Melezleme Published: June 28, 2012 doi: 10.3791/3709

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jennifer Juhn¹, Anthony A. James^1,2

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Summary

Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj hibridizasyon

Abstract

Sivrisinekler Arbovirüsler, protozoon parazit ve nematod gibi patojenlerin çeşitli bir dizi için bir vektör. Üreme yer sivrisinek host ve patojen etkileşim ve organlarda sivrisinek yoluyla bulaşan hastalık bulaşmasını azaltmak ve yumurta gelişimini bozabilir stratejileri için büyük ilgi oldugu dokularda ifade edilir transkript ve gen düzenleyici Araştırılması. Araçların bir dizi gen ekspresyonu zamansal ve doku-spesifik düzenlemeler incelemek ve onaylamak için istihdam edilmiştir. Burada, belirli genlerin ifade ve ürünleri birikir nerede anlayışımızı geliştiren mekansal bilgi elde etmek için geliştirilen protokoller açıklanmaktadır. Açıklanan protokolü yeniden, hangi ifadeyi doğrulamak ve bu kadın tükürük bezlerinin yanı sıra yumurtalık ve embriyoların Subselüler bölmeleri gibi sivrisinek kaynaklı patojen iletimi ile ilgili dokularında transkript birikimi desenleri belirlemek için kullanılmıştırsivrisinek üreme ve gelişme için geç.

Aşağıdaki işlemleri hedef spesifik hibridizasyon sinyalleri kaybı olmadan protokolü çeşitli adımlardan etkinliğini arttırır iyileştirilmiş bir yöntem temsil eder. Toplanması, tespiti, ön hibridizasyon ve sivrisinek embriyoların hibridizasyon için belirli adımlar Bölüm B. ayrıntılı iken RNA prob hazırlanması için rehber, yumuşak doku ve fiksasyon ve hibridizasyon için genel prosedürü diseksiyonu, Bölüm A anlatılan

Protocol

Yumuşak Doku için in situ Hibridizasyon A.: Sivrisinek Bezler ve Yumurtalıklar

Aşağıdaki işlemler için gerekli çözüm ve tamponlar için tarifler Tablo 1'de özetlenmiştir.

1. RNA prob hazırlanması ve Kalite Analiz

1. PCR Tasarım primerleri ilgi transkript hedef yükseltmek. Bu amplikon ≥ 600 nükleotid uzunluğunda ve daha da önemlisi amplikon sekansı hedef transkript özgü olması önerilmektedir. -Benzersiz olmayan dizileri çapraz-reaktif RNA probları üretme olasılığını ortadan kaldırmak için, önlenir.
2. PCR4-TOPO vektör veya benzer klonlama vektörüne PCR ürünü klonlama. PCR4-TOPO klonlama vektörü T7 ve tek bir klondan duygusu ve antisens run-off transkripsiyon ürünlerinin hem üretimini sağlayacak T3 RNA polimeraz priming sitelerini içerir.
3. Sıra sıra fid doğrulamak için klonlanmış amplikonvektör plazmidi içinde elity ve yönelimi.
4. In vitro transkripsiyonu ürün bir antisens üretmek için uygun bir enzim ile bir kısıtlama özeti reaksiyonu gerçekleştirmek. Plazmid doğrusallaştırma I. gibi SPE I, Pst I olarak pCR4-TOPO vektörün çoklu klonlama bölgesinde yer alan bir sınırlandırma bölgesi seçerek düz ya da değil yapılır Seçilen kısıtlama sitesi klonlanmış parçası mevcut olmadığından emin olun. Aynı klonu bir arka plan kontrolü görevi gören bir anlamda-strand RNA prob, üretmek için kullanılabilir. Bir anlamda prob ile in situ Hibridizasyon tamamlayıcı antisens prob kıyasla çok az veya hiç sinyal vermelidir.
5. PCR4-TOPO klon tamamen lineerleştirilebilir olduğunu jel elektroforezi ile doğrulayın.
6. Etanol yağış tarafından izlenen bir fenol-kloroform ekstraksiyon, yaparak doğrusallaştırılmış plazmid DNA arındırın. Plazmid DNA çökelterek zaman bir nihai konsantrasyonlarda kullanılması tavsiye edilirEtanol 2.5 hacim ile 2 M amonyum asetat oranı taşıma-üstü kalıntı tuzu vitro transkripsiyon reaksiyonunda içine azaltmaktır.
7. Digoxigenin (DIG)-etiketli bir şablon olarak doğrusallaştırılmış plazmid DNA 1 mcg kullanarak, in vitro transkripsiyon reaksiyonunda bir run-off gerçekleştirerek tek zincirli RNA probu hazırlayın. RNA polimeraz, transkripsiyon ve tampon gibi üreticinin talimatlarına tarafından açıklanan DIG RNA etiketleme karışımı ile reaksiyon hazırlayın.
8. Etanol tortulaşmasıyla in vitro transkripsiyonu ürünlerinde, DIG-labeled arındırmak ve DEPC işlenmiş-damıtık su içerisinde yeniden süspanse peletlenmiş RNA.
9. Formaldehit jel elektroforezi ile kalite ve saflaştırılmış DIG etiketli RNA probu beklenen molekül ağırlığı doğrulayın. Hazırlanan RNA prob kısma bölünmüş ve -80 C'de saklandı edilebilir ° C, kullanılıncaya kadar.

