Summary
형질 전환 생쥐는 유전자로 생리 기능을 ascribing에서 매우 유용한되었습니다. 일반적으로 같은, 연구하고,기도의 기능적 연구로서 특히, murine 모델 향한 놀라운 변화를받은. 여기에 대한 프로토콜을 제공
Abstract
유전자 변형 및 녹아웃 마우스는 항공 1,2의 생리학과 pathophysiology의 조사를위한 강력한 도구왔다. 격리된 tracheal 준비 시험 관내 tensometry에서기도 부드러운 근육 (ASM) 유전자 변형 생쥐의 수축성 응답의 유용한 분석 것으로 입증되었습니다. 체외 tracheal 준비에 이들은 비교적 간단이며, 강력한 응답을 제공하고, 기능 cholinergic 신경 엔딩과 근육 반응도 긴 incubations 후 양쪽을 유지합니다.
Tracheal tensometry 또한 평활근의 수축에 영향을 미치는 두번째 메신저 신호 경로의 다양성을 공부하는 기능적 분석을 제공합니다. 기도의 수축은 주로 ASM (그림 1)에 아세틸콜린을 공개한다는 parasympathetic, cholinergic 신경에 의해 매개된다. 주요 ASM 아세틸콜린 수용체는 각각 G I / O 및 GQ 결합 수용체입니다 muscarinic M2와 M3입니다
여기 murine tracheal 반지의 절연을위한 프로토콜과 수축성 출력의 체외 측정에서 제시. 포함하는 장비 구성에 대한 설명이며, 호흡 관 링 절연 및 수축성 측정. 예제는 전압 의존 칼슘 유입을 활성화 높은 칼륨 신경의 자극과 직접적으로 ASM 근육의 탈분극하여 사용하여 간접적으로 수축을 evoking 위해 제공됩니다 (1. 높은 K +, 그림 1). 또한, 방법은 전기장 자극을 (2. EFS 그림 1) 외인성 신경 전달 물질을 사용하여 ASM 근육, 또는 직접적인 자극이 목욕탕 (3. 외인성 ACH, 그림 1)에 적용된 사용 혼자 신경 stimulations 위해 제공됩니다. 이 flexibility와 준비의 용이성은 절연 기관 링 모델에게기도 평활근의 수축에 관여 폭포 신호의 숫자를위한 강력하고 기능적인 분석을 렌더링.
Protocol
1. 장비
수축 측정 장치의 주요 구성 요소) 그림 2A에서 간략하게 구조 표시됩니다.
- 조직 욕조가. 조직 욕조는 따뜻한 온도에서 산소 생리 솔루션을 유지 관리합니다. 생쥐기도 고리의 경우, 우리는 온난 화 솔루션 fritted 유리 거품 산소에 유입구 (95 % / 5퍼센트 O 2 / CO 2 혼합)와 유입과 변화를위한 콘센트 포트를 순환을 위해 물 재킷을 포함 10 ML 조직 목욕을 사용 솔루션. 저수지의 PSS 솔루션은 95 % 일정한 기포 37 ° C 물 목욕 (보이지 않음).에서 / 5퍼센트 O 2 / CO 2 혼합과 함께 저장됩니다 솔루션 교환의 경우 PSS 솔루션은 비교적 빠른 솔루션의 교환을 허용하도록 저수지에서 약 100 MLS 분당에서 조직 목욕탕 입구 (하단 포트)로 펌핑된다. 솔루션 콘센트는 조직 배트에 일정한 볼륨 (~ 10 ml) 쇼핑있게 오버플 포트 (상단 포트)를 통해서솔루션 교환시 H. 우리는 (37 ° C를 유지하기 위하여) 조직 목욕 자켓을 통해 온수를 공급 Haake 가열 순환 장치를 사용합니다. 조직 온천은 공급 업체의 숫자로부터 얻은 및 수사관의 실험 요구에 맞게 크기와 스타일의 다양한 올 수 있습니다.
