تهجين Published: June 28, 2012 doi: 10.3791/3709

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jennifer Juhn¹, Anthony A. James^1,2

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Summary

الزمانية والمكانية تحليل التعبير الجيني لها دور حاسم في علم الجينوم وظيفي. كل جبل تهجين

Abstract

البعوض الناقل لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض بما في ذلك arboviruses، طفيليات الأوالي والديدان الخيطية. تحقيق النصوص والمنظمين الجينات التي يتم التعبير عنها في الأنسجة التي المضيف البعوض وتتفاعل العوامل المسببة للأمراض، والأجهزة المعنية في استنساخ ذات أهمية كبيرة لوضع استراتيجيات للحد من ينقله البعوض وانتقال المرض وعرقلة التنمية البيض. وقد تم استخدام عدد من الأدوات اللازمة لدراسة والتحقق من صحة تنظيم الزمنية وأنسجة محددة في التعبير الجيني. هنا، نحن تصف البروتوكولات التي وضعت للحصول على المعلومات المكانية، والتي تعزز فهمنا لل، حيث يتم التعبير عن جينات معينة وتتراكم منتجاتها. وقد تم استخدام بروتوكول للتحقق من صحة وصف التعبير وتحديد أنماط تراكم من النصوص في الأنسجة المتصلة الذي ينقله البعوض ناقل للمرض، مثل الغدد اللعابية للإناث، وكذلك المقصورات التحت خلوية من المبيض والأجنة، والتي أعيدفي وقت متأخر لتكاثر البعوض والتنمية.

الإجراءات التالية تمثل المنهجية الأمثل أن يحسن كفاءة مختلف الخطوات في هذا البروتوكول من دون خسارة للإشارات تهجين هدف محدد. المبادئ التوجيهية لإعداد مسبار الحمض النووي الريبي، وصفت تشريح الأنسجة الرخوة وإجراءات عامة لتثبيت والتهجين في الجزء ألف، في حين ترد تفاصيل الخطوات المحددة لجمع وتثبيت، قبل التهجين والتهجين للأجنة البعوض في الجزء باء.

Protocol

A. التهجين في الموقع لالأنسجة الرخوة: الغدد اللعابية والمبايض البعوضة

وترد وصفات لحلول والمخازن اللازمة لأغراض الاجراءات التالية في الجدول رقم 1.

1. الحمض النووي الريبي التحقيق إعداد وتحليل نوعية

1. الاشعال التصميم لPCR تضخيم الهدف نسخة من الفائدة. فمن المستحسن أن amplicon هو ≥ 600 النيوكليوتيدات في الطول، والأهم من ذلك أن تسلسل amplicon هي فريدة من نوعها على نص الهدف. يتم تجنب متواليات التي ليست فريدة من نوعها،، للقضاء على احتمال توليد عبر التفاعل تحقيقات الحمض النووي الريبي.
2. استنساخ للمنتج PCR في ناقلات pCR4-TOPO، أو ما شابه ذلك ناقلات الاستنساخ. الموجه استنساخ pCR4-TOPO يحتوي T7 و T3 فتيلة بوليميريز مواقع الحمض النووي الريبي التي تمكن من إنتاج كل من الحس والعقاقير منتجات النسخ الاعادة من استنساخ واحدة.
3. تسلسل amplicon المستنسخة للتحقق من تسلسل FIDelity والتوجيه داخل بلازميد ناقلات.
4. إجراء رد فعل خلاصة القيد مع انزيم مناسب لانتاج العقاقير في الناتج النسخ المختبر. يرصد الخطية البلازميد مباشرة عن طريق تحديد موقع تقييد تقع في منطقة استنساخ متعددة من ناقلات pCR4-TOPO مثل أنا جمعية مهندسي البترول، PST أنا أو لا أولا تأكد من أن الموقع قيد المختارة غير موجودة في جزء مستنسخ. ويمكن استخدام استنساخ نفسه لتوليد تحقيق RNA الحس حبلا، التي هي بمثابة السيطرة الخلفية. وينبغي أن التهجين في الموقع مع لجنة التحقيق بمعنى إعطاء إشارة ضئيلة أو معدومة، إذا ما قورنت إلى أن لجنة التحقيق العقاقير التكميلية.
5. التحقق من هلام إستشراد التي يتم الخطي تماما استنساخ pCR4-TOPO.
6. تنقية الحمض النووي بلازميد خطي قبل تنفيذ عملية استخراج الفينول، كلوروفورم، تليها هطول الأمطار الايثانول. عندما عجل البلازميد فمن المستحسن استخدام تناسق النهائيحصة من 2 خلات الأمونيوم M مع 2.5 مجلدات من الايثانول للحد من المرحل من الملح المتبقي في رد فعل في النسخ المختبر.
7. إعداد digoxigenin (DIG) المسمى واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي التحقيق عن طريق إجراء جولة الاعادة في رد فعل النسخ المختبر، وذلك باستخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي للبلازميد خطي كقالب. إعداد رد فعل مع بوليميريز الحمض النووي الريبي، عازلة النسخ وحفر مزيج العلامات RNA كما وصفها تعليمات الشركة الصانعة.
8. تنقية DIG المسمى، في منتجات النسخ المختبر عن طريق الترسيب الإيثانول وresuspend الحمض النووي الريبي مكعبات في DEPC المعالجة الماء المقطر.
9. التحقق من الجودة والوزن الجزيئي المتوقعة لتحقيق تنقية الحمض النووي الريبي DIG المسمى من قبل الكهربائي للهلام الفورمالديهايد. ويمكن تقسيم لجنة التحقيق في الحمض النووي الريبي استعدادا aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.

