazione viene raggiunto quando un dito-pinch con pinza è in grado di suscitare una risposta. I topi sono immediatamente sacrificati mediante dislocazione cervicale Una nota importante:. Abbiamo osservato che Avertin (Tribromoethanol), un sedativo comunemente usato nei topi, ha forti effetti rilassanti sulla muscolatura liscia delle vie aeree e, pertanto, non deve essere utilizzato per gli studi di contrazione trachea.
  3. La pelle (e in pelliccia) viene rimosso dal torace alla gola. Ribs sono tagliati dalla base dello sterno, lateralmente (su entrambi i lati) all'inizio del cuore. Lo sterno e le costole sono poi tirato in avanti alla gola per rivelare il cuore / polmoni, timo, trachea (ventrale) ed esofago (allegata al - e dorsale a trachea).
  4. La trachea viene asportata tagliando la biforcazione bronchiale sotto e sopra la faringe. La trachea viene inserito in un gelido ossigenato (95/5) soluzione di PSS (composizione indicata nella tabella I).
  5. La trachea è sezionato pulizia dei tessuti circostanti. Durante la pulizia, la trachea può essere tenuto alla faringe o al di sotto della biforcazione. Tuttavia, si deve fare attenzione a non applicare direttamente le pinze alla stessa trachea. Forbici Belle può essere usato per tagliare tessuti circostanti, ma il taglio deve essere effettuato sempre parallelo alla trachea per evitare danni. Questa parte della procedura è facilitata se la preparazione trachea è bloccato sotto la biforcazione e sopra la faringe su un Sylgard rivestita piatto (Sylgard 184 SiliconeElastomero, Dow Corning Corp, Midland, MI).
  6. Dopo aver rimosso il tessuto circostante, la trachea è tagliato sotto la faringe e sopra la biforcazione bronchiale e delicatamente montato su fili trasduttori di forza.
  7. La trachea viene infilato su due a forma di L uncini metallici (Figura 2A). Un rebbio è collegato ad un trasduttore forza-spostamento per la registrazione continua della tensione isometrica. Un altro polo è collegato ad un micrometro. Il bagno tessuto viene quindi sollevato in modo che la trachea è immerso in PSS. Montaggio della trachea dovrebbe essere fatto più rapidamente possibile per ridurre il tempo trachea si tengono fuori di PSS. Con la pratica, il montaggio della trachea può essere fatto in un minuto ma in genere evitare di volte di più di 3 minuti per evitare la perdita di vitalità.
  8. Il micrometro viene regolato lentamente per ottenere una tensione passiva di ~ 10 mN (~ 1 grammo-forza). La tensione ottimale di riposo è stata determinata empiricamente e abbiamo trovato che la tensione passiva di circa 5-10 risultati mN in un equivalente, massima risposta ad alta stimolazione di potassio. Questo è coerente con un numero di altri studi che utilizzano una tensione passiva in questo intervallo 16,17,18. Nei primi 5-10 minuti, trachea tensione passiva tende a scendere leggermente (stress-rilassamento fenomeno) e il micrometro viene utilizzato per regolare la tensione passiva a ~ 10 mN durante equilibrazione. La trachea è lasciato equilibrare per almeno 1 ora prima sfide sperimentali.

3. Alta stimolazione di potassio

Equilibrazione seguito, la trachea è sfidato due volte con una soluzione di alta PSS di potassio (67 mM KCl, Tabella I). La contrazione generalmente richiede 5-10 minuti per raggiungere ~ steady-state in quel momento il bagno tessuto è risciacquato più volte con PSS normali per rilassarsi completamente la trachea. La contrazione potassio viene ripetuto una seconda volta, e una terza volta (se necessario) fino contrazioni riproducibili.

La trachea è fiancheggiato da due piastre rettangolari platino (elettrodi) che permettono la stimolazione di campo elettrico (EFS) alla preparazione. La risposta contrattile alla EFS è una funzione della frequenza e tensione. Esso è inoltre influenzata da parametri fisici quali la superficie degli elettrodi e la distanza tra loro. Le caratteristiche di potenza del stimolatore anche influenzare la risposta tali che a tensioni superiori e uscite di corrente lo stimolatore può raggiungere il suo massimo. Le caratteristiche di ogni sistema EFS dovrebbe essere determinata esaminando le risposte muscolari contrattili a diverse durate di stimolo, frequenze, tensioni e durate di impulso. Per il nostro setup sperimentale, abbiamo scoperto che gli elettrodi separati da ~ 4 mm, ampiezza e la stimolazione di 44 V (0,5 ms impulsi) e di 30 Hz è ottimale per raggiungere riproducibili risposte contrattili quasi massimi.

