הכלאה Published: June 28, 2012 doi: 10.3791/3709

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jennifer Juhn¹, Anthony A. James^1,2

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Summary

זמן ומרחב ביטוי ניתוח גנטי תפקיד מכריע גנומיקה תפקודית. כל הכלאה-Mount

Abstract

יתושים הם וקטורים עבור קבוצה מגוונת של פתוגנים כולל arboviruses, טפילים protozoan ו נמטודות. תמלילי חקירת ורגולטורים גנים באים לידי ביטוי ברקמות שבהן המארח יתושים אינטראקציה הפתוגן, וגם באיברים מעורבים ברבייה הם עניין רב על אסטרטגיות להפחתת יתושים העברת מחלות ולשבש פיתוח ביצה. מספר כלים להיות מועסק ללמוד לאמת את הרגולציה הזמני רקמות מסוים של ביטוי גנים. כאן, נתאר פרוטוקולים שפותחו כדי להשיג מידע מרחבי, אשר משפר את הבנתנו בו גנים מסוימים מתבטאים ומוצריהם לצבור. פרוטוקול המתואר נעשה שימוש כדי לאמת את הביטוי ולקבוע דפוסי הצטברות של תמלילי ברקמות הקשורים שידור יתושים הפתוגן, כגון בלוטות הרוק הנשי, כמו גם תאים subcellular של השחלות של העובר, אשר מחדשמאוחר רבייה התפתחות יתושים.

ההליכים הבאים מייצגים המתודולוגיה אופטימיזציה המשפר את היעילות של הפעולות השונות פרוטוקול ללא הפסד של יעד ספציפיים אותות הכלאה. הנחיות להכנת בדיקה RNA, דיסקציה של הרקמות הרכות ואת נוהל כללי של קיבעון ואת ההכלאה מתוארים חלק, ואילו צעדים ספציפיים לאיסוף, קיבעון, הכלאה טרום הכלאה של עוברים יתושים מפורטים חלק ב '

Protocol

הכלאה א 'באתרו של רקמות רכות: בלוטות הרוק יתוש ושחלות

מתכונים של פתרונות חוצצי הנדרשים הנהלים הבאים מתוארים בטבלה 1.

1. RNA Probe הכנה וניתוח איכות

1. Primers עיצוב ל-PCR להגביר את היעד תמליל של עניין. מומלץ amplicon הוא ≥ 600 נוקלאוטידים אורך ויותר מכך כי רצף amplicon ייחודי תמליל היעד. רצפים שאינם ייחודי נמנעים, כדי לשלול את האפשרות של יצירת חוצה תגובתי בדיקות RNA.
2. לשבט את המוצר PCR לתוך וקטור pCR4-Topo, או וקטור שיבוט דומה. וקטור pCR4-Topo שיבוט מכיל T7 ו T3 הייזום RNA פולימראז אתרים המאפשרים את ייצור תחושה והן antisense נגר מוצרים שעתוק של שיבוט אחד.
3. רצף amplicon משובטים כדי לוודא רצף fidelity והתמצאות בתוך פלסמיד וקטור.
4. ביצוע התגובה הגבלת תקציר עם האנזים מתאים לייצר antisense במוצר שעתוק במבחנה. לינאריזציה פלסמיד נעשה פשוט על ידי בחירת אתר הגבלת ממוקם באזור שיבוט כפולה של וקטור pCR4-Topo כגון SPE אני, PST אני או לא אני ודא כי האתר ההגבלה שנבחר אינו קיים בקטע משובטים. שיבוט אותו ניתן להשתמש בו כדי ליצור תחושה, בדיקה גדיל RNA, המשמשת בקרת הרקע. ההכלאה באתרם עם החללית תחושה צריך לתת אות קטנה או לא, בהשוואה לזה של החללית antisense משלימה.
5. אמת על ידי ג'ל אלקטרופורזה, כי שיבוט pCR4-Topo היא לינארית לחלוטין.
6. לטהר את הדנ"א פלסמיד לינארית על ידי ביצוע החילוץ פנול, כלורופורם, ואחריו משקעים אתנול. כאשר חנך את ה-DNA פלסמיד מומלץ להשתמש concent הסופימנה של אצטט M 2 אמוניום עם 2.5 כרכים של אתנול להפחית carry-over של מלח לתוך שארית בתגובה שעתוק במבחנה.
7. הכן digoxigenin (DIG), שכותרתו חד גדילי RNA על ידי ביצוע בדיקה נגר בתגובה שעתוק במבחנה, באמצעות 1 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד לינארית כתבנית. מכינים את התגובה עם RNA פולימראז, מאגר שעתוק RNA DIG תערובת תיוג כפי שתואר על ידי הוראות היצרן.
8. לטהר את DIG, שכותרתו, במוצרים חוץ גופית שעתוק על ידי משקעים אתנול resuspend את RNA pelleted במים DEPC שטופלו מזוקקים.
9. בדוק את איכות משקל מולקולרי הצפוי של בדיקה DIG-RNA שכותרתו מטוהרים על ידי ג'ל אלקטרופורזה פורמלדהיד. החללית מוכנה RNA ניתן לחלק aliquots ומאוחסנים ב -80 ° C עד השימוש.