2. Sivrisinek Bezler ve Yumurtalıklar diseksiyonu

1. Sivrisinek tükürük Glan dissectolarak Ae için daha önce açıklanan bir prob ve forseps kullanarak ds. Bir için aegypti. ^1,2. Ae için tarif edildiği gibi gambiae, tükürük bezleri disseke edilebilir. aegypti, ya da alternatif olarak Anopheles Research kılavuzu MR4 Yöntem tarif. ³
2. Ae için daha önce açıklandığı gibi forseps kullanarak sivrisinek yumurtalıklar parçalara ayır. aegypti. ⁴ Kısaca, forseps başka bir çift yumurtalık serbest bırakmak için sondan bir önceki karın segmenti çeker iken, toraks kavramak için forseps bir çift kullanın.
3. PBS 50 ul içeren Ambion RNAse-free 1.5 ml mikrofuge'de tüplerde disseke tükürük bezlerinin veya yumurtalıkların toplayın.
4. Fiksasyon kadar buz örnekleri koruyun.

3. Tespit

1. 30 dakika ile 1 saat boyunca nütasyon ile oda sıcaklığında taze hazırlanmış yumuşak doku fiksasyon çözeltisi (Tablo 1) parçalanmış dokular sabitlemek. Fiksasyon çözüm oxidat önlemek için taze olarak hazırlanırformaldehit sabitleştirici iyon. 1-1.5 saat Fiksasyon tükürük bezleri için önerilir. 1 ml az hacmi 1.5 ml mikrofuge'de tüp içinde dokulara sabitlemek için tavsiye edilir.
2. Dokuların mikrofuge'de tüpün dibe izin verin. Bu protokolde çözümleri tüm değişiklikleri izler ve önemli örnek kaybını minimize edecek önemli bir adımdır.
3. 3 × 5 dk PBT ile yıkayın sonra mikrofuge'de tüp hacminin 50-100 ul bırakarak, dikkatli pipetleme tarafından tespit ve çözüm boşaltacaktır.
4. Doku depolama için opsiyonel dengeleme adımları. Basamaklı etanol veya metanol ile ya PBT yıkayın. PBT / alkol (3:1, 1:1 ve 1:3, 5 dk) ile basamaklı yıkar gerçekleştirin. -20 ° C'de% 100 Mağaza (200 proof) alkol Dokular doku ince bir bozulma olmadan birkaç ay saklanabilir. Protokolün sonraki adımları gerçekleştirmeden önce, dokular alkol / PBT (3:1, 1:1, ile adım adım dengelenme tarafından PBT iade edilmelidir1:03, 5 dk).
5. PBT 3 ×, her 5 dk yıkar gerçekleştirin.
6. Oda sıcaklığında, 0.01 mg / ml Proteinaz K / PBT, 5 dakika ile protein sindirim gerçekleştirmek. RNA in situ protein hedefler ve melezleme her iki immunolocalization arzu edilir Alternatif olarak, eğer, yumurtalık 10 dak yerine proteinaz K ile tedavi etmek için -20 ° C 'de 80% aseton / _H2O ile inkübe edilebilir
   Proteinaz K tedavisi tükürük bezleri hazırlanması için atlanmıştır. 3.10 doğrudan adım ilerleyin.
7. Hemen dikkatli pipetleme tarafından sindirim çözüm boşaltacaktır. Buz PBT ×, 5 dk sindirim durdurmak için 2 yıkayın.
8. Gerçekleştiren ek PBT 2 ×, oda sıcaklığında, 5 dakika, her yıkar.
9. 30 dakika boyunca nütasyon ile oda sıcaklığında yumuşak doku fiksasyon çözelti içinde post-sabitlemek. Post-fiksasyon adımları tükürük bezleri için gerçekleştirilemiyor.
10. PBT 5 × 5 dk yıkar gerçekleştirin.

