Summary
トランスジェニックマウスは、遺伝子に生理的機能をascribingで非常に有用であった。一般的にこのような、研究、気道の機能的研究として、具体的には、マウスモデルに向かって顕著シフトを受けています。ここでのプロトコルを提供する
Abstract
トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスは、気道1,2の生理と病態の調査のための強力なツールとなっている。分離された気管の製剤の in vitro tensometry では気道平滑筋（ASM）遺伝子改変マウスにおける収縮反応の有用なアッセイであることが証明されています。 試験管内気管の準備で 、これらは比較的単純であり、堅牢な応答を提供し、さらに長時間のインキュベーション後に、機能的なコリン作動性神経終末と筋応答の両方を保持します。
気管tensometryまた、平滑筋の収縮に影響を与えるセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路の様々な勉強するための機能アッセイを提供する。気管の収縮は、主にASM（ 図1）にアセチルコリンを放出する副交感神経、コリン作動性神経によって媒介される。主要なASMアセチルコリン受容体はそれぞれ、G、I / OおよびGqと共役受容体であるムスカリンM2およびM3です。
ここでは、マウス気管リングの分離とその収縮出力のin vitroで測定するためのプロトコルを提示します。含まれているのは、機器構成、気管リングの分離と収縮の測定値の説明です。例は、電位依存性カルシウム流入（1。高K +、 図1）をアクティブにするためにASM筋の脱分極によって直接神経の高カリウム刺激を使用して間接的に収縮を喚起するために与えられている。さらに、メソッドは電場刺激（2。EFSは、 図1）を使用して、神経の刺激のみの場合、またはお風呂（3。外因性のACH、 図1）に適用される外因性の神経伝達物質を使用してASMの筋肉の直接刺激のために提示されています。このFLE準備のxibilityと使いやすさは、単離された気管リングモデルの気道平滑筋収縮に関与するシグナル伝達カスケードの数の堅牢かつ機能的アッセイをレンダリングします。
Protocol
1。機器
収縮測定装置の主要コンポーネント）は、 図2Aに概略的に示されています。
- 組織浴。組織風呂は暖かい温度で酸素生理的溶液を保持しています。マウス気管リングのために、私たちは変化のためにバブルの酸素（95％/ 5％O 2 / CO 2混合物）と、入口と出口ポートへの温暖化の解決策、フリットガラスの入口を循環させるウォータージャケットを含む10 mlの組織浴を使用ソリューションを提供しています。貯水池のPSS溶液を37℃のウォーターバス（図示せず）の95％/ 10％O 2 / CO 2混合物の一定のバブルと一緒に格納されます。溶液の交換のために、PSS溶液は比較的高速溶液交換を可能にするために毎分約100 MLSで組織風呂の入口（下のポート）にタンクから圧送される。ソリューションのコンセントは、組織のバットに一定体積を（〜10ml）を可能にオーバーフローポート（上部ポート）を介してソリューション交換時の時間。我々は、組織風呂ジャケット（37°Cを維持するために）を介して温水を送り出すハーケ加熱サーキュレータを使用しています。組織浴は、サプライヤーの数から得られたと研究者の実験的なニーズに合わせてサイズと様々なスタイルで来ることができます。
- 力変換器。等尺性張力を測定するためには、気管チューブは2つのステンレス鋼棒（ 図2A）のL字型の両端にスレッド化されている。ケアは、生物学的物質と互換性のあるステンレススチールタイプを使用するように注意する必要があります。トップロッドは等尺性力変換器にクリップを介して接続されている。下の棒は、固定位置での気管を保持し、受動的緊張および/または筋肉の長さ調整用マイクロメータに搭載されている。気管の収縮は、プリアンプで電圧信号に変換される力変換器、張力を作成します。下の棒は、2つの長方形の白金板（離れて4ミリメートル）tを含むように構成することができ帽子脇腹気管（ 図2B）。プラチナプレートが気管にかかる電界の配信を可能にするグラスS88刺激に配線されています。オープンワイヤとはんだは、浴溶液中に金属の浸出を防止するために、Sylgard（Sylgard 184シリコーンエラストマーは、ダウコーニング社、ミッドランド、MI）でコーティングされています。