- 힘 변환기. 사시 장력을 측정하기 위해서는 기관 튜브는 두 스테인레스 스틸 막대 (그림 2A)의 L-모양의 끝에 걸쳐 스레드됩니다. 치료는 생물 학적 재료와 호환 스테인레스 스틸 유형을 사용하여 촬영해야합니다. 상단 막대는 사시 력 변환기에 클립을 통해 연결되어 있습니다. 아래 막대가 고정 위치에 호흡 관을 보유하고 수동 장력 및 / 또는 근육의 길이 조절을위한 마이크로 미터에 마운트됩니다. 기도의 수축은 preamplifier의 전압 신호로 변환되는 힘 변환기, 대한 긴장을 만듭니다. 아래 막대는 또한 두 직사각형 백금 접시 (간격 4mm) T를 포함하도록 구성되어있을 수 있습니다 모자 측면기도 (그림 2B). 백금 접시는 기관 전체 전기장의 전송을 허용 잔디 S88 자극기로 입금됩니다. 오픈 와이어와 솔더는 목욕 용액에 금속의 침출을 방지하기 위해, Sylgard (Sylgard 184 실리콘 엘라스토머, 다우 코닝 사, 미들랜드, MI)에 입혀져 있습니다.
- A / D 변환기, 컴퓨터 및 인수 소프트웨어. 신호 preamplifiers에서이 MacLab 8 / D 시스템에 기록됩니다. 이것은 현재 ADInstrument Powerlab 하드웨어의 이전 버전입니다. 우리는 실험을하는 동안 긴장의 연속 녹음을 허용 프로그램 차트 (ADInstruments)을 사용합니다. 기도 근육의 장력 세대는 매우 느린이며, 따라서 우리는 초당 100 포인트의 인수가 적합 찾습니다. 장력 측정은 각 실험 전에 알려진 가중치를 (최대 5g)을 사용하여 보정한다. 비슷한 시스템은 다른 venders (예 : BioPac, GW 스트 루먼트)에서 사용할 수 있습니다.
- 조직 분리하기 전에 힘 변환기는 알려진 아령으로 보정하고, 조직 목욕이 (내가 표 참조) 정상 PSS으로 가득합니다. 공기 유입구는 O 2 / CO 2의 빛을 스트림을 얻기 위해 조정됩니다.
- 이개월 세 이상의 생쥐의 Tracheas이 최적입니다. 어린 동물이 사용되지만 이들로부터 얻은 tracheas가 큰 스킬 때문에 그들의 작은 크기의 힘 변환기 와이어에 마운트하도록 요구받을 수도 있습니다. 해부하기 전에, 마우스는 깊이 isoflurane으로 마취합니다. 포셉과 발가락 - 핀치는 반응을 유도 수 없을 때 진정 작용의 적절한 수준에 도달하고 있습니다. 마우스가 즉시 경추 탈구에 의해 희생되는 중요 사항은 :. 우리는 Avertin (Tribromoethanol)는, 일반적으로 생쥐에 사용되는 진정제는기도 평활근에 대한 강력한 이완 효과를 가지고 있으며, 따라서기도의 수축 연구에 사용해서는 안된다는 관찰했습니다.
- 피부 (및 모피)은 흉부에서 목에 제거됩니다. RIBS는 흉골의 기지에서 laterally (양면) 심장의 정상에 버렸어요. 흉골과 늑골 그러면 심장 / 폐, thymus, 호흡 관 (복부)과 식도를 (-과기도로 지느러미에 붙어) 표시하는 방법으로 목을 앞으로 가져온됩니다.
- 기도는 기관지 분기점 아래와 인두 위의 절단에 의해 excised됩니다. 기도는 얼음처럼 차가운 산소 (95 / 5) PSS 용액 (표 I에서 주어진 조성)에 배치됩니다.
- 호흡 관은 주변 조직의 깨끗한를 해부한다. 청소하는 동안 기관은 인두 혹은 분기점 아래 개최됩니다. 그러나,주의는 직접적으로기도 자체에 포셉을 적용하지 않기로 이동해야합니다. 좋은 가위는 주변 조직을 잘라하는 데 사용될 수 있지만, 상처는 항상 손상을 방지하기 위해 기관 평행하여야한다. 기도 준비가 Sylgard - 코팅 접시에 분기점 아래와 인두 위의 고정된 경우 프로 시저의이 부분은 (Sylgard 184 실리콘 용이합니다엘라스토머, 다우 코닝 사, 미들랜드, MI).