2. تشريح الغدد اللعابية والمبايض البعوضة

1. تشريح glan اللعابية البعوضDS باستخدام مسبار وملقط كما هو موضح سابقا ل AE. بعوض. للحصول على ^1،2. ويمكن تشريح الغامبية، الغدد اللعابية كما هو موضح ل AE. بعوض، أو بدلا من ذلك على النحو المبين في طرق MR4 لالأنوفيلة البحث اليدوي. ³
2. تشريح المبيض البعوض باستخدام ملقط كما هو موضح سابقا ل AE. بعوض. ⁴ باختصار، استخدم زوج واحد من ملقط لفهم القفص الصدري، في حين أن آخر زوج من ملقط ينطلق الجزء ما قبل الأخير في البطن لاطلاق سراح المبيضين.
3. جمع تشريح الغدد اللعابية أو المبايض في ريبونوكلياز خالية Ambion 1،5 أنابيب microfuge مل يحتوي على 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
4. الحفاظ على العينات في الثلج حتى تثبيت.

3. تثبيت

1. إصلاح الأنسجة في تشريح طازجة ومحضرة الأنسجة الرخوة حل تثبيت (الجدول 1) في درجة حرارة الغرفة مع تمايل لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. يتم تحضير محلول تثبيت جديدة لمنع oxidatايون من مثبت الفورمالديهايد. من المستحسن تثبيت ل1-1،5 ساعة عن الغدد اللعابية. ويوصى حد أدنى لحجم 1 مل لإصلاح الأنسجة في أنبوب 1،5 مل microfuge.
2. السماح للأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب microfuge. هذه خطوة مهمة، والذي يتبع كل التغييرات من الحلول في البروتوكول، وسيقلل من خسارة كبيرة عينة.
3. صب الحل تثبيت بواسطة pipetting حذرا، وترك 50-100 ميكرولتر من وحدة التخزين في أنبوب microfuge ثم يغسل 3 ×، 5 دقائق مع كل PBT.
4. خطوات موازنة اختياري لتخزين الأنسجة. متدرج شطف خارج PBT مع إما الإيثانول أو الميثانول. تنفيذ تدريجي يغسل مع PBT / الكحول (3:1، 1:1 و 1:3، 5 دقائق لكل منهما). متجر في 100٪ (200 إثبات) الكحول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ويمكن تخزين الأنسجة لعدة أشهر دون تدهور الترآيب الدقيق للأنسجة. قبل تنفيذ الخطوات اللاحقة من البروتوكول، يجب أن تعاد إلى الأنسجة PBT بواسطة موازنة متدرج مع الكحول / PBT (3:1، 1:1،01:03، 5 دقائق لكل منهما).
5. أداء PBT يغسل 3 ×، 5 دقائق لكل منهما.
6. نفذ عملية الهضم من البروتين مع بروتين 0،01 دقيقة ملغ / 5 مل ك / PBT، في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، إذا ما المطلوب على حد سواء immunolocalization الأهداف البروتين والتهجين في الموقع من الحمض النووي الريبي، ويمكن تحضين المبيضين مع الأسيتون 80٪ / H O ₂ في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة بدلا من معالجة مع K. بروتيناز
   تم حذف بروتين كاف لإعداد علاج الغدد اللعابية. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 3.10.
7. صب على الفور حل الهضم بواسطة pipetting دقيق. غسل × 2، 5 دقائق مع كل الجليد الباردة PBT لوقف عملية الهضم.
8. PBT إضافية أداء يغسل × 2، 5 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة.
9. في الأنسجة الرخوة حل آخر تثبيت إصلاح، في درجة حرارة الغرفة مع تمايل لمدة 30 دقيقة. لم يتم تنفيذها بعد تثبيت الخطوات الغدد اللعابية.
10. أداء PBT يغسل 5 ×، 5 دقائق لكل منهما.

4. تهجين

1. صب قدر Hyb / PBT ممكن. إضافة 1 مل من Hyb في كل أنبوب العينة.
2. التفاف أنبوب عينة مختومة في جو التعبئة والتغليف واقية (فقاعة التفاف) ومكان داخل زجاجة التهجين. ختم زجاجة مع تهجين غطاء زجاجة.
3. لا يمكن أن يؤديها قبل التهجين والتهجين خطوات بسهولة في فرن التهجين. نفذ قبل التهجين في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوران.
4. إتاحة الوقت الكافي للأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب microfuge، كما Hyb أكثر كثافة من PBT. صب بعناية الحل قبل التهجين. قد تصبح الأنسجة شفافة ويصعب تصور. ويمكن تقليل فقدان عينة من خلال ترك 50-100 ميكرولتر من حجم حل في كل أنبوب العينة.
5. إضافة 50 ميكرولتر من حجم Hyb في أنبوب عينة والحفاظ في كتلة الحرارة في 55 درجة مئوية.
6. تفسد لجنة التحقيق في الحمض النووي الريبي درجة مئوية (85) ل5-10 دقيقة. على الفور، ووضع مسبار التشويه والتحريف على الجليد لمدة 5 دقائق.
7. ماصة التحقيق الحمض النووي الريبي في أنبوب العينة. سيقوم المسبار RNA تطفو الى السطح من Hyb. مزيج من قبل عبها الأنبوب بلطف.
8. إجراء التهجين في الحجم الكلي لل50-100 ميكرولتر من Hyb لكل عينة. احتضان هذه العينات في رفوف microfuge ثابت داخل فرن التهجين، أو في رفوف microfuge أنبوب العائمة في حمام مائي، عند درجة حرارة 55 مئوية لمدة 16-24 ساعة.