4. Melezleme

1. Durusu HYB / PBT mümkün olduğunca. Her örnek tüpüne HYB 1 ml ekleyin.
2. Bir hibridizasyon şişe içinde kapalı hava koruyucu ambalaj (bubble wrap) ve yerinde numune tüpü sarın. Bir hibridizasyon şişe kapağıyla şişe sürün.
3. Pre-hibridizasyon ve melezleme adımları bir melezleştirme fırın içinde kolay bir şekilde gerçekleştirilebilir. Dönüşü ile 30 dakika boyunca 55 ° C'de ön melezleme gerçekleştirmek.
4. HYB PBT daha yoğun olduğu gibi dokular, mikrofuge'de tüp dibe için yeterli zaman tanıyın. Dikkatle ön hibridizasyon çözüm boşaltacaktır. Dokular saydam ve görselleştirmek için zor olabilir. Örnek kaybı her numune tüp içinde çözelti hacminin 50-100 ul bırakarak tarafından azaltılabilir.
5. 55 ° C de bir ısı blok içinde Örnek tüp içine HYB 50 ul hacmi ekleyin ve bakımını
6. 5-10 dakika süreyle 85 ° C sıcaklıkta RNA prob denatüre. Hemen 5 dakika buz üzerinde denatüre prob yerleştirin.
7. Örnek tüpüne RNA probu Pipeti. RNA prob HYB arasında yüzeyde yüzebilir olacaktır. Yavaşça tüp hafifçe vurarak karıştırın.
8. Örnek başına HYB 50-100 ul toplam hacimde hibridizasyon gerçekleştirmek. Bir hibridizasyon Fırının içindeki sabit bir mikrofuge'de rafa, veya 55 bir su banyosunda yüzen bir mikrofuge'de tüpü rakı, ° 16-24 saat C örnekleri inkübe edin.

5.. RNAse A Tedavisi

1. Prob içeren HYB çıkarın. Bu kalıntı ilişkisiz prob spesifik olmayan bağlanma azaltmak için yıkama adım sırasında 55 ° C'de numunelerin korumak için önemlidir. Çeşitli örneklerinin melezleştirildi takdirde, yıkama adımları boyunca hibridizasyon sıcaklığı korumak için 55 ° C'da ayarlanmış bir ısı blok içinde Örnek tüpler tutmak için tavsiye edilir.
2. Mikrofuge'de küvetin içine çözeltinin 1 ml pipet ile HYB ile hızlı yıkama yapıne ve tersini örnek tüpü 5-6 kez.
   Protokolü takip eden tüm hızlı yıkama çözeltisi ve istenen ters örnek tüp birkaç kez ekleyerek benzer şekilde gerçekleştirilir.
3. 55 HYB ile iki ek yıkar ° C, 30 dakika hibridizasyon fırında rotasyon ile her gerçekleştirin.
4. Nütasyon ile 15 dakika boyunca HYB / PBT (1:01) ile oda sıcaklığında kuluçkaya PBT içine dengeye.
5. PBT 5 × 5 dk yıkar gerçekleştirin.
6. Taze RNAse bir tampon hazırlayın. RNAse 30 dakika süreyle 20 mg, 37 / ml RNAse A / PBT ° C, içinde kuluçkaya alarak bir tedavi gerçekleştirmek. RNAse bir keser tek zincirli RNA ve melezleşmemiş RNA probu düşmesine neden olacaktır.
7. Durusu RNAse bir tampon ve PBT ile hızlı yıkama gerçekleştirin.
8. PBT 3 ×, her 5 dk yıkar gerçekleştirin.

6. Antikor Kuluçka

1. Inkübasyon ile (% 5 tavuk serumu / 1% Batı Engelleme Reaktif / PBT) ve blok örnekler taze engelleme çözümü hazırlayınnütasyon ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözelti 1 ml mmm.
2. Anti-DIG-alkalin fosfataz (AP)-konjuge çözeltisi engellenmesinde bir antikor 1:1000 seyreltmesinin 200 ul ekleyin. Nütasyon ile bir gece boyunca, 4 ° C'de inkübe edilir.

7. Alkalin Fosfataz Boyama

1. Antikor ve engelleme çözümü çıkarın.
2. PBT ile hızlı yıkama yapın.
3. Gerçekleştiren ek PBT 5 × 10 dk yıkar. Alternatif olarak örnekleri 3x, 10 dak, her 4 uzatılmış bir yıkama ° C, nütasyon ile bir gece boyunca yıkanırlar ve ardından da yapılabilir.
4. Taze AP boyama tamponu hazırlayın.
5. AP boyama tamponu ile hızlı yıkama yapın.
6. AP boyama tampon 3 ile ek yıkar ×, 5 dk nütasyon her gerçekleştirin.
7. Üreticinin talimatlarına, AP substrat NBT / BCIP içeren taze AP boyama çözümü göre hazırlayın.
8. Oda sıcaklığında az AP boyama solüsyonu 500 ul her bir örnek inkübekaranlıkta nütasyon, e. Örnekleri opak bir kap veya alüminyum folyo ile tüp kaplayarak inkübe edilebilir. Reaksiyon ilerlemesi, mor bir çökelti oluşumu için, her 1-2 dakika kontrol edilmelidir. Prob konsantrasyonu, hedef RNA konsantrasyonu ve non-spesifik hedef varlığında bağlı olarak boyanması birkaç saat için birkaç dakika için devam edebilir.
9. Mümkün olduğunca boyama çözüm kadar çıkarın. Müteakip adımda yıkama sırasında beyaz bir yün çökelti oluşmasına tatmin edici sonuçlar dekantasyon.
10. Boyama PBT iki hızlı yıkama yapılarak tamamen durdurulur.
11. Gerçekleştiren ek PBT 3 ×, her 5 dk yıkar.