2. דיסקציה של בלוטות הרוק ושחלות יתוש

1. לנתח glan הרוק יתושיםDS באמצעות בדיקה ו מלקחיים כפי שתואר קודם לכן עבור AE. aegypti. ^1,2 עבור. gambiae, בלוטות הרוק ניתן גזור כמתואר עבור AE. aegypti, או לחילופין שתואר על אנופלס מחקר ידנית את MR4 שיטות. ³
2. לנתח השחלות יתושים באמצעות מלקחיים כפי שתואר לעיל עבור AE. aegypti. ⁴ בקצרה, השתמש באחת זוג מלקחיים לתפוס את החזה, בעוד זוג מלקחיים מסיר את הקטע הלפני אחרון בטן לשחרר את השחלות.
3. איסוף בלוטות הרוק גזור או שחלות ב Ambion RNAse ללא 1.5 צינורות המכילים 50 מ"ל microfuge μl של PBS.
4. לשמור על דגימות קרח עד קיבעון.

3. מקבע

1. תיקון רקמות ניתוחים טרי שהוכן פתרון קיבעון רקמות רכות (טבלה 1) בטמפרטורת החדר עם nutation דקות 30-1 שעות. פתרון קיבעון מוכן טרי כדי למנוע oxidatיון של מקבע פורמלדהיד. קיבעון על 1-1.5 שעות מומלץ בלוטות הרוק. היקף מינימלי של 1 מ"ל מומלץ לתיקון רקמות בצינור מ"ל 1.5 microfuge.
2. אפשר להתיישב ברקמות לחלק התחתון של הצינור microfuge. זהו צעד חשוב, אשר עוקב אחר כל השינויים של פתרונות פרוטוקול יהיה למזער את אובדן מדגם משמעותי.
3. למזוג את הפתרון על ידי קיבוע pipetting זהיר, עוזב 50-100 μl נפח בצינור microfuge ולאחר מכן לשטוף × 3, 5 דקות כל אחד עם PBT.
4. איזון צעדים אופציונליות עבור אחסון רקמות. בשלבים לשטוף את PBT עם אתנול או מתנול. לבצע צעד חכם שוטף עם PBT / אלכוהול (03:01, 01:01 ו - 01:03, 5 דקות כל אחד). חנות ב 100% (200 הוכחה) אלכוהול ב -20 ° C. רקמות יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים ללא השפלה של ultrastructure רקמות. לפני ביצוע השלבים הבאים של פרוטוקול, רקמות יש להחזיר PBT ידי איזון בשלבים עם אלכוהול / PBT (03:01, 01:01,01:03, 5 דקות כל אחד).
5. בצע PBT שוטף 3 ×, 5 דקות כל אחד.
6. לבצע עיכול החלבון עם 0.01 דק 'מ"ג / מ"ל ​​proteinase 5 K / PBT, בטמפרטורת החדר. לחלופין, אם שני immunolocalization מטרות חלבונים הכלאה באתרו של RNA הם הרצוי, השחלות ניתן מודגרות עם אצטון 80% / H ₂ O ב -20 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במקום בטיפול עם proteinase ק
   טיפול proteinase K מושמט להכנת בלוטות הרוק. להמשיך ישירות לשלב 3.10.
7. מיד למזוג את הפתרון לעיכול על ידי pipetting זהיר. לשטוף 2 ×, 5 דקות כל אחד עם קר כקרח PBT להפסיק את פעולת העיכול.
8. PBT נוספת לבצע שוטף × 2, 5 דקות כל בטמפרטורת החדר.
9. לאחר לתקן בפתרון רקמות רכות קיבעון בטמפרטורת החדר עם nutation למשך 30 דקות. לאחר קיבוע השלבים לא מבוצעים על בלוטות הרוק.
10. בצע PBT שוטף 5 ×, 5 דקות כל אחד.