5. ريبونوكلياز والعلاج

1. إزالة Hyb التي تحتوي على لجنة التحقيق. من المهم للحفاظ على عينات في 55 درجة مئوية خلال خطوات للحد من غسيل غير محددة وملزمة للمسبار غير منضم المتبقية. إذا تم تهجين عينات عدة، فمن المستحسن للحفاظ على أنابيب العينات في كتلة والحرارة التي وضعت في 55 درجة مئوية للحفاظ على درجة الحرارة في جميع أنحاء تهجين خطوات الغسيل.
2. إجراء غسيل سريع مع Hyb بواسطة pipetting 1 مل من المحلول في حوض microfugeه وعكس نموذج أنبوب 5-6 مرات.
   يتم تنفيذ جميع يغسل لاحق سريع في البروتوكول وكذلك عن طريق إضافة الحل المطلوب وعكس أنبوب عينة عدة مرات.
3. إجراء عمليتين يغسل إضافية مع Hyb عند 55 درجة مئوية، 30 دقيقة مع كل دوران في الفرن التهجين.
4. تتوازن في PBT التي تفرخ في درجة حرارة الغرفة مع Hyb / PBT (1:1) لمدة 15 دقيقة مع تمايل.
5. أداء PBT يغسل 5 ×، 5 دقائق لكل منهما.
6. إعداد ريبونوكلياز الطازجة منطقة عازلة. أداء ريبونوكلياز والعلاج بواسطة تفرخ في 20 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A / PBT عند 37 درجة مئوية، لمدة 30 دقيقة. وسوف ريبونوكلياز يشق على الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل واحد ويؤدي إلى تدهور مسبار RNA الغير مهجنة.
7. صب ريبونوكلياز مخزن مؤقت وإجراء غسيل سريع مع PBT.
8. أداء PBT يغسل 3 ×، 5 دقائق لكل منهما.

6. الأجسام المضادة الحضانة

1. اعداد جديدة عرقلة حل (5٪ مصل الدجاج / 1٪ الغربية حجب الكاشف / PBT) العينات وكتلة بواسطة incubaتينغ في 1 مل من محلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تمايل.
2. إضافة 200 ميكروليتر من تخفيف 1:1000 المضادة للDIG القلوية الفوسفاتيز (ا ف ب)-مترافق الأجسام المضادة في عرقلة الحل. في احتضان درجة مئوية 4، وبين عشية وضحاها مع تمايل.

7. فسفاتاز قلوية تلطيخ

1. إزالة الأجسام المضادة وعرقلة حل.
2. إجراء غسيل سريع مع PBT.
3. PBT إضافية أداء يغسل × 5، 10 دقيقة لكل منهما. بدلا من ذلك يمكن غسلها العينات 3X، كل 10 دقيقة يعقبه غسيل الموسعة في 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها مع تمايل.
4. اعداد جديدة عازلة تلطيخ AP.
5. إجراء غسيل سريع مع عازلة تلطيخ AP.
6. أداء يغسل إضافية مع عازلة تلطيخ ا ف ب 3 ×، 5 دقائق مع كل تمايل.
7. يعد، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، طازجة حل تلطيخ AP تحتوي على NBT الركيزة ا ف ب / BCIP.
8. احتضان كل عينة مع 500 ميكرولتر من حل تلطيخ AP في درجة حرارة الغرفةه مع تمايل، في الظلام. ويمكن تحضين العينات من خلال تغطية الأنابيب مع وعاء غير شفاف أو رقائق الألومنيوم. وينبغي رصد رد فعل كل دقيقة تقدم 1-2 لتشكيل راسب الأرجواني. وهذا يتوقف على تركيز التحقيق، وتركيز الحمض النووي الريبي وجود هدف غير محدد الأهداف، ويجوز للتلطيخ والمضي قدما لعدة دقائق إلى عدة ساعات.
9. إزالة أكبر قدر من الحل تلطيخ ممكن. نتائج غير مرضية الصفق في تشكيل يعجل نديفة أبيض خلال خطوات غسيل لاحقة.
10. تم إيقاف تلطيخ تماما قبل تنفيذ 2 يغسل سريع مع PBT.
11. PBT إضافية أداء يغسل 3 ×، 5 دقائق لكل منهما.

