Summary
Transgene mus har vært svært nyttig i tillegge fysiologiske funksjon til gener. Som sådan, forskning generelt, og funksjonelle studier av luftveier, spesielt, har gjennomgått en bemerkelsesverdig forskyvning mot murine modeller. Her gir vi protokoller for
Abstract
Transgene og knockout mus har vært kraftige verktøy for etterforskningen av fysiologi og patofysiologi av luftveiene 1,2. In vitro tensometry av isolerte tracheal preparater har vist seg å være en nyttig analyse av luftveiene glatt muskulatur (ASM) kontraktile respons på genmodifiserte mus. Disse in vitro tracheal preparater er relativt enkel, gir en robust respons, og beholde både funksjonelle kolinerge nerveender og muskel respons, selv etter lang Inkuberinger.
Tracheal tensometry gir også en funksjonell analyse for å studere en rekke andre messenger signalveier som påvirker sammentrekning av glatt muskulatur. Sammentrekning i luftrøret er hovedsakelig mediert av parasympatiske og kolinerge nerver som utløser acetylkolin på ASM (figur 1). De store ASM acetylkolinreseptorer er muskarin M2 og M3 som er G i / o og GQ koblede reseptorer, henholdsvis
Her presenterer vi protokoller for isolering av murine tracheal ringer og in vitro måling av deres kontraktile utgang. Inkludert er beskrivelser av utstyret konfigurasjonen, luftrøret ring isolasjon og kontraktile målinger. Eksempler er gitt for fremkaller sammentrekninger indirekte ved hjelp av høy kalium stimulering av nerver og direkte ved depolarisering av ASM muskler for å aktivere spenning avhengig kalsium innstrømning (1. Høy K +, Figur 1). I tillegg er metodene som presenteres for stimuleringer av nerver alene ved hjelp av elektrisk felt stimulering (to. EFS, figur 1), eller for direkte stimulering av ASM muskel bruker eksogene nevrotransmitter brukes på bad (3. Eksogene ACH, en figur). Dette FLExibility og enkel tilberedning gjør det isolerte luftrøret ringen modell en robust og funksjonell analyse for en rekke av signalanlegg kaskader involvert i luftveiene glatt muskel sammentrekning.
Protocol
1. Utstyr
De viktigste komponentene i en sammentrekning måleenhet er vist skjematisk i figur 2A).
- En vev bad. Vevet badet opprettholder en oksygenrikt fysiologisk løsning på varm temperatur. For mus trachea ringer, bruker vi en 10 ml vev bad som inneholder en vannkappe for sirkulerer en oppvarming løsning, en fritted glass innløpet til boble oksygen (95% / 5% O 2 / CO 2 blanding) og innløp og utløp porter for endring løsninger. Et reservoar PSS løsning lagres med konstant boblende av 95% / 5% O 2 / CO 2 blandingen i en 37 ° C vannbad (ikke vist). For løsning børsene, er PSS løsning pumpes fra reservoaret til vevet bad innløpet (nederst port) på ca 100 mls per minutt for å tillate relativt rask løsning utveksling. Løsningen utløp er gjennom en overløp port (topp-utgang) som lar konstant volum (~ 10 ml) i vevet balltreh løpet løsning utveksling. Vi bruker en Haake oppvarming sirkulasjonspumpe for å pumpe varmt vann gjennom vevet bad jakke (for å opprettholde 37 ° C). Tissue bad kan fås fra en rekke leverandører og kommer i en rekke størrelser og stiler for å passe de eksperimentelle behov etterforsker.
- En kraft svinger. Å måle isometrisk spenning, er luftrøret røret tres løpet L-formede ender av to rustfrie stenger (figur 2a). Forsiktighet bør tas for å bruke en rustfritt stål type som er kompatibel med biologisk materiale. Den øverste stangen er koblet via et klipp til en isometrisk kraft svinger. Den nederste stangen holder luftrøret på en fast posisjon, og er montert på en mikrometer for justering av passive spenning og / eller muskel lengde. Sammentrekning av luftrør skaper spenning på kraft svinger, som omdannes til en spenning signal på forforsterkeren. Den nederste stangen kan også konfigureres til å omfatte to rektangulære platina plater (4 mm fra hverandre) t lue flanke luftrøret (figur 2B). De platina platene er kablet til en Grass S88 stimulator som tillater levering av et elektrisk felt over luftrøret. Åpne ledninger og loddetinn er belagt med Sylgard (Sylgard 184 silikonelastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI), for å hindre utlekking av metaller i badekaret løsningen.