8. Gliserol Montaj

1. Bir borcam nokta plaka bireysel yuvarlak tabanlı kuyulara mikrofuge'de tüplerinden büyük çaplı 200 ul pipet ucu, transfer örnekleri kullanma.
2. Kadar PBT mümkün dikkatlice örnek kaldırmak.
3. Örnek% 70 gliserol / H ₂ O üstüne Pipet Gece boyunca, 4 ° C 'de Örnek dokuya nüfuz etmesi gliserol izin verir. Gliserol tedavisi slayt montaj sırasında dokularda kurumasına engel olur.
4. Slayt yüzeyi Kimwipes ile temizlik silerek mikroskop slaytlar hazırlayın. Birbirine görünmez bant paralel iki adet böylece dar bir kanal (Şekil 2) oluştururlar slayt üzerine uygulayın.
5. Sanatsal bir fırça kullanarak, örnekleri tek-birer pick up ve anterior / posterior ve dorsal / ventral saflaşma açısından, aynı yönü ile her numune konumlandırma, kanalın uzunluğu boyunca koyun.
6. Her örnek yerleştirdikten sonra dokular (Şekil 3) çevresindeki aşırı gliserol çözüm emmek için bir Kimwipe bez kullanın. Aşırı gliserol çıkarılması bir kapak kayma altında slayt üzerine monte örnekleri kaparken, kabarcık oluşumunu önlemek için önemlidir.
7. Merkezi ve yeri dikkatle achizalanmış örnekleri içeren kanal üzerinden astar üzerine. Eke dayalı kapağı şeffaf tırnak cilası ile kapak kayma köşelerinde dabbing tarafından slayt üzerine semipermanently slip.
8. Bir 200 ul pipet kullanılarak, kanal yeterince% 70 gliserol kılcal hareket ile kapak kayma altında kanalı ve bölgenin bütün boşluğu doldurmak için bir ucunun içine yavaş yavaş dağıtın.
9. Kalıcı kapak kayma dört tarafı boyunca oje uygulayarak monte örnekleri mühür. Melezleşmiş bütün montaj dokuların fotoğraflanması önce yeterince kurumasını oje izin verin. Hemen montaj sonrası örneklerin görüntüleri fotoğraflamak için tavsiye edilir.

Sivrisinek Embriyolar için yerinde B. Hibridizasyon

Sivrisinek embriyo için in situ melezleştirme için gerekli olan çözeltiler ve tamponlar (Tablo 1) tarif edilmektedir. Burada sunulan Tespit ve hibridizasyon işlemleri Thos gelen modifiye edilmişe birinci Anopheles gambiae, ^5,6 Aedes aegypti ⁷ ve Culex quinquefasciatus için rapor edilmiştir. ⁸

1. Embriyo Koleksiyonu

1. Embriyolar 300 evlendirilen kadın, yetişkin sivrisinek (48 saat erkek, post-çıkışı 3 gün çiftleşmek için izin) kan beslenme sonrası 72 saat toplanmaktadır. Sivrisinekler önceden amaçlanan toplama süresine ovipozisyon önlemek için, 3 M sukroz çözeltisi üzerinde muhafaza edilir.
2. 16 oz döşeyen tarafından embriyo toplama kapları hazırlayın. fincan iç yüzeyi tamamen kaplı böylece Saatilene Hitech mesh ile kağıt bardak. Mesh tek bir zımba ile iliştirilebilir. Bu örgü kullanarak büyük ölçüde Whatman filtre kağıdı veya kağıt havlu kullanılması halinde mevcut fibröz kirleticileri azaltır.
3. Damıtılmış su ile yarı-tam doldurun.
4. Embriyolar daha sonra kaplanmış kafese toplama kabı, yerleştirilmesi ile 1 saat süre ile toplanırKaranlık bir bezle ovipozisyon uyarmak için.
5. Toplanan embriyolar standart yetiştirme koşulları (% 85 bağıl nem / 26 ° C) kafesin dışında istenilen gelişim evreleri olgun için izin verilir. Çeşitli aşamalarında embriyo olgunlaşması (Tablo 2) açıklandığı embriyonik olayların yaklaşık gelişimsel zamanlı ders takip süresi (saat sonrası yumurtlama) ile korele edilebilir. Bu tablo Raminani ve Cupp tarafından bildirilen Aedes aegypti için, embriyonik gelişimin önemli olayları özetleyen, ^9,10 Anofel gambiae Ivanova-Kazas ¹¹ tarafından ilk açıklanan ve daha Goltsev ve arkadaşları, ^12,13 ve Davis tarafından bildirilen Culex quinquefasciatus tarafından geliştirilmiştir. ¹⁴ açıklandığı zaman içerisinde oldukça kalkınma belirli aşamalarında embriyo toplanması için mutlak zaman noktaları, daha ilk tahminler olarak hizmet vermesi planlanıyor.