- 주변 조직을 제거 후, 호흡 관이 인두 아래와 기관지 분기 위의 절단하고 부드럽게 힘 변환기 와이어에 장착된.
- 호흡 관은 두 개의 L 자형 금속 접지 단자 (그림 2A)를 통해 스레드됩니다. 하나의 접지 단자가 사시 긴장의 연속 녹음 힘 - 변위 변환기에 연결됩니다. 또 다른 접지 단자가 마이크로 미터에 연결되어 있습니다. 조직 목욕탕 그러면기도가 PSS에 잠겨 있도록 증가합니다. 기도의 장착은 호흡 관은 PSS 밖에서 개최되는 시간을 최소화하기 위해 최대한 빨리 완료되어야합니다. 연습을 통해 기관의 장착은 한 분 내로 다하지만 우리는 일반적으로 생존의 손실을 피하기 위해 배 이상 삼분 이상 피할 수 있습니다.
- 마이크로 미터는 천천히 ~ 10 MN (~ 1 그람 력)의 수동 장력을 얻기 위해 조정됩니다. 최적의 휴식 긴장감을 경험적으로 결정되었고 우리는 ~ 5의 수동 장력 발견 - 1높은 칼륨 자극에 상응하는, 최대한의 반응에 0 MN 결과입니다. 이것은이 범위 16,17,18의 수동적인 긴장을 활용할 다른 연구의 번호와 일치합니다. 첫 5-10분이 지남에기도 수동적 장력은 다소 거절 (응력 이완 현상)와 마이크로 미터는 평균시 ~ 10 MN에 수동 장력을 조정하는 데 사용되는 경향이있다. 호흡 관은 실험적인 도전을하기 전에 최소한 1 시간 동안 평형 수 있습니다.
3. 높은 칼륨 자극
같은 평형은 호흡 관은 높은 칼륨의 PSS 용액 (67 MM KCl, 표 I)와 함께 두 번 도전한다. 수축은 일반적으로 조직 목욕 완전히 호흡 관을 이완시키는 일반적인 PSS와 함께 여러 번 씻어서되어 정상 상태 어느 시점에 도달 ~ 5-10분이 필요합니다. 칼륨 수축은 두 번 반복하고, 재현성 수축까지 세 번째는 (필요한 경우)를 얻을 수 있습니다.
호흡 관은 준비에 전기장 자극 (EFS)를 허용 두 직사각형 백금 접시 (전극)의 어귀됩니다. EFS에 대한 수축성 반응은 주파수 및 전압의 함수입니다. 그것은 또한 전극의 면적과 그들 사이의 거리와 같은 물리적 매개 변수에 의해 영향을받습니다. 자극기의 전원 특성은 또한 높은 전압과 전류 출력에 자극기가 최대에 도달할 수 있도록 응답에 영향을 미칩니다. 모든 EFS 시스템의 특징은 자극 기간이, 주파수, 전압 및 펄스 기간이 서로 다른시 근육 수축성 반응을 검토하여 결정하여야한다. 우리의 실험적인 설정을 위해서는 ~ 4mm로 구분하여 전극, 44 V (0.5 MS 펄스) 30 Hz의 자극 진폭이 재현할 거의 최대한의 수축성 반응을 달성하기 위하여 최적있는 것으로 나타났습니다.
5. 수축 에버스먼Cholinergic 자극에 의해 oked
exogenously 적용 화합물에 대한기도의 응답 속도는 누적 선량 방식으로 약물의 복합 첨가하여 관심있는 약물의 단일 복용의 추가로 중 평가를하거나합니다. 기도 내용은 저희 연구실은 정기적으로 아세틸콜린 달리 carbachol은 acetylcholinesterase에 의해 저하된 아니라, 때문에 cholinergic 수용체를 활성화 carbachol를 사용했습니다. 합리적인 선량 - 반응 범위가 10 -8에서 10 -5 M carbachol에있다. 로그 있으 힐 타입의 방정식과 [carbachol]-수축성 반응 곡선은 cholinergic 작용제 19 tracheal 수축의 감성을 측정하기위한 한 방법입니다 EC 50 (반 최대한의 효과적인 농도)의 추정이 가능합니다. 그것은 carbachol의 주어진 복용이 누적 선량 반응 곡선의 일환으로보다 단일 복용과 같은 약간 큰 응답을 줄 것이다 협조할 것입니다.