- A / D-konverter, datamaskin og oppkjøp programvare. Signaler fra preamplifiers er registrert på en MacLab 8 A / D-system. Dette er en eldre versjon av gjeldende ADInstrument Powerlab maskinvare. Vi bruker programmet Chart (ADInstruments) som tillater kontinuerlig opptak av spenning gjennom hele forsøket. Tension generasjon av luftrøret muskelen er ganske treg, og derfor finner vi at oppkjøpet av 100 poeng per sekund er tilstrekkelig. Spenningen målingen er kalibrert ved hjelp av kjente vekter (opptil 5 gram) før hvert forsøk. Lignende systemer er tilgjengelig fra andre venders (f.eks BioPac, GW Instruments).
- Før vev isolasjon kraften svingeren er kalibrert med kjente vekter, og vevet bad er fylt med normale PSS (se tabell). Luftinntaket er justert for å få en lys strøm av O 2 / CO 2.
- Tracheas fra to måneder eller eldre mus er optimale. Yngre dyr kan brukes, men tracheas hentet fra disse krever større dyktighet for å montere på kraft svinger ledningene på grunn av sin lille størrelse. Før disseksjon, er mus dypt sedert med isofluran. Riktig nivå av sedasjon er nådd når en tå-pinch med tang er ikke å lokke fram en reaksjon. Mus blir umiddelbart ofret av livmorhalskreft forvridning Viktig merknad:. Vi har observert at Avertin (Tribromoethanol), en sedativ som vanligvis brukes i mus, har sterke relaxant effekter på luftveiene glatt muskulatur og derfor bør ikke brukes til trachea kontraksjon studier.
- Huden (og pels) er fjernet fra thorax til halsen. RIBS er kuttet fra bunnen av sternum, lateralt (på begge sider) til toppen av hjertet. Brystbenet og ribbene blir deretter trukket frem til halsen for å avdekke hjerte / lunger, thymus, trachea (ventral) og spiserøret (festet til - og dorsal til luftrøret).
- Luftrøret er excised ved å kutte under bronkial bifurkasjon og over svelget. Luftrøret er plassert inn i en iskald oksygenert (95/5) PSS løsning (sammensetning gitt i tabell I).
- Luftrøret er dissekert ren av omkringliggende vev. Under rengjøring, kan luftrøret holdes ved svelget eller under bifurkasjon. Imidlertid bør forsiktighet tas ikke til direkte bruke tang til luftrøret selv. Fin saks kan brukes til å avskjære omkringliggende vev, men kuttet bør alltid gjøres parallelt til luftrøret for å unngå skader. Denne delen av prosedyren blir lettere dersom luftrøret preparatet festet under bifurkasjon og over svelget på en Sylgard-belagt parabolen (Sylgard 184 SilikonElastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI).
- Etter å ha fjernet omkringliggende vev, er luftrøret kuttes under svelget og over bronkial bifurkasjon og forsiktig montert på kraft svinger ledninger.
- Luftrøret er tredd over to L-formede metall utstikkerne (figur 2a). En spiss er koblet til en kraft-forskyvning svinger for kontinuerlig opptak av isometrisk spenning. En annen spiss er koblet til en mikrometer. Vevet bad er da hevet slik at luftrøret er nedsenket i PSS. Montering av luftrøret bør gjøres så raskt som mulig for å minimere tiden som luftrøret holdes utenfor PSS. Med praksis, kan montering av luftrøret skje innen ett minutt, men vi generelt unngå ganger lengre enn 3 minutter for å unngå tap av levedyktighet.
- Den mikrometer er justert sakte å få en passiv spenning på ~ 10 mN (~ 1 gram-kraft). Den optimale hviler spenningen ble bestemt empirisk og vi har funnet at passiv strekk av ~ 5-10 MN resulterer i en tilsvarende, maksimal respons på høyt kalium stimulering. Dette er konsistent med en rekke andre studier som benytter en passiv spenning i dette området 16,17,18. I løpet av de første 5-10 minutter, har en tendens luftrøret passiv spenning å avta noe (stress-avslapping fenomen) og mikrometer brukes til å justere den passive spenning til ~ 10 mN under likevekt. Luftrøret er tillatt til stabilisering i minst 1 time før eksperimentelle utfordringer.