8. الجلسرين تركيب

1. استخدام واسع تتحمل 200 رأس ماصة ميكرولتر، بنقل العينات من أنابيب microfuge في آبار مستديرة أسفل فرد من لوحة بقعة بيركس.
2. إزالة بعناية من العينة قدر من PBT ممكن.
3. ماصة على أعلى من الجلسرين العينة 70٪ / H ₂ O. تسمح الجلسرين إلى تتخلل نسيج عينة في درجة مئوية 4، بين عشية وضحاها. علاج الجلسرين يمنع جفاف الأنسجة أثناء تركيب الشرائح.
4. إعداد الشرائح المجهر من قبل مسح سطح شريحة نظيفة مع Kimwipes. تطبق على الشريحة إلى قطعتين من الشريط غير مرئية موازية لبعضها البعض بحيث تشكل قناة ضيقة (الشكل 2).
5. باستخدام فرشاة الفنية، والتقاط عينات واحدة تلو الأخرى ووضعها على طول القناة، وتحديد المواقع كل عينة مع التوجه نفسه، وفيما يتعلق التحالفات الأمامي / الخلفي وظهري / بطني.
6. بعد تحديد المواقع في كل عينة، واستخدام مسحة Kimwipe لامتصاص فائض حل الجلسرين المحيطة الأنسجة (الشكل 3). إزالة الجلسرين الزائد المهم منع تشكيل فقاعات، وعندما ختم العينات التي شنت على الشريحة تحت غطاء زلة.
7. مركز والمكان بعناية ACأكثر من التسلل عبر قناة تحتوي على عينات من الانحياز. يضعوا غطاء ينزلق semipermanently على الشريحة بواسطة اللمس زوايا زلة غطاء مع طلاء الأظافر الشفاف.
8. باستخدام pipettor 200 ميكروليتر، الاستغناء ببطء إلى واحدة من نهاية قناة يكفي 70٪ الجلسرين لملء بواسطة عمل شعري كامل المساحة للقناة والمنطقة تحت غطاء زلة.
9. ختم العينات التي شنت بشكل دائم من خلال تطبيق طلاء الأظافر على طول جميع الجوانب الأربعة للانزلاق الغطاء. السماح لطلاء الأظافر حتى يجف بما فيه الكفاية قبل الشروع في تصوير الأنسجة كامل جبل المهجنة. فمن المستحسن لتصوير الصور من العينات مباشرة بعد التركيب.

B. التهجين في الموقع لأجنة البعوضة

يتم وصف الحلول والمخازن اللازمة لتهجين في الموضع الطبيعي للأجنة البعوض (جدول 1). تم تعديل وتثبيت تهجين الإجراءات المعروضة هنا من thosه أول تقرير عن أنوفيليس غامبياي، ^5،6 الزاعجة المصرية ⁽⁷⁾ والخماسية الكيولكس. ⁸

1. جنين مجموعة

1. يتم جمع الأجنة من 300 تزاوج، البعوض البالغ الإناث (سمح لتتزاوج مع الذكور لمدة 48 ساعة و 3 أيام بعد ظهور) 72 ساعة بعد تغذية الدم. يتم الحفاظ على البعوض في 3 حل السكروز م، من أجل منع وضع البيض قبل فترة جمع المقصود.
2. إعداد حاويات جمع الجنين بواسطة المصفوفة على 16 أوقية. كوب ورقة مع Saatilene هايتك شبكة بحيث يتم تغطية السطح داخل الكأس تماما. يمكن اضافته للشبكة باستخدام الأساسية واحدة. استخدام هذا يقلل بدرجة كبيرة من الملوثات شبكة ليفي التي تكون موجودة في حال استخدام Whatman مرشح ورقة، أو المناشف الورقية.
3. ملء حاوية نصف ممتلئة بالماء المقطر.
4. يتم جمع الأجنة ل1 ساعة عن طريق وضع حاويات خاصة لجمع في القفص، والتي تتناول في وقت لاحقبواسطة قطعة قماش داكن لتحفيز وضع البيض.
5. ويسمح للأجنة التي تم جمعها إلى أن تنضج لمراحل النمو المطلوب خارج قفص في ظروف تربية القياسي (الرطوبة النسبية 85٪ / 26 درجة مئوية). ويمكن ربط نضوج الأجنة إلى مراحل مختلفة إلى وقت (ساعة بعد وضع البيض) في أعقاب الدورة التنموية الوقت التقريبي للأحداث الجنينية صفها (الجدول 2). ووصف ^9،10 الأنوفيلة الغامبية هذا يلخص الجدول الأحداث الكبرى في التطور الجنيني للبعوض الزاعجة المصرية، التي أبلغ عنها Raminani وCupp، أول من ايفانوفا ^Kazas-11 وبمزيد من التفصيل Goltsev وزملاؤه، ^12،13 والباعضة الخماسية الخطوط التي أبلغ عنها ديفيس. ⁽¹⁴⁾ وتهدف الدورات مرة ووصف لتكون بمثابة التقديرات الأولية، بدلا من نقاط زمنية مطلقة، لجمع الأجنة في مراحل معينة من التنمية.