6. 대표 결과 높은 칼륨의 수축성 응답의 예제는 그림 3A에 표시됩니다. 수축은 약 10 분 이내에 최대에 도달하지만, 그 이후 작은 하락을 보여주 수도 있습니다. 높은 칼륨의 초반 막가는 인생 동안 근육이 솔루션 라인에 unheated PSS 솔루션의 작은 볼륨 transiently 준비를 perfuses로의 온도 강하에 의한 수축에 과도 증가를 보여줄 수 있습니다. 이것은 온수 PSS 저장조 및 조직 목욕을 연결 튜브의 최소 죽은 볼륨을함으로써 최소화하며 비교적 신속하게 솔루션을 교환하여 (일반적으로 우리는 ML / 분 100으로 솔루션을 펌프) 할 수 있습니다. 각각의 준비는 근육량이나 절개 중에 발생한 손상의 차이로 인해 수축성 반응에 약간 차이가납니다. 그림 3B 높은 칼륨과 carbachol 맡고 다른 근육 질량의 두 tracheas를 보여줍니다. cholinergic-evoked 수축이 다를 수 있지만,y는 정상화 이후 높은 칼륨 용액 (그림 3C)와 응답과 비슷합니다.
그림 4는 단일 복용 () 및 누적 증가 (B)를 사용 carbachol (cholinergic) evoked 수축의 예를 보여줍니다. carbachol 솔루션은 목욕탕에 직접 추가되고 부풀어 오른 가스 신속한 혼합에 도움이됩니다. 단일 복용 (예 : 1 μm의 그림 4A)의 추가 협조할 누적 선량 - 반응 곡선 (1 μm의 그림 4B) 동안 이에 상응하는 농도보다 약간 큰 반응이 그것이다. 그림 4C는 수축 부대의 음모를 보여준다 그림 4B의 데이터를 사용 carbachol 농도의 함수로. carbachol의 영향은 10 -5 M 농도로 포화시키다. cholinergic agonists는 칼슘 릴리스 메커니즘을 통해 수축을 시작했지만, 수축의 실질적인 구성 요소는 탈분극에 의해 중재되고전압 의존 칼슘 채널 활성화 20.
그림 5A는 EFS-evoked 수축의 예를 보여줍니다. Tracheas은 수축 고원을 (삽입된 페이지 A1 참조)에 도달할 때까지 0.5 밀리초 기간, 40 볼트의 펄스를 사용하여 자극하고 있습니다. 자극 주파수에있는 증가는 증가 수축성 응답 (주파수 응답 곡선은 그림 5B에 꾸몄다되는)을 일으 킵니다. 전기장 자극은 presynaptic 신경을 활성화하여 주로 수축 연상을 보여줘왔다. 이것은 보톨리누스, 기관 21 EFS-evoked 수축의 대부분을 차단 신경 전달 물질 방출의 차단 효과에 의해 입증된다. 또한, 테트로도톡신, 블록 나 + 채널은 또한 신경 활동을 억제 및 EFS에 대한기도의 응답을 제거하는 요원.