3. Høy Kalium Stimulering
Etter stabilisering, er luftrøret utfordret to ganger med en høy kalium PSS løsning (67 mM KCl, Tabell I). Sammentrekning krever generelt ~ 5-10 minutter til steady-state på hvilken tid vevet bad skylles flere ganger med vanlige PSS å slappe helt av luftrøret. Den kalium sammentrekning gjentas en gang til, og en tredje gang (hvis nødvendig) til reproduserbare sammentrekninger er oppnådd.
Luftrøret er flankert av to rektangulære platina plater (elektroder) som lar elektrisk felt stimulering (EFS) til forberedelse. Den kontraktile responsen til EFS er en funksjon av frekvens og spenning. Det er også påvirket av fysiske parametere som areal av elektrodene og avstanden mellom dem. De elektriske egenskapene til stimulator også påvirke svarene slik at ved høyere spenninger og strøm utganger stimulator kan nå sitt maksimum. Karakteristikken av noe EFS system bør bestemmes ved å undersøke muskel kontraktile respons på ulike stimuli varigheter, frekvenser, spenninger og puls varighet. For vår eksperimentelle oppsett, har vi funnet at elektrodene skilt med ~ 4 mm, og stimulering amplitude 44 V (0,5 ms pulser) og 30 Hz er optimale for å oppnå reproduserbare nær maksimale kontraktile respons.
5. Sammentrekning Evoked av kolinerge Stimulering
Respons fra luftrøret til eksogent anvendt forbindelser vurderes enten ved tilsetting av en enkelt dose av stoffet av interesse eller ved flere filer av stoffet i en kumulativ dose mote. For luftrøret, vårt laboratorium rutinemessig brukt carbachol å aktivere kolinerge reseptorer fordi, i motsetning acetylkolin, er carbachol ikke degradert av acetylkolinesterase. En rimelig dose-respons-serien er fra 10 -8 til 10 -5 M carbachol. Montering av Log [carbachol]-kontraktile respons kurve med en Hill-type ligningen gir en estimering av EC 50 (halv maksimal effektiv konsentrasjon) som er et mål på følsomhet tracheal sammentrekning til kolinerg agonist 19. Det er verdt å merke seg at en gitt dose av carbachol vil gi en litt større respons som en enkelt dose enn som del av en kumulativ dose respons kurve.
6. Representative Resultater Et eksempel på en kontraktile respons på høy kalium er vist i Figur 3A. Sammentrekningen når et maksimumsnivå innenfor ca 10 minutter, men kan vise en liten nedgang etterpå. Under tidlig utvasking av høy kalium, kan muskelen viser en forbigående økning i kontraksjon som skyldes et fall i temperaturen som det lille volumet av uoppvarmet PSS løsning i løsningen linjene forbigående perfuses preparatet. Dette kan minimeres ved å ha et minimum død volum i slangen kobler den oppvarmede PSS reservoaret og vev bad, og også ved å utveksle løsning relativt raskt (vanligvis vi pumpe løsninger ved 100 ml / min). Hver forberedelse vil ha noen forskjeller i kontraktile respons skyldes forskjeller i muskelmasse eller skader pådratt under disseksjonen. Figur 3B viser to tracheas av forskjellig muskelmasse utfordret med høy kalium og carbachol. Selv om de kolinerge-evoked sammentrekninger forskjellig, deny er lik etter normalisering til svar med høy kalium løsning (Figur 3C).
Figur 4 viser et eksempel på en carbachol (kolinerge) vakte sammentrekning bruker enkeltdoser (A) og en kumulativ økning (B). De carbachol løsningene legges direkte til badet og boblet gass bidrar i sterk blanding. Det er verdt å merke seg at tillegg av en enkelt dose (dvs 1 mM Figur 4A) har en litt større respons enn tilsvarende konsentrasjonen under en kumulativ dose-respons kurve (1 mM, Figur 4B). Figur 4C viser en tomt på kraft i som en funksjon av carbachol konsentrasjoner ved hjelp av data fra Figur 4B. Effekter av carbachol mette på 10 -5 M konsentrasjon. Selv kolinerge agonister initierer sammentrekning gjennom kalsium utløsermekanisme, er en betydelig komponent av sammentrekning også formidlet av depolarisering ogaktivering av spenning-avhengige kalsiumkanaler 20.