5. Contrazione Evoked dalla stimolazione colinergica

La reattività della trachea di esogena composti applicati è valutata mediante aggiunta di una singola dose del farmaco di interesse o, con aggiunte multiple del farmaco in modo dose cumulativa. Per la trachea, il nostro laboratorio solitamente usata carbacolo per attivare i recettori colinergici, perché, a differenza di acetilcolina, carbacolo non è degradato dalla acetilcolinesterasi. Una ragionevole dose-risposta è compreso tra 10 -8 a 10 -5 M carbacolo. Montaggio del registro [carbacolo] contrattile curva di risposta con uno di tipo Hill-equazione consente una stima della CE 50 (mezza raggiungere la massima concentrazione efficace) che è una misura della sensibilità di contrazione tracheale per l'agonista colinergico 19. Vale la pena notare che una data dose di carbacolo darà una risposta leggermente maggiore in dose singola che come parte di una curva di risposta alla dose cumulativa.

6. Risultati rappresentativi Un esempio di una risposta contrattile di potassio è mostrata in Figura 3A. La contrazione raggiunge un massimo in circa 10 minuti, ma può mostrare un lieve calo negli anni successivi. Durante il lavaggio iniziale di potassio, il muscolo può mostrare un aumento transitorio di contrazione che è causa di una caduta nella temperatura del piccolo volume di soluzione PSS riscaldato nelle linee soluzione perfusione transitoriamente la preparazione. Questo può essere minimizzata con un volume morto minimo nella tubazione che collega il serbatoio riscaldata PSS bagno e tessuti, e anche attraverso lo scambio di soluzione relativamente velocemente (generalmente si pompa soluzioni a 100 ml / min). Ogni preparazione avrà alcune differenze nella risposta contrattile a causa delle differenze di massa muscolare o danni verificatisi durante la dissezione. 3B figura mostra due trachee di massa muscolare diversa sfidati con potassio e carbacolo. Anche se le contrazioni colinergici-evocati differiscono, ily sono simili dopo la normalizzazione della risposta con soluzione di potassio (Figura 3C).

La figura 4 mostra un esempio di (colinergico) contrazione carbacolo evocata utilizzando dosi singole (A) e un aumento cumulativo (B). Le soluzioni carbacolo vengono aggiunti direttamente alla vasca e il gas gorgogliati aiuta in miscelazione rapida. Vale la pena notare che l'aggiunta di una singola dose (cioè 1 pM, Figura 4A) ha una risposta leggermente maggiore della concentrazione equivalente durante un cumulativa curva dose-risposta (1 pM, Figura 4B). Figura 4C mostra un grafico della forza di contrazione in funzione delle concentrazioni carbacolo utilizzando i dati di Figura 4B. Effetti di carbacolo saturano ad concentrazione 10 -5 M. Anche se agonisti colinergici avvia contrazione attraverso meccanismi di rilascio di calcio, una componente sostanziale della contrazione è mediata da depolarizzazione eattivazione di canali voltaggio-dipendenti calcio 20.

Figura 5A mostra un esempio di EFS evocati contrazioni. Trachee sono stimolati con durata di 0,5 millisecondi, 40 impulsi volt fino contrazioni raggiungere un plateau (vedi riquadro a1). Un aumento della frequenza di stimolazione determina un aumento della risposta contrattile (frequenza curva di risposta è riportata in Figura 5B). Stimolazione del campo elettrico è stato dimostrato per evocare contrazioni prevalentemente attivando nervi presinaptici. Ciò è dimostrato dal l'effetto della tossina botulinica, un bloccante del rilascio di neurotrasmettitore che blocca la maggior parte delle contrazioni EFS-evocati trachea 21. Inoltre, tetrodotossina, un agente che blocca i canali del Na + inibisce anche l'attività nervosa ed elimina la risposta della trachea per EFS.