4. הכלאה

1. למזוג כמה Hyb / PBT ככל האפשר. הוסף 1 מ"ל של Hyb לתוך צינור כל דגימה.
2. לעטוף את צינור הדגימה באריזה אטומה אוויר המגן (בועת לעטוף) ומקום בתוך בקבוק ההכלאה. סוגרים את הבקבוק עם המכסה בקבוק ההכלאה.
3. צעדים מראש הכלאה ההכלאה ניתן לבצע בקלות בתנור ההכלאה. בצע הכלאה מראש על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם סיבוב.
4. לאפשר מספיק זמן הרקמות להתיישב אל החלק התחתון של הצינור microfuge, כמו Hyb הוא צפוף יותר PBT. בזהירות למזוג את הפתרון מראש ההכלאה. רקמות עשויה להפוך שקוף וקשה לדמיין. אובדן לדוגמא, ניתן להפחית על ידי השארת 50-100 μl נפח פתרון בצינור כל דגימה.
5. הוסף 50 μl נפח של Hyb לתוך הצינור מדגם ולשמור על גוש חום על 55 ° C.
6. לפגל בדיקה RNA על 85 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. מיד למקם את החללית מפוגל על ​​קרח דק '5.
7. פיפטה בדיקה RNA לתוך צינור דגימה. בדיקה RNA יצוף על פני השטח של Hyb. מערבבים על ידי צינור מצליף בעדינות.
8. בצע הכלאה בהיקף כולל של 50-100 μl של Hyb לדגימה. דגירה דגימות במעמד microfuge קבוע בתוך התנור הכלאה, או מתלה צינור צף microfuge באמבט מים, על 55 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.

5. RNAse טיפול

1. הסר את Hyb המכיל את החללית. חשוב לשמור את דגימות ב 55 מעלות צלזיוס במהלך השלבים לשטוף להפחית הלא ספציפית מחייב של החללית מאוגד שיורית. אם מספר דוגמאות הן הכלאה, מומלץ לשמור על דוגמיות בגוש החום נקבע על 55 מעלות צלזיוס כדי לשמור על הטמפרטורה הכלאה ברחבי השלבים כביסה.
2. לבצע שטיפה מהירה עם Hyb ידי pipetting 1 מ"ל של תמיסת לאמבטיה microfugeE ו צינור היפוך מדגם 5-6 פעמים.
   שוטף את כל מהירות הבאים ב פרוטוקול מבוצעים באופן דומה על ידי הוספת הפתרון הנדרש היפוך צינור דגימה מספר פעמים.
3. לבצע שתי שטיפות נוספות עם Hyb על 55 מעלות צלזיוס, 30 דקות כל אחד עם סיבוב בתנור ההכלאה.
4. לאזן את PBT ידי דוגרים בטמפרטורת החדר עם Hyb / PBT (1:1) במשך 15 דקות עם nutation.
5. בצע PBT שוטף 5 ×, 5 דקות כל אחד.
6. הכן RNAse טריים למאגר. בצע RNAse טיפול על ידי דוגרים על 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNAse / PBT ב 37 ° C, למשך 30 דקות. RNAse כמה RNA נדבקה תקועים יחיד יביא לזילות של unhybridized RNA בדיקה.
7. למזוג RNAse חיץ ולבצע שטיפה מהירה עם PBT.
8. בצע PBT שוטף 3 ×, 5 דקות כל אחד.

6. נוגדנים דגירה

1. הכן פתרון חסימת טריים (5% עוף סרום / 1% מערביות חסימת מגיב / PBT) דגימות ולחסום ידי incubaטינג ב 1 מ"ל של תמיסת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם nutation.
2. הוסף 200 μl של דילול של 1:1000 phosphatase נגד DIG-אלקליין (AP)-מצומדות נוגדנים לבלום פתרון. דגירה על 4 מעלות צלזיוס, בין לילה עם nutation.