Figur 5A viser et eksempel på EFS-evoked sammentrekninger. Tracheas stimuleres ved hjelp av 0,5 millisekund varighet, 40 volts pulser inntil sammentrekningene nå et platå (se innfelt a1). En økning i frekvens stimulering forårsaker en økt kontraktil respons (frekvens-respons kurven plottes i Figur 5B). Elektrisk felt stimulering har vist seg å fremkalle sammentrekninger hovedsakelig ved å aktivere presynaptiske nerver. Dette er dokumentert av effekten av botulinum toxin, en blokkering av neurotransmitterfrigivning som blokkerer flertallet av EFS-evoked sammentrekninger i luftrøret 21. Videre tetrodotoxin, en agent som blokkerer Na + kanaler også hemmer nerve aktivitet og eliminerer respons luftrøret til EFS.
Figur 1. Diagram av than store signalveier i en isolert luftrøret forberedelse. Vist er en kolinerg axon terminal innervating en tracheal glatt muskelcelle. De største signalveier er M3-og M2-muskarin acetylkolin reseptor aktivering (mACHR) som forårsaker kalsium utgivelsen gjennom IP3 reseptorer (M3) og reduksjon av cAMP (M2). M2 reseptorer (og noen bidrag fra M3 reseptorer) også forårsake kolinerg-genererte depolarization som aktiverer L-type spenning-avhengige kalsiumkanaler og kalsium tilstrømning. Vanlige kontraktile agenter og deres effektbokser er en. høy kalium (depolarize glatt muskelcelle og kolinerge axon), to. elektrisk felt stimulering (EFS, depolarizes kolinerg axon) og tre. eksogene anvendelse av kolinerge midler som acetylkolin eller carbachol (aktiverer muskarine reseptorer direkte).
Figur 2. Diagram av utstyr som brukes til å måle tracheal sammentrekninger. A. kraft svinger, mikrometer og vev bad er montert på støtte stenger via skrue klemmer. Den tracheal ringen er tredd over toppen og bunnen stenger. I diagrammet er vevet bad er plassert under utarbeidelse (dvs. under montering av luftrøret på kraft svinger). Under kontraksjon studier er vevet bad flyttet vertikalt å bade forberedelse. B. For elektrisk felt stimulering bunnen stangen er endret til å omfatte to platina plater som er montert sidelengs til luftrøret Holding wire. De platina platene er koblet sammen med elektriske ledninger til en stimulator.
Figur 3. Eksempler på høy kalium (67 mm) kontraktile respons av luftrøret. (A) viser duplikate, reproduserbare svar høyt kalium. (B) Eksempler på kontraktile respons på carbachol av to ulike tracheas. (C) Responses til tracheas i B er lik når normalisered til den høye kalium respons.
Figur 4. Eksempler på carbachol-induserte sammentrekninger. (A) Carbachol-indusert sammentrekninger med enkeltdoser etterfulgt av utvasking. (B) Eksempel kumulativ dose-respons kurve for luftrøret i A. (C) Peak sammentrekninger fra B er plottet som en funksjon av carbachol konsentrasjon.
Figur 5. Eksempler på sammentrekninger evoked av elektrisk felt stimulering. (A) Elektrisk felt stimulering av luftrøret sammentrekning bruke 0,5 ms puls, 40 volt, og ulike stimuli frekvenser som angitt. Inset er tid utvidet kontraksjon ved 30 Hz. (B) Peak sammentrekninger fra A er plotted som en funksjon av stimulering frekvens.
Normal PSS
| Salt | Kons. (MM) | Beløp (g / 2 L) |
| NaCl | 119 | 13.91 |
| KCl | 4.7 | 0.7 |
| KH 2 PO 4 | 1,18 | 0,32 |
| MgSO 4 x 7H 2 O | 1,17 | 0,58 |
| NaHCO 3 | 18 | 3,02 |
| EDTA | 0.026 | 0,1 ml 0,5 M |
| Glukose | 11 | 3,96 |
| Sukrose | 12,5 | 8,56 |
| CaCl 2 | 2 | 400 ml 10 mM |
Høy K + PSS (NACl og KCl justeringer)
| Salt | Kons. (MM) | Beløp (g / 2 L) |
| NaCl | 56,7 | 6.628 |
| KCl | 67 | 9.991 |
. Tabell 1 Oppskrift for PSS løsninger. Merk: Solutions er fersk ukentlig, med ultrarent kvalitet vann, og lagres i kjøleskap for ikke lenger enn 5 dager for å unngå forurensing vekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her gir en fysiologisk forberedelse til å vurdere luftveier muskelfunksjon. Vi generelt opererer 3-4 orgel bad preparater samtidig, men prepackaged systemer er tilgjengelig fra en rekke leverandører som tillater samtidige målinger på opp til 8 preparater (ADInstruments, World presisjonsinstrumenter, og Harvard Apparater). Vi har benyttet en rekke force transdusere og vev orgel bad med tilsvarende resultater. Men finner vi at elektrisk felt stimulering gir litt variasjon basert på små forskjeller mellom stimulerende elektroder størrelse, avstand mellom elektrode plater, samt plassering av forberedelsene i det elektriske feltet. Derfor bør ekstra forsiktighet foretas for å gjøre feltet elektroder så likt som mulig.