그림 1. 전술 다이어그램그는 고립된기도 준비에서 신호 전달 경로를 전공. 표시된 것은 tracheal 평활근 세포를 innervating cholinergic 축삭 단자입니다. 주요 신호 경로는 IP3 수용체 (M3)와 캠프의 감소 (M2)를 통해 칼슘 방출을 일으킬 M3 및 M2-muscarinic 아세틸콜린 수용체 활성화 (mACHR)입니다. M2 수용체 (그리고 M3 수용체의 일부 기여)도 L-타입 전압 의존 칼슘 채널과 칼슘 유입을 활성화 cholinergic-evoked 탈분극의 원인이됩니다. 일반 수축성 대리인 및 그 effectors은 1입니다. 높은 칼륨 (평활근 세포와 cholinergic의 축삭 depolarize), 2. 전기장 자극 (EFS, cholinergic 축삭을 depolarizes) 및 3. 이러한 아세틸콜린이나 carbachol 같은 cholinergic 에이전트의 외인성 신청서 (직접 muscarinic 수용체를 활성화).
그림 2. tracheal 수축을 측정하는 데 사용되는 장비의 다이어그램. A. 힘 변환기, 마이크로 미터 및 조직 목욕은 나사 클램프를 통해 봉을 지원에 마운트됩니다. tracheal 고리는 상단과 하단 봉을 통해 스레드됩니다. 다이어그램에서 조직 목욕은 (힘 변환기에 호흡 관으로 장착하는 동안 IE)를 준비 아래에 위치하고 있습니다. 수축 과정 동안 조직 목욕은 준비 목욕을 수직으로 이동합니다. 전기장 자극 하단 봉의 경우 B.는 기관의 지주 와이어로 laterally 마운트된 두 개의 백금 판을 포함하도록 수정됩니다. 백금 접시는 자극기로 전기 배선으로 연결됩니다.
그림 3. 높은 칼륨의 예 (67 ㎜)기도의 수축성 반응. (A) 높은 칼륨에 대한 중복, 재현성 응답을 보여줍니다. (B) 두 가지 tracheas의 carbachol에 수축성 반응의 예. 정상화되면 (C) B의 tracheas에 응답 유사높은 칼륨 대응 라.
그림 4. carbachol 유도된 수축의 예. () 단일 썼다 Carbachol 유도된 수축이 막가는 인생으로 따라갔다. A.의기도 (C) B에서 피크의 수축을위한 (B) 예 누적 선량 - 반응 곡선은 carbachol 농도의 함수로 꾸몄다됩니다.
그림 5. 전기장 자극에 의해 evoked 수축의 예. 0.5 MS 펄스, 40 볼트, 다양한 자극 주파수를 사용하여기도의 수축 () 전기장 자극은 지적했다. 삽입된 페이지 30 Hz에서에서 시간을 확장 수축입니다. (B)에서 피크 수축이 plotte 있습니다자극 주파수의 함수로 라.
일반 PSS
| 소금 | Conc. (㎜) | 금액 (G / 2 패) |
| NaCl | 119 | 13.91 |
| KCl | 4.7 | 0.7 |
| KH 2 PO 4 | 1.18 | 0.32 |
| MgSO 4 X 7H 2 O | 1.17 | 0.58 |
| NaHCO 3 | 18 | 3.02 |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 0.026 | 0.5 M의 0.1 ML |
| 포도당 | 11 | 3.96 |
| 자당 | 12.5 | 8.56 |
| CaCl 2 | 2 | 10 MM 400 ML |
하이 K + PSS (NAC리터와 KCl 조정)
| 소금 | Conc. (㎜) | 금액 (G / 2 패) |
| NaCl | 56.7 | 6.628 |
| KCl | 67 | 9.991 |
. PSS 솔루션에 대한 표 1 레시피 참고 :. 솔루션은 ultrapure 품질 물로, 매주 신선한 만들어진, 그리고 성장 오염을 막기 위해 오일보다 더 이상 위해 냉장고에 저장됩니다.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은기도 근육의 기능을 평가하는 생리적 준비를 제공합니다. 우리는 일반적으로 동시에 3-4 장기 목욕 준비를 운영하지만, prepackaged 시스템은 8 준비 (ADInstruments, 세계 정밀 계측기, 그리고 하버드 장치)까지 동시 측정을 허용 공급 업체에서 제공합니다. 우리는 이에 상응하는 결과를 강제로 트랜스 듀서 및 조직 장기 온천의 번호를 이용했습니다. 그러나 전기장 자극은 자극 전극 크기, 전극 판 사이의 거리, 그리고 전기장 내에서 준비의 위치 사이에 약간의 차이를 기준으로 일부 다양성을 제공 찾으십시오. 따라서 별도의주의가 가능한 유사한 필드 전극을 만들기 위해 수행되어야한다.