Figura 1
Figura 1. Schema di tha grandi vie di segnalazione in una preparazione trachea isolata. Mostrato è un terminale assone colinergico innerva una cellula del muscolo liscio tracheale. Le vie di segnalazione principali sono M3-M2-muscarinici e l'attivazione del recettore dell'acetilcolina (mAChR) che causano il rilascio del calcio attraverso i recettori IP3 (M3) e la riduzione del cAMP (M2). Recettori M2 (e alcuni contributo dei recettori M3) anche causare depolarizzazione colinergica evocata che attiva L canali di tipo dipendente dalla tensione di calcio e influsso di calcio. Comuni agenti contrattili e dei loro effettori sono: 1. di potassio (depolarizzare cellule muscolari lisce e assoni colinergici), 2. campo di stimolazione elettrica (EFS, depolarizza colinergico assone) e 3. l'applicazione esogena di agenti colinergici quali acetilcolina o carbacolo (attiva i recettori muscarinici direttamente).

Figura 2
Figura 2. Schema di materiale utilizzato per misurare le contrazioni tracheali. A. Il trasduttore di forza, micrometro e bagno tessuti sono montati su asta di supporto tramite morsetti a vite. L'anello tracheale è filettato sulle aste superiore e inferiore. Nel diagramma, il bagno di tessuto è posizionata sotto la preparazione (ad esempio durante il montaggio della trachea sul trasduttore di forza). Durante gli studi di contrazione, il bagno tessuto viene spostata verticalmente a fare il bagno la preparazione. B. Per la stimolazione del campo elettrico l'asta inferiore viene modificato per includere due piastre platino che sono montati lateralmente al filo azienda trachea. Le piastre platino sono collegati da fili elettrici ad uno stimolatore.

Figura 3
Figura 3. Esempi di potassio (67 mM) di risposta contrattile della trachea. (A) mostra duplicati, risposte riproducibili al potassio alto. (B) Esempi di risposta contrattile alla carbacolo di due differenti trachee. (C) Le risposte alle trachee in B sono simili quando normalizzared per la risposta ad alta potassio.

Figura 4
Figura 4. Esempi di carbacolo contrazioni indotte. (A) carbacolo contrazioni indotte sono state somministrate dosi singole seguita da washout. (B) Esempio cumulativa curva dose-risposta per la trachea in A. (C) contrazioni picco da B vengono tracciati come funzione della concentrazione carbacolo.

Figura 5
Figura 5. Esempi di contrazioni evocati dalla stimolazione del campo elettrico. (A) stimolazione del campo elettrico della contrazione trachea utilizzando impulsi 0,5 ms, 40 volt, e frequenze di stimolazione diversi come indicato. Inset è tempo espanso contrazione a 30 Hz. (B) contrazioni di picco di A sono plotted in funzione della frequenza di stimolazione.

PSS normali

Sale Conc. (MM) Importo (g / 2 L)
NaCl 119 13,91
KCl 4,7 0,7
KH 2 PO 4 1,18 0,32
MgSO 4 x 7H 2 O 1,17 0,58
NaHCO 3 18 3,02
EDTA 0,026 0,1 ml di 0,5 M
Glucosio 11 3,96
Saccarosio 12,5 8,56
CaCl 2 2 400 ml di 10 mM

Alta K + PSS (NACL e rettifiche KCl)

Sale Conc. (MM) Importo (g / 2 L)
NaCl 56,7 6,628
KCl 67 9,991

. Tabella 1 Ricetta per soluzioni PSS. Nota: Le soluzioni sono fatta fresca ogni settimana, con acqua ultrapura di qualità, e sono conservate in frigorifero per non più di 5 giorni per evitare di contaminare la crescita.

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Discussion

Il protocollo qui presentato fornisce una preparazione fisiologica per valutare la funzionalità muscolare delle vie aeree. In genere funzionano 3-4 prodotti per il bagno di organi contemporaneamente, tuttavia, i sistemi preconfezionati sono disponibili un certo numero di fornitori che permettono misurazioni simultanee fino a 8 preparazioni (ADInstruments, strumenti di precisione del mondo, e apparecchi di Harvard). Abbiamo utilizzato un certo numero di trasduttori di forza e bagni organo tessuto con risultati equivalenti. Tuttavia, si trova che la stimolazione del campo elettrico fornisce una certa variabilità sulla base delle differenze tra elettrodi stimolatori dimensioni, distanza tra le piastre di elettrodi, e posizione del preparato all'interno del campo elettrico. Pertanto, particolare attenzione dovrebbe essere rivolta a fare elettrodi di campo più simili possibile.