- A / Dコンバータ、コンピュータと収集ソフトウェア。プリアンプからの信号はMacLab 8 / Dシステム上に記録されます。これは、現在のADInstrument Powerlabハードウェアの旧バージョンです。我々は、実験を通して緊張の連続記録を可能にするプログラムチャート（ADInstruments）を使用します。気管筋の緊張の生成が非常に遅いため、我々は毎秒100ポイントのその買収は、十分な見つけることができます。張力測定は、各実験前に既知の重みを（最大5グラム）を使用して校正されています。同様のシステムは、他のベンダー（例えば、BIOPAC、GW·インスツルメンツ）から入手できます。
- 組織の分離の前に力変換器は、既知の重みで較正されており、組織浴（表Iを参照）、通常のPSSで満たされている。空気取り入れ口は、O 2 / CO 2の光ストリームを取得するように調整されます。
- 2ヶ月またはそれ以上の年齢のマウスから気管に最適です。若い動物が使用されますが、これらから得られた気管が大きいスキルはサイズが小さいための力変換器の配線上にマウントするために必要となることがあります。解剖する前に、マウスを深くイソフルランで鎮静されています。鉗子とつま先ピンチが応答を引き出すことができないとき鎮静の適切なレベルに達しています。マウスはすぐに頸椎脱臼により屠殺されている重要な注意：私たちはAVERTIN（トリブロモエタノール）は、一般的にマウスで使用される鎮静剤は、気道平滑筋に強い弛緩作用を有するため、気管収縮研究のために使用すべきではないことを観察した。
- 皮膚（と毛皮）が胸部から喉に削除されます。 RIBSは、心臓の上部に（両側で）横方向に、胸骨の付け根から切断されています。胸骨と肋骨は、心臓/肺、胸腺、気管（腹）と食道（ - と気管の背側に接続されている）明らかにするために喉を楽しみにプルアップされています。
- 気管、気管支分岐の下咽頭、上記切断して摘出しています。気管は、氷冷酸素（95/5）PSS溶液（表Iに与えられた組成物）に配置されます。
- 気管周囲の組織のクリーン解剖されています。清掃時には、気管が咽頭、または分岐以下保持することができます。しかし、注意が直接気管自体に鉗子を適用しないように注意する必要があります。ファインはさみは、周囲の組織を切断するために使用されるかもしれませんが、カットは常に損傷を避けるために、気管に平行になされるべきである。気管の準備がSylgardコーティングディッシュ（Sylgard 184シリコーンに分岐下咽頭上固定されている場合は、この手順のこの部分が促進されるエラストマーは、ダウコーニング社、ミッドランド、MI）。
- 周囲の組織を除去した後、気管は、咽頭の下に、気管支分岐上にカットされ、ゆっくりと力変換器の配線に取り付けられた。
- 気管は2つのL字型の金属製プロング（ 図2A）上でスレッド化されている。一芯は、等尺性張力を連続的に記録するための力 - 変位変換器に接続されています。別のプロングは、マイクロメータに接続されています。組織浴をして気管がPSSに浸漬されるように発生します。気管の取り付けは、気管がPSSの外側に保持される時間を最小限に抑えるためにできるだけ早く行う必要があります。練習すれば、気管の取り付けは、1分以内に行われますが、我々は一般的に生存率の低下を避けるために3分以上時間を避けることができます。
- マイクロメータをゆっくり〜10 MN（〜1グラムフォース）の受動的張力を得るために調整されます。最適な静止張力経験的に決定され、我々は〜5の受動的張力を発見した - 1高カリウム刺激に相当する、最大応答の0 MNの結果。これは、この範囲16,17,18の受動張力を利用する他の多くの研究と一致しています。最初の5〜10分かけて、気管受動的張力は（応力緩和現象）やや減少する傾向があり、マイクロメータは、平衡時に〜10 MNへの受動的張力を調整するために使用されます。気管は、実験課題を前に、少なくとも1時間平衡化させています。