사시 힘 측정에서 가장 중요한 변수 중 하나는 근육 질량의 변화에 대한 보상하기 위해 수축을 정상화의 문제, 또는다른 준비를 사이에 근육 조직의 건강. 부분에서 차이점과 비슷한 연령과 같은 성별 (암 생쥐가 축소기도 장력을 발생하는 경향)의 동물을 비교하여 최소화 할 수 있습니다. 더 나아가, 우리는기도 습식 건조 중량으로 정상화 마우스 호흡 관의 작은 크기로 인해 충분한 정밀도를, 부족 것으로 나타났습니다. 오히려, 다중, 높은 칼륨, 수축의 사용은 매우 유리합니다. 높은 칼륨 수축이 두 가지 용도를 제공하고 있습니다. 높은 칼륨의 수축은 tracheal 근육을 "각성"로 나타나며 수축 실험적인 도전하기 전에 재현할 수 있다고 보장합니다. 높은 칼륨의 수축도 준비에 존재 활성 근육 질량에 대한 정확한 정상화 될 것으로 보입니다. 따라서 실험 장력 측정은 종종 높은 칼륨의 수축을 정상화 무력으로 표현됩니다. 또한, 준비의 품질은 높은 칼륨 유발 계약을 사용하여 계산될 수이온. 10주 오래된 C57BL/6J 남성 마우스 20 높은 칼륨 유도된 수축 ± 3.8 MN을 (± 표준 편차, N = 17 의미)이 - 예를 들어, 우리는 8 것을 알게됩니다. 물론이 범위 (12 MN 또는 밑에 두 표준 편차 말은 아래) 아래 기관 준비 계약이, 그때 그것은 일반적으로 실험 활용 '손상된'이 아닌 것으로 간주되는 경우. 또는 포화 cholinergic 작용제의 최대 장력에 긴장 정상화를 사용할 수 있습니다. 이것은 작용제에 대한 민감도의 변화를 관찰하는 데 유용하지만, 그 효과를 최대 수축을 변화를 놓칠 수도 있습니다.
방법은 cholinergic 작용제 또는 전기 자극으로 사용하여 두 수축을 활성화하기 위해 제시되었다. 조직 목욕 Cholinergic 작용제 응용 프로그램이 직접 부드러운 근육을 활성화한다. 반면, 중간 EFS의 자극 주파수와 함께 (최대 25 Hz에서) 수축의 대부분은 신경 활성화 및 neurotransmi의 출시를 통해 매개된다tter 22. 따라서 조사 원은 EFS의 자극을 사용하여 presynaptic / 신경 매개 수축에 영향을 미치는 요원을 조사할 수있는 기회를 가지고 있습니다. 마지막으로, 연구는 24도 고립된기도 준비에 수축성에 영향을 마스트 세포 23, 그리고 상피 세포 등 다른 세포 유형을 나타냅니다. 따라서 체외 마우스기도의 준비는기도 평활근의 수축성에 영향을 미치는 세포 유형의 번호 강력한 기능 분석을 제공합니다.
요약에서 체외기도 준비에서 마우스가기도 기능에 영향을 미치는 유전자 변이의 분석에 특히 유용하다. 몇 가지 예를 이온 채널 17,20,25,26, 27,28,29,30 metabotropic 수용체의 유전자 knockouts의 분석을 포함하고, 하류 폭포 31 신호. 체외에서 32와 더불어, 항원 도전 마우스가 자주 천식 연구를 위해 사용됩니다기도 준비는 천식의 다음 발전을 ensues 수축성의 변화에 대한 유용한 분석을 제공합니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 예방에서 혁신 센터와기도 질환, NINDS 교부금 (NS052574)의 치료에서와 천식 연구 샌들러 프로그램에서 교부금에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analogue-Digital Converter |  ADInstruments |
PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C) |
| Charting Software | ADInstrtuments |
LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
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