2. Dechorionation, Fiksasyon ve Endochoribozulması üzerine

1. Bir Saatilene örgü dechorionation yakalama tüpü (Şekil 3) içine toplama kabından embriyo transferi.
   Aedes embriyolar için, yakalama tüpün hacminin yarısını dolu şekilde yeterince saf su ile doldurulmuş bir behere yakalama tüpü yerleştirin. Sanatsal bir fırça Saatilene ağdan embriyo çıkarmak ve su dolu av tüp içine aktarmak için kullanılabilir.
   Anofel embriyolar için, toplama kabından Saatilene örgü ayırmak ve bir huni oluşturmak için dikkatle örgü katlayın. Tek elle mesh huni Holding, catch tüpüne embriyo yıkamak için huni kenarları boyunca bir polietilen püskürtme şişesi ile distile su dağıtmak için diğer elinizi kullanın. Onlar ovipozisyon yüzeye yapışmasını sağlayan yumurta Aedes embriyoların yüzey üzerinde mevcut yapışkan maddenin eksikliği, çünkü bu yöntem Anofel embriyo uygulanabilir.
2. Prdechorionation çözeltisi epare 40 ml (1 hacim% 5.25 sodyum hipoklorit: damıtılmış su 3 hacim) katılmıştır. 100 mm Petri kabına çözüm dökün.
3. Distile su 50 ml içeren 100 ml'lik behere hazırlayın ve bir kenara koyun. Dechorionation adım embriyolar dechorionation çözeltinin bulunduğu, bu su ile haşır neşir olacaksınız zaman duyarlı ve hemen aşağıdaki sodyum hipoklorit tedavidir.
4. Dechorionation solüsyon ile dolduruldu Petri tabağına tüp yerleştirerek meş yakalamak tüp içinde embriyo Dechorionate. Embriyoların dechorionation çözüm gömülmüş ve ajite kalır böylece av flakon dönen ederken, embriyoların yıkamak için bir tek polietilen transferi pipet veya Pasteur pipet kullanın.
   75 sn Anopheles ve Culex embriyolar (Tablo 3) için yeterli iken 35 sn maksimum, Aedes embriyoların dechorionation için gereklidir. Dechorionation korumala en hassas adımları biridirocol ve sodyum hipoklorit tedavi aşırı uzantısı, özellikle Aedes embriyosu için koryon uygun çatlama önleyecektir.
5. Su içeren behere hemen daldırın yakalamak flakon.
6. Su dolu kaptan yakalamak tüp çıkarılması ve boru ile donatılmış bir squirt şişe veya musluktan distile su ile yakalamak tüpün iç ve dış duvarları kapalı durulama tarafından embriyolardan kalan dechorionation çözüm yıkayın.
7. Dechorionation düşük büyütmede bir mikroskop ile embriyolar görselleştirmek tarafından doğrulanabilir. Dechorionated Aedes embriyolar netleştirme gibi exochorion yoksun ve siyah endochorion sadece pürüzsüz, parlak yüzeyi dechorionated Anofel embriyolar için exochorionic mantarlar ve sırt yapıları (Şekil 4) bulunmadığı açıktır.
8. Sanatsal bir fırça kullanarak, distile wa 5 ml içeren bir sintilasyon şişeye dechorionated embryo transferter (Şekil 5-1). Birden fazla numune hazırlanmaktadır ise, embriyoların kuruma önlemek için suda av tüpleri korumak.
9. Embriyoların sintilasyon flakon tabanına yerleşmeye ve mümkün olduğunca şişeden fazla su olarak kaldırmak istiyorum.
10. Sintilasyon şişesine (Şekil 5-2) olarak heptan ve 5 ml ilave edilir. Sintilasyon flakon içinde kalan artık su çıkarın.
11. Taze hazırlanmış embriyo fiksasyon çözeltisi sintilasyon şişeye 5 ml (Tablo 1) içine ekleyin.
12. Organik ve sulu fazları, kuvvetli bir şekilde karıştırarak iyice, ancak o kadar inversiyon ile 30 dakika boyunca embriyosu sabitlemek.
13. (Şekil 5-3) embriyolar içeren interfaz, rahatsız dikkat ederek, bir bardak Pasteur pipeti kullanarak tesbit çözeltisi çıkarın.
14. Mümkün olduğu kadar saf su ile sintilasyon flakon doldurarak kalıntı tesbit çözeltisi yıkayın. Flakon 5 kez ve Invertsonra saf su kaldırın.
15. 30 dakika boyunca ters şişeye tarafından damıtılmış su ve karışım 20 ml sintilasyon şişeye doldurun.
16. Sintilasyon flakondan tüm su çıkarın.
17. Inorganik heptan faz şişeye üst ulaştığında, böylece sintilasyon şişeye yeterince kaynamakta olan damıtık su ilave edilir.
18. 30 sn boyunca inkübe ve sonra kaynar su kaldırın.
19. Inorganik fazdan şişeye üst noktasına ulaşıncaya kadar buz damıtılmış su ilave edilir. 10 dakika süreyle buz şişeye inkübe.
20. İlk sonra sulu ve organik fazlar çıkarın. Heptan bu adımı (Şekil 5-4) de opak görünür.
21. Şişeye yeni heptan 5 ml ekleyin. Tüpten kalan tüm su çıkarın.
22. Şişeye, metanol ve 5 ml ilave edilir. 1-2 kez enerjik girdap flakon, titreme olmadan (Şekil 6). Heptan inorganik ve organik metanol fazları sarsılmış ise şiddetle embriyolar wiendochorion yırtılması esnasında tahrip olacak. Bu bizim Aedes aegypti embriyoların farklı suşları için endochorion bozulma verimlilik değişimi gözlemledim bahsetmek dikkat çekicidir.
23. 15-20 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu aşamada, fazlar sarısı bileşenleri (Şekil 5-5) serbest bırakılması nedeniyle bulanık olacaktır.
24. Organik ve inorganik fazlar hem çıkarın ve kalan tüm heptan kaldırmak için metanol ile 3 kere yıkayın.
25. Embriyolar birkaç ay için -20 ° C'de metanol içinde depolanabilir.