3。高カリウム刺激
以下の平衡化は、気管は、高カリウムPSS溶液（67 mMのKClを、表I）で二回挑戦しています。収縮は、一般的に組織浴を完全に気管を緩和するために通常のPSSで数回洗浄される定常状態のその時点で到達するために5〜10分かかります。再現性の収縮が得られるまでカリウム収縮は二度目を繰り返し、三回目（必要に応じて）されています。
気管は、準備に電界刺激（EFS）を可能にする2つの長方形の白金板（電極）で挟まれています。 EFSに対する収縮応答は、周波数と電圧の関数です。それはまた、電極の面積とそれらの間の距離などの物理的パラメータの影響を受けています。刺激の電力特性も高い電圧と電流出力で刺激が最大に達することができるような応答に影響を与えます。すべてのEFSファイルシステムの特性が異なる刺激持続時間、周波数、電圧、パルス持続時間で筋肉収縮反応を調べることによって決定されるべきである。私たちの実験のために、私たちは〜4ミリメートルで区切られた電極、および44 V（0.5ミリ秒のパルス）と30 Hzの刺激振幅が再現性に近い最大収縮反応を達成するために最適であることを発見した。
5。収縮のEVコリン作動性刺激によるoked
外因的に適用された化合物への気管の応答は、累積投与量ファッションの薬物の複数添加することによって、関心のある薬剤の単回投与の追加のいずれかによって評価されるか。気管では、我々の研究室では定期的にアセチルコリンとは違って、カルバコールはアセチルコリンエステラーゼによって分解されない、ので、コリン作動性受容体を活性化するカルバコールを使用していました。合理的な用量-反応の範囲は10 -8から10 -5 Mカルバコールすることです。ログのフィッティングヒル型の方程式で[カルバコール] -収縮反応曲線は、コリン作動薬19〜気管収縮の感受性の指標であるEC 50（半最大有効濃度）を推定することができます。それはカルバコールの投与量は累積用量応答曲線の一部としてより単回投与としてわずかに大きい応答を与えることは注目に値する。
6。代表的な結果高カリウムに対する収縮反応の例を図3Aに示されています。収縮は約10分以内に最大値に達するが、その後わずかに減少が表示される場合があります。高カリウムの早期洗い出しの間に、筋肉は、溶液系における非加熱PSS溶液を少しボリュームが一時的に準備をperfusesような温度の低下によるものである収縮の一過性増加を示すことがあります。これは、加熱されたPSS貯留と組織浴を接続するチューブの最小デッドボリュームを有することにより、また（一般的に我々は100ミリリットル/分で解決策をポンプ）比較的迅速にソリューションを交換することによって最小限に抑えることができます。各製剤は、筋肉の質量や解剖中に発生した損傷の違いによる収縮反応に若干の違いがあります。 図3Bは、高カリウムとカルバコールでチャレンジ別の筋肉量の2気管を示しています。コリン作動性誘発収縮は異なりますが、yは正規化後の高カリウム溶液（ 図3C）の応答に似ています。
図4は、単回投与（A）および累積増加（B）を使用して、カルバコール（コリン作動性）誘発収縮の例を示します。カルバコールのソリューションは、お風呂に直接添加し、泡立たガスが急速に混合するのに役立ちますしています。その単回投与の追加（すなわち、1μM、 図4A）は、累積用量-反応曲線（1μM、 図4B）間に相当する濃度よりも僅かに大きい応答を持って注目に値します。 図4Cは、収縮力のプロットを示しています。 図4Bからのデータを使用してカルバコール濃度の関数として。カルバコールの効果は、10 -5 Mの濃度で飽和します。コリン作動性アゴニストはカルシウム放出機構を介して収縮を開始したものの、収縮の実質的な成分は、また、脱分極によって媒介されると電位依存性カルシウムチャネル20の活性化。
図5Aは、EFS-誘発収縮の例を示します。気管は収縮がプラトーに（挿入図A1を参照）に到達するまで0.5ミリ秒の期間は、40ボルトのパルスを用いて刺激される。刺激頻度の増加は、増加し収縮応答（周波数応答曲線を図5Bにプロットされている）が発生します。電場刺激はシナプス前神経を活性化することにより主に収縮を引き起こすことが示されている。これは、ボツリヌス毒素、気管21のEFS誘発収縮の大部分を遮断する神経伝達物質放出のブロッカーの効果によって証明されています。さらに、テトロドトキシンは、エージェントのブロックのNa +チャネルは、神経活動を抑制し、EFSに気管の応答を排除すること。