2. Dechorionation، التثبيت، وEndochoriعلى التعطيل

1. نقل الأجنة من الحاوية جمع في أنبوب شبكة Saatilene الصيد dechorionation (الشكل 3).
   للأجنة الزاعجة، ووضع أنبوب الصيد في كأس مليء بالماء المقطر بما فيه الكفاية بحيث حجم أنبوب الصيد هو واحد ونصف كامل. يمكن استخدام الفرشاة الفنية لإخراج الأجنة من شبكة Saatilene وتحويلها الى المياه المليئة أنبوب الصيد.
   للأجنة الأنوفيليس، فصل شبكة Saatilene من حاويات خاصة لجمع وطوى شبكة بعناية لتشكيل قمع. عقد قمع شبكة بيد واحدة، واستخدام من ناحية أخرى إلى الاستغناء عن الماء المقطر من خلال البولي ايثيلين زجاجة بخ على طول الجانبين من قمع لغسل الأجنة في أنبوب الصيد. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لأجنة الأنوفيلة لأنها تفتقر إلى مادة لاصقة موجودة على سطح الأجنة الزاعجة، والتي تمكن البيض التمسك ركائز وضع البيض.
2. العلاقات العامةepare 40 مل من محلول dechorionation (1 هيبوكلوريت الصوديوم 5.25٪ حجم: 3 مجلدات من الماء المقطر). صب الحل في طبق بيتري 100 ملم.
3. إعداد كوب 100 مل تحتوي على 50 مل من الماء المقطر وتوضع جانبا. الخطوة dechorionation غير حساسة للوقت والتالية مباشرة العلاج هيبوكلوريت الصوديوم وسوف تكون مغمورة الأجنة في هذه المياه، لتمييع الحل dechorionation.
4. Dechorionate الأجنة في الأنبوب قبض على شبكة من خلال وضع أنبوب في طبق بيتري مليئة حل dechorionation. تستخدم لنقل مادة البولي ايثيلين المتاح ماصة أو ماصة باستير لغسل الأجنة، في حين يحوم القارورة الصيد حتى يتسنى للأجنة تبقى مغمورة وتحريكها في حل dechorionation.
   مطلوب الحد الأقصى من 35 ثانية لdechorionation الأجنة الزاعجة، في حين أن 75 ثانية كافية لالأنوفيلة والأجنة الكيولكس (الجدول 3). Dechorionation هي واحدة من أكثر الخطوات حساسية في بروتocol والإفراط في توسيع نطاق العلاج الصوديوم هيبوكلوريت، على وجه التحديد سوف لأجنة الزاعجة منع تكسير السليم للالمشيماء.
5. على الفور غمر القارورة الصيد في الكأس التي تحتوي على الماء.
6. يغسل الحل dechorionation المتبقي من الأجنة عن طريق إزالة أنبوب الصيد من الكأس مملوءة بالماء والشطف على الجدران الداخلية والخارجية من الأنبوب الصيد بالماء المقطر من زجاجة بخ أو صنبور مزودة الأنابيب.
7. يمكن التحقق منها من خلال وضع تصور Dechorionation الأجنة مع مجهر تشريح في تكبير منخفضة. Dechorionated الزاعجة الأجنة تفتقر إلى مشيماء أديمية ظاهرة تشبه المعاوضة وفقط على نحو سلس، سطح لامع للباطنة المشيماء الأسود هو واضح بالنسبة للأجنة الأنوفيلة dechorionated، يطفو exochorionic والهياكل ريدج غائبة (الشكل 4).
8. باستخدام فرشاة الفنية، ونقل الأجنة dechorionated إلى قارورة تحتوي على التلألؤ 5 مل من WA مقطرثالثا (الشكل 5-1). إذا ويجري حاليا إعداد نماذج متعددة، والحفاظ على أنابيب الصيد في الماء لمنع الجفاف من الأجنة.
9. السماح للأجنة تسوية على قاعدة قارورة التلألؤ وإزالة مثل الكثير من المياه من قارورة ممكن.
10. أضف 5 مل من هيبتان في قارورة التلألؤ (الشكل 5-2). إزالة أي المياه المتبقية التي لا تزال في قارورة التلألؤ.
11. إضافة إلى مل التلألؤ 5 قارورة من طازجة ومعدة الجنين حل تثبيت (الجدول 1).
12. إصلاح الأجنة لمدة 30 دقيقة مع انعكاس ذلك أن مراحل العضوية ومائي مزيج دقيق، ولكن ليس بقوة.
13. إزالة تثبيت الحل باستخدام ماصة باستير الزجاج، والحرص على عدم تعكير صفو الطور البيني، الذي يحتوي على الأجنة (الشكل 5-3).
14. يغسل الحل تثبيت المتبقية عن طريق ملء قنينة التلألؤ مع الماء المقطر إلى أقصى حد ممكن. عكس القارورة 5 مرات وثم إزالة كل من الماء المقطر.
15. ملء قارورة التلألؤ مع 20 مل من الماء المقطر، ومزيج من قارورة وقلب لمدة 30 دقيقة.
16. إزالة جميع المياه من قارورة التلألؤ.
17. إضافة ما يكفي من الماء المقطر المغلي في قارورة التلألؤ حتى يتسنى للمرحلة غير العضوية هيبتان تصل إلى رأس القنينة.
18. احتضان لمدة 30 ثانية ثم قم بإزالة كل من الماء المغلي.
19. إضافة جليد الماء المقطر الباردة حتى مرحلة غير العضوية يصل إلى الجزء العلوي من القارورة. احتضان القارورة في الثلج لمدة 10 دقيقة.
20. أولا إزالة مراحل مائي ومن ثم العضوية. سوف تظهر هيبتان مبهمة في هذه الخطوة (الشكل 5-4).
21. أضف 5 مل من هيبتان جديدة في قارورة. إزالة جميع المياه المتبقية من القارورة.
22. أضف 5 مل من الميثانول في قارورة. دوامة القارورة 1-2 مرات بقوة، دون أن تهتز (الشكل 6). إذا ما اهتزت غير العضوية مراحل الميثانول هيبتان والعضوية بشدة الأجنة وايسوف يتم تدميرها خلال تمزق باطنة المشيماء. من الجدير بالذكر أن نذكر أن لاحظنا الاختلاف في كفاءة تعطيل باطنة المشيماء لسلالات مختلفة من الأجنة الزاعجة المصرية.
23. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. خلال هذه المرحلة، والمراحل أصبح عكر بسبب الافراج عن عناصر صفار البيض (الشكل 5-5).
24. إزالة كل مراحل العضوية وغير العضوية، ويغسل مع الميثانول 3 مرات لإزالة جميع هيبتان المتبقية.
25. ويمكن تخزين الأجنة في الميثانول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.