3. Peeling

1. Bir 3 santimetrelik bir petri tabağına merkezinde çift taraflı peruk bir bant yerleştirin. Yapışkan, metanol ve etanol varlığında stabil olduğu peruk bant kullanılır.
2. Çift taraflı bant üzerine metanol çapı büyük (yaklaşık 3 mm çapında) 200 ul pipet ucu, embriyo transferi kullanma.
3. 1-2 yerleşmek embriyolar için min ve adh İzinbant yüzeyine ere.
4. Boşaltmak aşırı metanol ve yüzey 1-2 dakika için hafifçe kurumaya bırakılır.
5. Petri kabına% 95 4 ml (190 proof) etanol ekleyin.
6. Etanol ve karıştırmak için girdap içine distile su pipetle 600 ul. Şerit rengi opak hale gelecektir. Distile su ilavesi bant yapışkan hale ve peeling sırasında embriyoların hareketsiz neden olur. İstenirse bu adım atlanabilir.
7. Çatlak endochorion (Şekil 7) kalkmasına 1 ml şırınga varil bağlı bir 27.5 gauge iğne kullanın. Siyah endochorion kalıntılarından beyaz embriyo bırakmadan sonra teypten ince uçlu bir fırça kullanarak sanatsal Petri çanağı etanol rezervuara embryo transfer. 3 mm delik pipet kullanarak, 200 kanıtı etanol 500 ul içeren bir Ambion 1.5 ml mikrofuge'de tüpüne embriyo transferi.
   Onlar başına yapışabilir çünkü soyulmuş embriyo uzun bir süre için kasete kalmamalıdırmanently teybe.
8. % 100 ile 2-3 hızlı yıkar (200 proof) etanol gerçekleştirin ve -20 ° C'de punktiloz etanol içinde embriyoların saklamak Soyulmuş embriyo morfolojisi veya daha sonraki hibridizasyon sinyali etkilemeden birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.

4. Yolk Açıklanması

1. 200 kanıtı etanol ile hızlı yıkama yapın. Punktiloz etanol tüm sonraki yıkama adımı için ve p-ksilen sarısı açıklık çözeltisinin hazırlanması için kullanılmalıdır.
2. Bir etanol yıkama, nütasyon ile 5 dakika uygulayın.
3. Nütasyon ile 1-1.5 saat için oda sıcaklığında P-xylene/ethanol (9:1) içinde inkübe. Ksilen adım parazit oranı sinyali geliştirmek için sarısı kütlesinin açıklık izin verir.
4. Ksilen-etanol çıkarın ve etanol ile iki hızlı yıkama gerçekleştirin.
5. Bir etanol yıkama, nütasyon ile 5 dakika uygulayın.
6. Bir Metanol yıkama izledi metanol ile iki hızlı yıkama, 5 dakika ile gerçekleştirmeknütasyon.
7. Metanol / formaldehit sabitleme solüsyonu (1:1) ile yıkanarak bir kez% 4 formaldehit fiksasyon çözelti içine dengeye.

5.. In situ fiksasyon ve Hibritleşme

In situ işlemlerde Fiksasyon ve hibridizasyon protokolü Bölüm A'da tarif aynıdır

C. Temsilcisi Sonuçlar

In situ hibridizasyon protokolü, burada varlığı ve hedef mRNA lokalizasyonu gösteren renkli boyanma sonuçları açıklanmıştır. Bu transkript bolluk göreli seviyeleri in situ hibridizasyon tarafından tespit edilemez olduğunu vurgulamak önemlidir. Hibridizasyon sonuçlar hibridizasyon prosedürü için kullanılan spesifik mRNA prob, melez dokuda hedef mRNA yanı sıra prob konsantrasyonu ve sıcaklığı hibridizasyon bolluğu bağlıdır. Dokuların Karşılaştırma antisens ile hibridize ve ilgili anlamda mRNA probları boyama desenleri doğru şekilde yorumlanmasını mümkün kılmaktadır.