図1：tの図彼は孤立した気管の準備のシグナル伝達経路を専攻しています。気管平滑筋細胞を神経支配するコリン作動性軸索端末が示されている。主要なシグナル伝達経路は、IP3受容体（M3）とcAMPの減少（M2）を介してカルシウム放出を引き起こすM3とM2-ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化（mACHR）です。 M2受容体（とM3受容体のいくつかの貢献）もL-型電位依存性カルシウムチャネルとカルシウム流入を活性化するコリン作動性誘発脱分極を引き起こす。一般的な収縮エージェントとそのエフェクターは1です。高カリウム（平滑筋細胞およびコリン作動性軸索脱分極）、2。電場刺激（EFS、コリン作動性軸索を脱分極）、3。そのようなアセチルコリンやカルバコール（直接ムスカリン受容体を活性化する）などのコリン作動性薬剤の外因性のアプリケーションです。
図2：気管収縮を測定するために使用される装置のダイアグラム。 A.力変換器、マイクロメーター及び組織浴をねじクランプを介してロッドを支援する上に搭載されている。気管リングは上部と下部ロッドに縫い込まれています。図では、組織浴を準備（力変換器に気管のマウント時にIE）の下に配置されています。収縮の研究中に、組織浴の準備を浴びるように垂直に移動されます。 B.は、電界刺激のための下部ロッドは気管保持線に横方向にマウントされている2本の白金板を含むように変更されています。白金板は、刺激への電気配線によって接続されています。
図3高カリウムの例（67 mM）の気管の収縮反応。 （）高カリウムに重複し、再現性のある応答を示しています。 （B）2つの異なる気管のカルバコールに対する収縮応答の例。正規化したときに（C）Bの気管への対応は似ています高カリウム応答にd。
図4。カルバコール誘発性収縮の例。 （A）単回投与を用いてカルバコール誘発収縮はウォッシュアウトが続く。 Aの気管（C）Bからピークの収縮のために（B）の例の累積用量 - 反応曲線は、カルバコール濃度の関数としてプロットされています。
図5電場刺激により誘発される収縮の例。 （A）に示すよう気管収縮の電界刺激が0.5 msパルス、40ボルト、様々な刺激の周波数を使用します。はめ込みは、30 Hzの時間拡張収縮です。 （B）からのピーク収縮がplotteです。刺激周波数の関数としてD。
通常のPSS
| 塩 | 濃（MM） | 量（g / 2 L） |
| NaClを | 119 | 13.91 |
| 塩化カリウム | 4.7 | 0.7 |
| KH 2 PO 4 | 1.18 | 0.32 |
| MgSO 4を X 7H 2 O | 1.17 | 0.58 |
| NaHCO 3を | 18 | 3.02 |
| EDTA | 0.026 | 0.5 M 0.1 mlの |
| グルコース | 11 | 3.96 |
| スクロース | 12.5 | 8.56 |
| CaCl 2を | 2 | 10mMの400ミリリットル |
高K + PSS（NAClとKClの調整）
| 塩 | 濃（MM） | 量（g / 2 L） |
| NaClを | 56.7 | 6.628 |
| 塩化カリウム | 67 | 9.991 |
。PSSソリューションについては、 表1レシピ注 ：ソリューションは、高純度の品質の水で、毎週新鮮行われ、成長を汚染を避けるために5日を超えないために冷蔵庫に保存されています。
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Discussion
ここで紹介するプロトコルは、気道の筋肉の機能を評価するための生理的な製剤を提供する。我々は、一般的に、同時に3月4日、臓器の浴用の調製品を動作させるしかし、事前にパッケージ化されたシステムは、8製剤（ADInstruments、世界の精密機器、ハーバード装置）までの同時測定を可能にするサプライヤーの数から利用可能です。我々は同等の結果と力変換器および組織器官浴の番号を利用しています。しかし、我々は電界刺激は刺激電極サイズ、電極板との間の距離と、電界内での準備の位置との間のわずかな違いに基づいて、いくつかの変動性を提供することを見つける。したがって、余分なケアが可能な限り同じフィールド電極を作るために行われるべきである。