7. Phosphatase אלקליין מכתים

1. הסר את הנוגדן פתרון חוסם.
2. לבצע שטיפה מהירה עם PBT.
3. PBT נוספת לבצע שוטף × 5, 10 דקות כל אחד. לחלופין הדגימות ניתן לכבס 3x, 10 דקות כל אחד ואחריו רחצה ממושכת ב 4 ° C, לילה עם nutation.
4. להכין טרי חיץ AP מכתים.
5. לבצע שטיפה מהירה עם מאגר מכתים AP.
6. לבצע שטיפות נוספות עם חיץ מכתים AP, 3 × 5 דקות כל אחד עם nutation.
7. להכין, על פי הוראות היצרן, טרי פתרון AP מכתים המכיל NBT המצע AP / BCIP.
8. דגירה כל דגימה עם 500 μl של פתרון מכתים AP ב temperatur החדרדואר עם nutation, בחושך. דוגמאות ניתן מודגרות ידי כיסוי צינורות עם מיכל אטום או נייר אלומיניום. ההתקדמות התגובה צריכה להיות במעקב כל 1-2 דקות ליצירת המשקע סגול. בהתאם לריכוז בדיקה, ריכוז של RNA היעד נוכחות שאינם ספציפיים מטרות, מכתים יכול להמשיך למשך מספר דקות עד מספר שעות.
9. הסר כמה הפתרון מכתים ככל האפשר. Decantation תוצאות לא מספקות בהיווצרותה של המשקע הלבן פתיתי במהלך השלבים שלאחר מכן לשטוף.
10. מכתים נעצר לחלוטין על ידי ביצוע שתי שוטף מהירים עם PBT.
11. PBT נוספת לבצע שוטף × 3, 5 דקות כל אחד.

8. גליצרול הרכבה

1. שימוש גדול בקוטר 200 עצה פיפטה μl, העברת דגימות מן המבחנות microfuge אל עגול התחתונה בארות בודדים של הצלחת במקום פיירקס.
2. מוציאים בזהירות מן המדגם כמה שיותר PBT ככל האפשר.
3. פיפטה על גבי גליצרול מדגם 70% / H ₂ O. אפשר גליצרול לחלחל רקמות מדגם ב 4 ° C, למשך הלילה. הטיפול המונע התייבשות גליצרול של רקמות במהלך הרכבה שקופיות.
4. להכין שקופיות מיקרוסקופ על ידי מנגב את פני השקופית לנקות עם Kimwipes. החל ב לשקופית שתי פיסות במקביל קלטת בלתי נראה זה לזה כך שהם יוצרים תעלה צרה (איור 2).
5. באמצעות מברשת אמנותית, לאסוף דגימות אחד על אחד ומניחים אותם לאורך הערוץ, מיקום כל דגימה עם אוריינטציה זאת, לגבי יישור הקדמי / האחורי ואת הגב / הגחון.
6. לאחר הצבת כל מדגם, השתמש ספוגית Kimwipe לספוג פתרון גליצרול עודף סביב הרקמות (איור 3). הסרת עודפי גליצרול חשוב למנוע היווצרות של בועות, כאשר איטום דגימות מותקן על גבי השקופית תחת חיפוי כיסוי.
7. מרכז ומקום בזהירות ACעל פתק על ערוץ המכיל את דגימות מיושר. להטביע העטיפה לחמוק semipermanently לשקופית ידי מספיגה בפינות להחליק את המכסה עם לק שקוף.
8. שימוש pipettor 200 μl, לוותר אט אט מקצה אחד של ערוץ 70% גליצרול מספיק כדי למלא על ידי פעולה נימי המרחב כולו של ערוץ וחבל תחת חיפוי כיסוי.
9. לאטום באופן קבוע דגימות רכוב על ידי יישום הלק לאורך כל ארבעת הצדדים של פליטת כיסוי. אפשר מסמר פולנית לייבש מספיק לפני צילום של שלמה, הר רקמות הכלאה. מומלץ לצלם תמונות של הדגימות מיד לאחר ההרכבה.