Hedef amylase1 (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423) ve D7L2 (AAEL006424) proksimal-lateral, distal lateral bu transkript birikimi göstermektedir ki mRNA problar ile kadın Aedes aegypti tamamına monte tükürük bezlerinin in situ Hibridizasyon, ve distal- sırasıyla yan / medial loblar (Şekil 8). üç sivrisinek türlerinin ¹ Tüm montaj yumurtalıklar özellikle oskar ile ilgili orthologous transkript (Şekil 9) hedef mRNA probları ile hibridize edildi. ^7,8 Hibridizasyon bütün montaj embriyoların in situ Ae. aegypti, An. gambiae ve Cx. quinquefasciatus ilgili sivrisinek oskar orthologous transkript (Şekil 10) hedef antisens RNA prob kullanılarak yapıldı. ^7,8

igure 1 "src =" / files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg "/>
Şekil 1.. Post-melezleşme şematik kurulum montaj.

Şekil 2. Kimwipe paspas hazırlanması montaj sırasında kullanılan örnek. Bir Kimwipe doku örnekleri ve slayt aşırı montaj orta emmek için ince uçlu paspas üretmek için sıkı bir şekilde bükülür.

Şekil 3. Saatilene meş dechorionation catch tüp şematik. A) bir 50 ml polistiren konik borusunun alt her iki uçta da 4,5 cm uzunluğunda, açık bir oyuk boru verecek şekilde kesilir. Bir genelge açılış Saatilene mesh 6.5 cm ² kare parça ile yıkanmalıdır sıvı izin vermek için konik boru kapağı kesilir. İnç başına 330 konuları, 34 mikron çaplı iplik örgü ekran sivrisinek embriyolar korur. B) Asstüp yakalamak embled.

4. Aedes aegypti ve Anopheles gambiae yumurta, dechorionation öncesi ve sonrası. A) Aedes aegypti yumurta önceden dechorionation için Şekil. Kafes benzeri exochorion siyah endochorion yukarıda yatıyor ve yumurta dokulu bir görünüm (inset büyütme) verir. Exochorion çıkarılmasını takiben, sadece düzgün ve cilalı endochorion (B ve içerlek genişleme) kalır. C) dechorionation önce Anofel gambiae yumurtaları. Böyle yüzen gibi Exochorion yapılar (oklar) görülebilir. D) endochorion ile pürüzsüz ve parlak yüzeyi dechorionation sonra görünür. Bar = 100 mikron.

Şekil 5. Fiksasyon ve Ae endochorion bozulması için sıralı adımları bir dizi. aegypti yumurta. A) Eğimli ön görünümüAe içeren sintilasyon şişeleri ve B) yan görünümü. fiksasyon ve endochorion bozulma sıralı adımları sırasında aegypti yumurta. Distile su içinde 1) Embriyolar. 2) Embriyolar üst heptan aşaması ve alt sulu faz arasında interfaz içinde yüzerler. 3) Aşağıdaki fiksasyon embriyolar yuvarlak bir kitle bir arada paketi. Embriyolar heptan ve sabitleştirici çözüm fazlar arasındaki interfaz kalır. 4) buz kaynar su ve kuluçka ile tedaviden sonra, heptan faz hafif opak hale gelir. 5) ile kesintiye endochorions Embriyolar opak bir heptan faz ve şeffaf bir metanol faz arasındaki interfaz 'de gösterilmiştir.

6 Şekil. Sabit Ae Endochorion bozulması. aegypti yumurta. A) hemen sonra enerjik heptan ve metanol aşamadan dönen, kabarcık oluşumu ve endochorion bozulması görüntülenebilmekte. B) followiOda sıcaklığında inkübasyondan ng beş dakika.

Şekil 7. Bozulması ve endochorion çıkarılmasından sonra Sivrisinek yumurtaları. Ae Yumurta. aegypti (A), bir. gambiae (B) ve Cx. quinquefasciatus (C) Aşağıdaki fiksasyon ve endochorion bozulması. Beyaz, saydam embriyolar çatlamış endochorion içinde görülebilir. Sonra endochorion çıkarılması, Ae saydam embriyosu. aegypti (D), bir. gambiae (E) ve Cx. quinquefasciatus (F) net bir şekilde görülebiliyor. Bar = 100 mikron.

Şekil 8. Tüm montaj, kadın Ae farklı loblarda ifade üç gen için yerinde hibridizasyonları. aegypti tükrük bezleri. Boyama amylase1 lokalizasyonu ve birikimi (AAE göstergesidir L006719) (A), D7s2 (AAEL006423) (B) ve D7L2 (AAEL006424) (B). Bar = 100 mikron.