等尺性力測定で最も重要なパラメータの一つは、筋肉量の変動を補償するために正規化収縮の問題であるか、別の準備の間に筋肉組織の健康。の部分では、違いが類似した年齢と同じ性別（雌マウスは減少気管の張力を生成する傾向がある）の動物を比較することによって最小限に抑えることができます。さらに、我々は、気管への正規化湿潤または乾燥重量は、マウス気管のサイズが小さいことが原因である可能性が十分な精度を欠いていることを発見した。むしろ、複数の、高カリウム、収縮の使用は非常に有利である。高カリウム収縮は2つの目的があります。高カリウム収縮は、気管の筋肉を "目覚め"に表示され、収縮は、実験課題に進む前に、再現性があることを保証します。高カリウム収縮はまた準備中に存在するアクティブな筋肉量の正確な正規化であると思われる。したがって、実験的な張力の測定は、しばしば高カリウム収縮に正規化する力として表現されています。さらに、製剤の品質は、高カリウム誘発性のコントラクトを使用して評価することができますイオン。 10週齢のC57BL/6J雄マウス20の高カリウム誘発性収縮±3.8 MN（±標準偏差は、n = 17を意味する）がある - 例えば、私たちは8がわかります。も、この範囲を下回る気管の準備契約の場合（12 Mnまたは2標準偏差以下に以下を意味する）、それは一般的に "損傷"と実験のために利用していないと見なされます。また、飽和コリン作動性アゴニストの最大張力張力の正規化を使用することができます。これはアゴニストへの感受性の変化を観察するのに便利ですが、最大収縮に影響を与える変更を見落とす可能性があります。
メソッドは、収縮コリン作動薬を使用するか、電気刺激とのいずれかをアクティブにするために提示された。組織浴にコリン作動性アゴニストアプリケーションが直接平滑筋を活性化する。対照的に、適度なEFS刺激周波数で（最大25 Hz）の収縮の大部分は、神経の活性化とneurotransmiの放出を介して媒介されるtter 22。したがって、調査官は、EFSの刺激を用いたシナプス/神経介在性収縮に影響を与える薬剤を調査する機会を持っています。最後に、研究はそのような肥満細胞23、上皮細胞24は、また摘出気管製剤中の収縮に影響を与えるような他の細胞型を示します。したがって、in vitroでマウス気管製剤中の気道平滑筋収縮に影響を及ぼす細胞の種類の数のための堅牢な機能的なアッセイを提供する。
要約すると、 試験管内気管の準備でマウスは気道機能に影響を及ぼす遺伝的変異の解析に特に有用であった。いくつかの例は、イオンチャネル17,20,25,26、代謝受容体27,28,29,30の遺伝子ノックアウトの解析が含まれており、下流のカスケード31に信号を送る 。 in vitroで 32に加えて、抗原チャレンジマウスが頻繁に喘息の研究に使用されます気管の準備は喘息、以下の開発をすさまじい収縮性の変化のために有用なアッセイを提供する。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、気道疾患、NINDS助成金（NS052574）の予防と治療におけるイノベーションセンターからの助成金によって賄われ、喘息の研究のためのサンドラー·プログラムからされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analogue-Digital Converter |  ADInstruments |
PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C) |
| Charting Software | ADInstrtuments |
LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
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