ב הכלאה באתרו כלפי העובר יתוש

פתרונות חוצצי הנדרשים הכלאה באתרו של עוברי יתושים מתוארים (טבלה 1). קיבוע ואת ההכלאה נהלים המוצגים כאן שונו מ thosה 1 דיווחה על gambiae אנופלס, ^5,6 Aedes aegypti ⁷ ו Culex quinquefasciatus. ⁸

1. העובר אוסף

1. עוברים נאספים 300, הזדווגו יתושים בוגרים נשים (מותר להזדווג עם גברים במשך 48 שעות, 3 ימים לאחר הופעתה) 72 משאבי אנוש לאחר ההנקה דם. היתושים הם שמרו על פתרון M 3 סוכרוז, על מנת למנוע ההטלה לפני תקופת האיסוף המיועד.
2. הכן איסוף מיכלי העובר על בטנה עוז 16. כוס נייר עם Saatilene הייטק רשת כך את פני השטח הפנימי של הכוס מכוסה לחלוטין. רשת יכולה להיות מודבקת באמצעות מצרך אחד. באמצעות רשת מקטינה באופן משמעותי מזהמים סיביים שנמצאים אם Whatman נייר לסנן או מגבות נייר רגילים.
3. למלא את המיכל חצי מלאה במים מזוקקים.
4. עוברים נאספים עבור שעות 1 על ידי הצבת מכולה לאיסוף בכלוב, המכוסה לאחר מכןבבד כהה כדי לעורר ההטלה.
5. עוברים שנאספו מותר להבשיל כדי שלבי ההתפתחות הרצויים מחוץ לכלוב בתנאי גידול סטנדרטיים (לחות יחסית של 85% / 26 ° C). ההתבגרות של עוברים לשלבים השונים יכול להיות מתואם לעת (שעות לאחר ההטלה) לאחר הקורס הזמן המשוער התפתחותית האירועים המתוארים עובריים (טבלה 2). טבלה זו מסכמת את האירועים המרכזיים של ההתפתחות העוברית Aedes aegypti, שדווחו על ידי Raminani ו Cupp, תיאר ^9,10 gambiae אנופלס לראשונה על ידי איוונובה-Kazas ¹¹ ו הרחיב עוד יותר על ידי Goltsev ועמיתיו, ^12,13 ו quinquefasciatus Culex דווח על ידי דייויס. ¹⁴ קורסים הזמן המתואר נועדו לשמש האומדן הראשוני, ולא בנקודות זמן מוחלט, עבור אוסף של עוברים בשלבים מסוימים של התפתחות.