Şekil 9. Tüm montaj sivrisinek yumurtaları ve hemşire hücrelere sivrisinek oskar antisens RNA probları için in situ Hibridizasyon. Evre IV oosit (OOC) An yumurtalıklar diseke. gambiae (A), Ae. aegypti (B) ve Cx. quinquefasciatus (C) ve ilgili sivrisinek oskar mRNA'ların hedef RNA probları ile hibridize. Primer folikül sol ön ile yönlendirilir. Arka kutupta (mavi ok) az boyama oskar mRNA'ların birikmiş belirtiniz. İkincil (f2) ve üçüncül (f3) folikül gösterilen ve boyama (siyah ok) hemşire hücre sitoplazması (beleş) içinde oskar mRNA birikimine işaret etmektedir. Boyama hemşire hücre çekirdeği (NCN) çıkarılmıştır. Bar = 50 um.

ad/3709/3709fig10.jpg "/>
10 Şekil. Bütün monte sivrisinek embryolarının sivrisinek oskar antisens RNA probları için in situ Hibridizasyon. Embriyolar sol ön ile yönlendirilir. Bir hücresel blastoderm dönem embriyoların. gambiae (A) ve Cx. quinquefasciatus (C) ilgili sivrisinek türlerinin özel oskar RNA probları ile hibridize edilir. B) A sinsityal blastoderm sahne Ae. aegypti embriyo Ae hedef RNA probları ile hibridize. aegypti oskar transkript. Boyama bu hücrelerde sivrisinek oskar mRNA lokalizasyonu ve birikim gösteren, tüm embriyoların arka kutupta hücreler belirgindir. Bar = 50 um.

Tablo 1. Yerinde formaldehit jel elektroforezi, fiksasyon ve hibridizasyon için çözümler ve tamponlar.

ftp_upload/3709/3709table2.jpg "/>
Tablo 2. Sivrisinek embriyogenez sırasında ardışık aşamalarına karşılık gelen gelişimsel olaylar ve gözlemler.

Tablo 3. Çeşitli doku tiplerinde ön hibridizasyon adımlarla önemli farklılıklar özeti.

Discussion

Situ ve kolorimetrik boyama protokolünde hibridizasyon tüm montaj sivrisinek doku ve embriyolar için buraya sunulan belirli organ ve hücre tipleri içinde transkript lokalizasyonu için yararlı bir tekniktir. Bu prosedürler bizim daha önce bildirilen yöntemlere göre, hem geniş yıkama adımları hızlandırarak ve ek teknik bilgi ve reaktif kaynaklardan sağlayan bir iyileşme vardır.

Deneyimlerimize göre, melezleme sinyallerin kolorimetrik tespiti floresans tabanlı algılama düzenleri göre melezleşme sinyali hassasiyet ve netlik açısından üstündür. Ayrıca kolorimetrik tespiti gereği otomatik floresan olan embriyolar, sinyal ayrımcılık ile ilgili sorunları circumvents. Düşük bolluk transkript hedeflenen zaman hibridizasyon sinyalleri tespit Sınırlamalar, meydana ve arka plan boyama açıktır. 65 hibridizasyon sıcaklığının artmasıyla ° C geri azaltmak için bulunmuşturzemin hibridizasyon sinyalleri, ama tek hedefi özgü RNA probları tasarımı için önerilen bir alternatifi değildir.

Bu protokol tüm montaj tükürük Aedes aegypti bezler ve yumurtalıklar ve Anofel gambiae, Anofel stephensi, Ae embriyoların in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için kullanılmıştır. aegypti ve Culex quinquefasciatus. Bu yöntem diğer sivrisinek dokulara uygulanan ve muhtemelen diğer böceklerin gelenler. Ayrıca, üç vektör sivrisinek, Ae embriyonik gelişim evreleme için ilk kez karşılaştırmalı kılavuzlar için derlenmiş. aegypti, An. gambiae ve Cx. fatigans. Gözlemler sağduyulu yetiştirme koşullarında bu üç türün belirli suşları için bildirilmiştir. Bu gelişme süresi tabii sivrisinek türlerinin farklı suşları için ve farklı yetiştirme koşullarında değişiklik dikkat etmek önemlidir. In situ ekinde hibridizasyonları ana çabaları devam edenSivrisinek ve diğer eklembacaklıların transcriptomes lyze ve bu organizmaların gen ifadesinin düzenlenmesinde daha iyi bir görüntü sağlayabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
1M Tris-HCl	Ambion	AM9855G	pH8.0
10X PBS	Ambion	AM9625
20X SSC	Ambion	AM9763
1.5 ml microfuge tubes	Ambion	AM12400	Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Storage at 4 °C
DEPC water	Ambion	AM9932
Proteinase K	Ambion	AM2546
5.25% Sodium hypochlorite	Austin’s		A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus	Ambion	AM2733	Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase	Ambion	AM2082	Storage at -20 °C
95% Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
HPLC-grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M87-500
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-542A	18 x18 mm
N-Heptane	Fisher Scientific	H350-1
P-xylene	Fisher Scientific	O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate	Fisher Scientific	13-748B	100x85 mm
Sodium chloride	Fisher Scientific	AC32730-0025
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape	Hair Direct	RED-75R12	Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli	Invitrogen	K457501 K457540	20 reactions 40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011	Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche Applied Science	1093274	Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix	Roche Applied Science	1277073	Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution	Roche Applied Science	1681451	Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent	Roche Applied Science	11921673001	Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130)	Saati Print	330.34 UO PW	330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol	Sigma	G6279-1	70% in PBT
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
Tween 20	Sigma	P1379-500
37% Formaldehyde	Ted Pella	18508	10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids	The Paper Company	SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap	VWR International	66022-128	20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material	VWR International	500018-081	10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum			Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.