En av de mest kritiske parametrene i isometrisk kraft målinger er spørsmålet om å normalisere sammentrekninger for å kompensere for variasjoner i muskelmasse, ellerhelse muskelvev mellom ulike preparater. I del, kan forskjellene være minimert ved å sammenligne dyr av samme alder og samme kjønn (hunnmus tendens til å generere redusert luftrøret spenning). Videre har vi funnet at normalisering til luftrøret våt eller tørr vekt mangler tilstrekkelig presisjon, muligens på grunn av den lille størrelsen på musen luftrøret. Snarere er bruken av flere, høye kalium, sammentrekninger ganske gunstig. Høye kalium sammentrekninger tjene to formål. Den høye kalium sammentrekning synes å "vekke" den tracheal muskel og sikrer at sammentrekninger er reproduserbare før du fortsetter med eksperimentelle utfordringer. Den høye kalium sammentrekning synes også å være en nøyaktig normalisering for aktiv muskelmasse som er tilstede i produktet. Dermed er eksperimentelle spenning målinger ofte uttrykt som kraft normalisert til høy kalium sammentrekning. I tillegg kan kvaliteten av et preparat skal vurderes ved hjelp av høy kalium-indusert kontraktion. For eksempel, finner vi at 8 - 10 ukers gamle C57BL/6J hannmus har en høy kalium-indusert sammentrekning av 20 ± 3,8 mN (gjennomsnitt ± standardavvik, n = 17). Hvis en trachea forberedelse kontrakter godt under dette området (under 12 mN eller to standardavvik under gjennomsnitt), så det er generelt ansett som "skadet" og ikke utnyttes til eksperimentering. Alternativt kan normalisering av spenning til maksimal spenning på mette kolinerg agonist brukes. Dette er nyttig for å observere endringer i følsomheten for agonist, men kan gå glipp av endringer som påvirker maksimal kontraksjon.
Metoder ble presentert for å aktivere sammentrekning enten ved hjelp av en kolinerg agonist eller med elektrisk stimulering. Kolinerg agonist søknad til vevet badet aktiverer direkte glatt muskulatur. I kontrast med moderat EFS stimulering frekvens (opp til 25 Hz) majoriteten av sammentrekning er mediert gjennom nerve aktivering og frigjøring av neurotransmitter 22. Dermed etterforsker har mulighet til å undersøke agenter som påvirker presynaptisk / nerve-mediert kontraksjon bruke EFS stimulering. Endelig studier indikerer at andre celletyper som mastceller 23, og epitelceller 24 også påvirker kontraktilitet i den isolerte luftrøret forberedelse. Dermed gir det in vitro mus luftrøret forberedelse en robust funksjonell analyse for en rekke celletyper som påvirker luftveiene glatt muskulatur kontraktilitet.
I sammendraget har mus in vitro luftrøret forberedelse vært spesielt nyttig i analyse av genetiske endringer som påvirker luftveiene funksjon. Noen eksempler er analyse av genet knockouts i ionekanaler 17,20,25,26 og metabotropic reseptorer 27,28,29,30, og nedstrøms signaliserer kaskader 31. I tillegg er antigenet utfordret musen ofte brukt for astma studier 32 og in vitrotrachea forberedelse gir en nyttig test for endringer i kontraktilitet som oppstår følgende utvikling av astma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra Senter for Innovasjon i forebygging og behandling av luftveissykdommer og NINDS Grant (NS052574), og fra Sandler Program for Astma Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analogue-Digital Converter |  ADInstruments |
PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C) |
| Charting Software | ADInstrtuments |
LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. an, Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , 3rd edn, Academic Press/Elsevier. (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