3. تقشير

1. وضع قطعة من الشريط الشعر المستعار على الوجهين في وسط طبق بيتري 3 سم. يتم استخدام الشعر المستعار شريط لاصق لأنه غير مستقر في ظل وجود الميثانول والايثانول.
2. باستخدام تجويف كبير (حوالي 3 مم القطر) 200 رأس ماصة ميكرولتر، نقل الأجنة من الميثانول على الشريط على الوجهين.
3. السماح 1-2 دقيقة للأجنة لتسوية وADHيحرث على سطح الشريط.
4. فائض الميثانول صب والسماح للسطح ليجف قليلا لمدة 1-2 دقيقة.
5. إضافة 4 مل من 95٪ (190 إثبات) الايثانول في طبق بيتري.
6. ماصة 600 ميكروليتر من الماء المقطر في الإيثانول ودوامة لخلط. وسوف يصبح الشريط مبهمة في اللون. وبالإضافة إلى ذلك من الماء المقطر يؤدي الشريط ليصبح مبتذل وجمد الأجنة أثناء تقشير. ويمكن حذف هذه الخطوة إذا كان المطلوب.
7. استخدام إبرة قياس 27.5 تعلق على برميل حقنة 1 مل إلى قشر قبالة باطنة المشيماء متصدع (الشكل 7). بعد الإفراج عن الجنين أبيض من بقايا باطنة المشيماء الأسود، ونقل الأجنة من الشريط إلى خزان الايثانول من طبق بيتري باستخدام فرشاة غرامة غيض الفنية. باستخدام نصيحة 3 ملم تتحمل ماصة، ونقل الأجنة الى Ambion 1.5 أنبوب microfuge مل تحتوي على 500 ميكرو لتر من الايثانول دليل 200.
   ينبغي للأجنة مقشر لا تبقى على الشريط لفترة طويلة من الزمن لأنها قد تقيد فيmanently إلى الشريط.
8. نفذ 2-3 يغسل سريع مع 100٪ (200 إثبات) الايثانول وتخزين الأجنة في الإيثانول بدقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ويمكن تخزين الأجنة مقشر في -20 درجة مئوية لمدة بضعة أشهر دون أن يؤثر ذلك التشكل أو إشارة تهجين لاحق.

4. توضيح من المح

1. إجراء غسيل سريع مع الايثانول دليل 200. وينبغي أن تستخدم الإيثانول بدقة لجميع الخطوات اللاحقة وغسيل لإعداد حل ف الزيلين توضيح صفار البيض.
2. إجراء واحد يغسل الإيثانول، 5 دقائق مع تمايل.
3. في احتضان P-xylene/ethanol (9:1) في درجة حرارة الغرفة ل1-1،5 ساعة مع تمايل. الخطوة الزيلين يسمح توضيح من كتلة صفار البيض لتعزيز إشارة إلى نسبة الضوضاء.
4. إزالة حل الزيلين الإيثانول وإجراء عمليتين يغسل سريع مع الايثانول.
5. إجراء واحد يغسل الإيثانول، 5 دقائق مع تمايل.
6. إجراء عمليتين يغسل سريع مع الميثانول، والميثانول تليها غسل واحد، 5 دقائق معتمايل.
7. تتوازن إلى 4٪ الفورمالديهايد تثبيت حل عن طريق الغسيل مرة واحدة مع حل تثبيت الميثانول / الفورمالديهايد (1:1).

5. تثبيت والتهجين في الموقع

تثبيت والتهجين في الموضع إجراءات مماثلة لتلك التي وصفها في بروتوكول القسم A.

الممثل جيم النتائج

وصف التهجين في بروتوكول الموقع هنا، والنتائج في أنماط تلطيخ الملونة التي تشير إلى وجود وتوطين مرنا المستهدفة. من المهم التأكيد على أنه لا يمكن المستويات النسبية من وفرة نص تحددها التهجين في الموقع. نتائج تهجين تعتمد على لجنة التحقيق مرنا المحددة المستخدمة لإجراء التهجين، وفرة من الهدف مرنا في النسيج المهجنة، فضلا عن تركيز التحقيق ودرجة الحرارة التهجين. مقارنة بين الأنسجة تهجين مع العقاقير وما يقابلها من تحقيقات مرنا بمعنى تجعل من الممكن تفسير دقيق لأنماط تلطيخ.

التهجين في الموقع من كل جبل الغدد اللعابية للبعوض الزاعجة الإناث مع تحقيقات مرنا أن amylase1 الهدف (AAEL006719)، D7s2 (AAEL006423)، وD7L2 (AAEL006424) إلى تراكم هذه النصوص في القريب الاطراف، الاطراف البعيدة، والبعيدة، الفص الجانبي / وسطي، على التوالي (الشكل 8). تم تهجين الجامعة ¹ جبل المبيض من أنواع البعوض الثلاثة مع تحقيقات مرنا التي تستهدف على وجه التحديد للنصوص المعنية orthologous من أوسكار (الشكل 9). ^7،8 التهجين في الموقع من كل جبل الأجنة من AE. بعوض، وهي. الغامبية و Cx. تم تنفيذ الخماسية باستخدام العقاقير تحقيقات الحمض النووي الريبي استهداف أوسكار البعوض النصوص orthologous منهما (الشكل 10). ^7،8

igure 1 "SRC =" / files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg "/>
الشكل 1. رسم تخطيطي للتهجين ما بعد تصاعد مجموعة المتابعة.