Uno dei parametri più critici nelle misurazioni forza isometrica è la questione della normalizzazione contrazioni per compensare le variazioni della massa muscolare, ola salute del tessuto muscolare tra le diverse preparazioni. In parte, le differenze possono essere minimizzati confrontando animali della stessa età e dello stesso sesso (topi di sesso femminile tendono a generare tensione ridotta trachea). Inoltre, abbiamo trovato che la normalizzazione di peso trachea bagnato o asciutto manca sufficiente precisione, probabilmente a causa delle ridotte dimensioni di topo trachea. Piuttosto, l'uso di più, alto potassio, contrazioni è molto vantaggiosa. Alta contrazioni potassio servire a due scopi. La contrazione di potassio sembra "risvegliare" il muscolo tracheale e garantisce che le contrazioni sono riproducibili prima di procedere con le sfide sperimentali. La contrazione potassio sembra essere anche una normalizzazione accurato per la massa muscolare attiva che è presente nella preparazione. Pertanto, le misure sperimentali di tensione sono spesso espressi come forza normalizzata alla contrazione di potassio. Inoltre, la qualità di un preparato può essere valutata usando il potassio alto indotta contrattoione. Ad esempio, troviamo che da 8 a 10 settimane topi maschi C57BL/6J hanno un alto di potassio indotta contrazione di 20 ± 3,8 mN (media ± deviazione standard, n = 17). Se un contratto di preparazione trachea ben al di sotto di tale intervallo (inferiore a 12 MN o due deviazioni standard sotto la media), allora è generalmente considerata come "danneggiato" e non utilizzati per la sperimentazione. In alternativa, la normalizzazione di tensione per la massima tensione di saturazione agonista colinergico può essere utilizzato. Questo è utile per osservare i cambiamenti nella sensibilità alla agonista, ma possono perdere le modifiche che per effetto di contrazione massima.

I metodi sono stati presentati per attivare la contrazione sia utilizzando un agonista colinergico o con stimolazione elettrica. Applicazione agonista colinergico al bagno attiva direttamente il tessuto muscolare liscio. Al contrario, con moderata frequenza di stimolazione EFS (fino a 25 Hz), la maggior parte della contrazione è mediato attraverso l'attivazione dei nervi e il rilascio di neurotransmitter 22. Così il ricercatore ha la possibilità di indagare gli agenti che influenzano presinaptica / contrazione del nervo-mediata con la stimolazione EFS. Infine, gli studi indicano che altri tipi cellulari come mastociti 23, e cellule epiteliali 24 anche influenzare contrattilità nella preparazione trachea isolata. Così, la preparazione in vitro topo trachea fornisce un saggio funzionale robusta per un certo numero di tipi di cellule che influenzano contrattilità muscolare liscia delle vie aeree.

In sintesi, il mouse preparazione in vitro trachea è stata particolarmente utile in analisi di alterazioni genetiche che influiscono sulla funzione delle vie aeree. Alcuni esempi includono l'analisi del gene ko dei canali ionici, recettori metabotropici 17,20,25,26 27,28,29,30, ea valle di segnalazione cascate 31. Inoltre, il mouse antigene impugnato viene spesso utilizzato per studi asma 32 e in vitrotrachea preparazione prevede un saggio utile per le modifiche della contrattilità che consegue lo sviluppo successivo di asma.

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del Centro per l'Innovazione nella prevenzione e nel trattamento delle malattie delle vie aeree, NINDS sovvenzione (NS052574), e dal Programma per la Ricerca Sandler asma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analogue-Digital Converter ADInstruments PowerLab 4/35
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) Sigma-Aldrich C4832 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C)
Charting Software ADInstrtuments LabChart
Heating Circulator Haake Mixer Mill MM400
Isometric Force Transducer Kent Scientific TRN001
Stimulator Grass Technologies S88 Dual Output Square Pulse Stimulator
Tissue Bath WPI 47264

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<em>Nelle</em> misure <em>in vitro</em> di costrizione tracheale con Mice
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Semenov, I., Herlihy, J. T.,More

Semenov, I., Herlihy, J. T., Brenner, R. In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice. J. Vis. Exp. (64), e3703, doi:10.3791/3703 (2012).

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