الشكل 2. إعداد ممسحة Kimwipe التي استخدمت خلال عينة في تصاعد مستمر. والملتوية والأنسجة Kimwipe بإحكام لإنتاج ممسحة غرامة ذات الرؤوس لامتصاص فائض متوسطة متزايدة من العينات والشرائح.

الشكل 3. التخطيطي من dechorionation Saatilene شبكة أنبوب الصيد. A) هو قطع الجزء السفلي من أنبوب مل البوليسترين 50 مخروطي من أن تسفر عن أنبوب مجوف 4.5 سم في الطول، ومفتوحة في كلا الجانبين. يحدث قطع لفتح دائري من غطاء أنبوب مخروطي الشكل للسماح لسائل لغسلها من خلال قطعة 6.5 ² سم مربع من شبكة Saatilene. من مواضيع 330 في البوصة، 34 الموضوع قطرها ميكرون شاشة شبكة يحتفظ الأجنة البعوض. ب) الحمارembled قبض على أنبوب.

الشكل 4. الزاعجة المصرية والأنوفيلة الغامبية البيض، قبل وبعد dechorionation. A) الزاعجة بيض بعوض قبل dechorionation. ومشيماء أديمية ظاهرة معشقة مثل الشبكة تقع فوق باطنة المشيماء السوداء ويعطي مظهر البيض بمادة (تكبير الشكل). بعد إزالة مشيماء أديمية ظاهرة، إلا أن باطنة المشيماء على نحو سلس ومصقول يبقى (توسيع باء والشكل). C) من البيض أنوفيليس غامبياي قبل dechorionation. هياكل مشيماء أديمية ظاهرة مثل العوامات مرئية (سهام). D) وسطح أملس ومصقول من باطنة المشيماء مرئيا بعد dechorionation. بار = 100 ميكرون.

الشكل 5. وكانت سلسلة من خطوات متعاقبة لتثبيت وتعطيل باطنة المشيماء من AE. بيض بعوض. A) مميل أمامي رأيوباء) الاطراف نظرا لقارورة تحتوي على عزت التلألؤ. بيض بعوض خلال خطوات متتابعة من تثبيت وتعطيل باطنة المشيماء. 1) الأجنة في الماء المقطر. 2) الأجنة تعوم في الطور البيني بين المرحلة هيبتان العلوي والسفلي المرحلة المائية. 3) تثبيت ما يلي الأجنة حزمة معا في كتلة مستديرة. الاجنة لا تزال في الطور البيني بين مراحل حل هيبتان ومثبت. 4) بعد العلاج مع الماء المغلي وحضانة في الجليد، ومرحلة هيبتان عتامة قليلا. 5) تظهر الأجنة مع endochorions تعطلت في الطور البيني بين مرحلة 1 هيبتان غير واضحة وشفافة مرحلة الميثانول.

الشكل 6. تعطل باطنة المشيماء من AE ثابت. بيض بعوض. A) وفور نشيط دوامات من هيبتان ومراحل الميثانول، ويمكن تشكيل فقاعات، وتعطيل للباطنة المشيماء تصور. B) Followiنانوغرام خمس دقائق من الحضانة، في درجة حرارة الغرفة.

الشكل 7. البعوض البيض بعد انقطاع وإزالة باطنة المشيماء. البيض من AE. بعوض (A)، و. الغامبية (B) و Cx. الخماسية (ج) عقب تثبيت وتعطيل للباطنة المشيماء. ويمكن رؤية بيضاء، شفافة الأجنة داخل باطنة المشيماء متصدع. بعد إزالة باطنة المشيماء، الأجنة شفافة من AE. بعوض (D)، و. الغامبية (E) و Cx. الخماسية (F) هي واضحة للعيان. بار = 100 ميكرون.

الرقم 8. التهجين في الموقع لمدة ثلاثة جينات التي أعرب عنها في فصوص مختلفة من جبل لكامل، عزت الإناث. الغدد اللعابية بعوض. تلطيخ يدل على توطين وتراكم amylase1 (AAE L006719) (A)، D7s2 (AAEL006423) (B) وD7L2 (AAEL006424) (B). بار = 100 ميكرون.

الشكل 9. التهجين في الموقع لأوسكار تحقيقات البعوض RNA العقاقير إلى البويضات البعوض كل جبل وخلايا الممرضة. مرحلة البويضات الرابع (شركة النفط العمانية) تشريح من المبيض ل. الغامبية (A)، AE. بعوض (B) و Cx. الخماسية (C)، وتهجين مع تحقيقات الحمض النووي الريبي التي تستهدف كل منها mRNAs أوسكار البعوض. الحويصلات الأولية موجهة مع الأمامي على اليسار. تلطيخ في القطب الخلفي (الأزرق رأس السهم) إلى تراكم mRNAs أوسكار. وتظهر الثانوية (F2) والثالثة (F3) بصيلات وتلطيخ (أسود رأس السهم) إلى تراكم مرنا أوسكار في ممرضة السيتوبلازم الخلية (NCC). وتستثنى من تلطيخ الممرضة نوى الخلايا (روز). شريط = 50 ميكرون.

ad/3709/3709fig10.jpg "/>
الرقم 10. التهجين في الموقع لأوسكار تحقيقات البعوض RNA العقاقير على الأجنة البعوض كامل جبل. الأجنة موجهة مع الأمامي على اليسار. الخلوية الأجنة مرحلة الأريمة ل. الغامبية (A) و Cx. الخماسية (C) وتهجين مع كل منها البعوض أنواع محددة تحقيقات الجيش الملكي النيبالي أوسكار. ب) مرحلة الأريمة المخلوي عزت. بعوض الأجنة المهجنة مع تحقيقات الحمض النووي الريبي استهداف عزت. بعوض أوسكار النص. تلطيخ هو واضح في خلايا القطب الخلفي للجميع الأجنة، مشيرا إلى توطين وتراكم مرنا أوسكار البعوض في هذه الخلايا. شريط = 50 ميكرون.

الجدول رقم 1. حلول ومخازن لتثبيت الفورمالديهايد هلام، والكهربائي والتهجين في الموقع.

ftp_upload/3709/3709table2.jpg "/>
الجدول 2. أحداث التنموي والملاحظات الشكلية المقابلة لمراحل متتالية خلال مرحلة التطور الجنيني البعوض.

الجدول 3. ملخص الاختلافات الرئيسية في مرحلة ما قبل تهجين خطوات لأنواع الأنسجة المختلفة.

Discussion

التهجين في بروتوكول تلطيخ الموقع واللونية المقدمة هنا لأنسجة البعوض كله جبل والأجنة هو تقنية مفيدة لتوطين النصوص داخل أجهزة معينة وأنواع الخلايا. هذه الإجراءات هي تحسنا طرقنا ذكرت سابقا، على حد سواء في تبسيط خطوات غسيل واسعة النطاق وتقديم التفاصيل التقنية ومصادر إضافية الكاشف.

في تجربتنا، والكشف عن الإشارات اللونية تهجين متفوقة في الحساسية وضوح إشارة تهجين مقارنة مع مخططات كشف مضان مقرها. وعلاوة على ذلك كشف اللونية تلتف حول القضايا المرتبطة تمييز إشارة في الأجنة، والتي هي بطبيعتها لصناعة السيارات في فلوري. القيود في الكشف عن إشارات التهجين يحدث، وعندما يتم استهداف منخفضة وفرة النصوص وتلوين الخلفية هو واضح. زيادة درجة الحرارة إلى 65 درجة تهجين تم العثور على C للحد من الخلفإشارات تهجين الأرض، ولكن ليست بديلا المقترحة لتصميم فريد هدف محدد تحقيقات الحمض النووي الريبي.

وقد استخدم هذا البروتوكول لأداء التهجين في الموقع من كل جبل الغدد اللعابية للبعوض الزاعجة، والمبايض والأجنة من أنوفيليس غامبياي، الأنوفيلة stephensi، AE. بعوض الكيولكس والخماسية. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على أنسجة أخرى من البعوض، ويفترض من تلك الحشرات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، نحن لتجميع المبادئ التوجيهية للمرة الأولى مقارنة للانطلاق من التطور الجنيني في البعوض الحامل للمرض 3، AE. بعوض، وهي. الغامبية و Cx. fatigans. تم الإبلاغ عن الملاحظات لسلالات معينة من هذه الأنواع الثلاثة، في ظل ظروف تربية حصيف. من المهم أن نلاحظ أن دوام التنموية يمكن أن تختلف عن سلالات مختلفة من أنواع البعوض وتحت ظروف تربية مختلفة. التهجين في الملحق الموقع في الجهود الجارية لاناlyze في transcriptomes من البعوض والمفصليات الأخرى، ويجوز أن يقدم صورة أفضل للتنظيم التعبير الجيني في هذه الكائنات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
1M Tris-HCl	Ambion	AM9855G	pH8.0
10X PBS	Ambion	AM9625
20X SSC	Ambion	AM9763
1.5 ml microfuge tubes	Ambion	AM12400	Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Storage at 4 °C
DEPC water	Ambion	AM9932
Proteinase K	Ambion	AM2546
5.25% Sodium hypochlorite	Austin’s		A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus	Ambion	AM2733	Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase	Ambion	AM2082	Storage at -20 °C
95% Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
HPLC-grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M87-500
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-542A	18 x18 mm
N-Heptane	Fisher Scientific	H350-1
P-xylene	Fisher Scientific	O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate	Fisher Scientific	13-748B	100x85 mm
Sodium chloride	Fisher Scientific	AC32730-0025
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape	Hair Direct	RED-75R12	Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli	Invitrogen	K457501 K457540	20 reactions 40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011	Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche Applied Science	1093274	Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix	Roche Applied Science	1277073	Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution	Roche Applied Science	1681451	Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent	Roche Applied Science	11921673001	Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130)	Saati Print	330.34 UO PW	330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol	Sigma	G6279-1	70% in PBT
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
Tween 20	Sigma	P1379-500
37% Formaldehyde	Ted Pella	18508	10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids	The Paper Company	SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap	VWR International	66022-128	20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material	VWR International	500018-081	10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum			Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.