2. , קיבוע Dechorionation, ו Endochoriעל שיבוש

1. העברת עוברים ממיכל אוסף לתוך צינור dechorionation לתפוס Saatilene רשת (תרשים 3).
   עבור עוברי Aedes, הצב את הצינור לתוך מבחנה לתפוס כי הוא מלא מים מזוקקים מספיק כך את עוצמת הקול של הצינור המלכוד הוא חצי מלא. מברשת אמנותית ניתן להשתמש כדי לסלק את העוברים מתוך רשת Saatilene ולהעביר אותם לתוך צינור מים מלא שלל.
   עבור עוברי אנופלס, לנתק את רשת Saatilene ממכל איסוף לקפל את הרשת בקפידה כדי ליצור משפך. מחזיק את המשפך רשת עם יד אחת, להשתמש מצד שני לוותר מים מזוקקים באמצעות בקבוק שפריץ פוליאתילן לאורך צדי המשפך לשטוף את העוברים לתוך הצינור המלכוד. שיטה זו ניתן ליישם עוברים אנופלס, כי הם חסרים את חומר דבק על פני השטח של עוברים Aedes, המאפשרת ביצים לדבוק מצעים ההטלה.
2. יחסי ציבורepare 40 מ"ל של תמיסת dechorionation (1 5.25% בנפח נתרן hypochlorite: 3 כרכים של מים מזוקקים). יוצקים את הפתרון אל תוך צלחת פטרי 100 מ"מ.
3. להכין כוס 100 מ"ל המכיל 50 מ"ל של מים מזוקקים ומניחים בצד. צעד dechorionation הוא זמן רגיש מיד לאחר hypochlorite נתרן עוברים את הטיפול יהיה שקוע במים זה, כדי לדלל את הפתרון dechorionation.
4. Dechorionate את העוברים בצינור רשת לתפוס ידי הנחת צינור בצלחת פטרי מלא פתרון dechorionation. להשתמש ב 'העברה חד פעמי או פוליאתילן פיפטה פסטר פיפטה לשטוף את העוברים, בעוד מתערבל בקבוקון לתפוס כך את עוברי להישאר מתחת ונסערת בפתרון dechorionation.
   המרבי של 35 שניות נדרש dechorionation של עוברים Aedes, תוך 75 שניות מספיק עבור אנופלס ואת עוברי Culex (לוח 3). Dechorionation הוא אחד השלבים הרגישים ביותר של Protocol והסיומת יתר של טיפול hypochlorite נתרן, במיוחד עבור עוברים Aedes ימנע פיצוח נאותה של סיסית.
5. מיד להטביע בכוס לתפוס בקבוקון המכיל מים.
6. לשטוף את הפתרון dechorionation הנותרים מעוברים על ידי סילוק הצינור לתפוס מן הכוס מלא מים ושטיפה מהקירות הפנימיים והחיצוניים של צינור לתפוס עם מים מזוקקים מבקבוק ברז להשפריץ או מצויד בצינור.
7. Dechorionation ניתן לאמת על ידי לדמיין את העוברים במיקרוסקופ לנתח בהגדלה נמוכה. Dechorionated עוברים Aedes חסרים exochorion הרשת דמוי ורק משטח חלק, מלוטש של endochorion שחור ניכר עבור dechorionated עוברים אנופלס, את מרחפת exochorionic ומבנים רכס נעדרים (איור 4).
8. באמצעות מברשת אמנותית, להעביר את העוברים dechorionated לתוך בקבוקון המכיל נצנץ 5 מ"ל מזוקקים WAטר (איור 5-1). אם דוגמאות רבות נמצאים בהכנה, לשמור על צינורות לתפוס במים כדי למנוע התייבשות של העוברים.
9. בואו עוברים את להתיישב לבסיס של הבקבוקון הנצנץ ולהסיר כמות המים מבקבוקון ככל האפשר.
10. הוסף 5 מ"ל של heptane לתוך בקבוקון הנצנץ (איור 5-2). הסר את כל המים שיורי שנותר בבקבוקון הנצנץ.
11. הוסף אל מ"ל בבקבוקון 5 נצנץ של פתרון טרי שהוכן קיבעון העובר (טבלה 1).
12. לתקן את עוברי למשך 30 דקות עם היפוך, כך שלבי אורגניים מימית ומערבבים היטב, אבל לא במרץ.
13. הסר את הפתרון קיבוע באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, נזהר לא להפריע שלבי הביניים, אשר מכיל את העוברים (איור 5-3).
14. לשטוף את הפתרון קיבעון שיורי על ידי מילוי בקבוקון נצנץ עם מים מזוקקים עד כמה שניתן. הפוך את הבקבוקון 5 פעמיםואז להסיר את כל המים מזוקקים.
15. למלא את הבקבוקון נצנץ עם 20 מ"ל מים מזוקקים לערבב ועל ידי בקבוקון היפוך למשך 30 דקות.
16. הסר את כל המים מבקבוקון הנצנץ.
17. להוסיף מספיק מים מזוקקים רותחים לתוך בקבוקון הנצנץ כך בשלב heptane אורגניים מגיע החלק העליון של הבקבוקון.
18. דגירה של 30 שניות ולאחר מכן הסר את כל המים הרותחים.
19. מוסיפים מים קרים כקרח מזוקקים עד שלב אורגניים מגיע החלק העליון של הבקבוקון. דגירה בקבוקון בקרח במשך 10 דקות.
20. 1 הסר את שלבי אורגניים מימית ולאחר מכן. Heptane יופיע אטום בשלב זה (איור 5-4).
21. הוסף 5 מ"ל של ניו heptane לתוך בקבוקון. הסר את כל המים הנותרים מבקבוקון.
22. הוסף 5 מ"ל מתנול לתוך בקבוקון. מערבולת בקבוקון 1-2 פעמים במרץ, ללא רעד (איור 6). אם בשלבים אורגניים מתנול heptane ואורגניים מזועזעים במרץ את העוברים של Wiיהיה להיהרס בזמן הקרע endochorion. ראוי לציין להזכיר כי ראינו וריאציה היעילות של שיבוש endochorion על זנים שונים של עוברי Aedes aegypti.
23. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. בשלב זה, השלבים יהפכו לעכור עקב שחרורו של רכיבים חלמון (איור 5-5).
24. הסר את שני השלבים אורגניים אנאורגניים ולשטוף עם מתנול 3 פעמים כדי להסיר את כל heptane שיורית.
25. עוברים ניתן לאחסן מתנול ב -20 ° C עד מספר חודשים.

3. פילינג

1. מניחים נייר דבק דו צדדית פאה במרכז צלחת פטרי 3 ס"מ. קלטת פאה משמש דבק כי הוא יציב בנוכחות מתנול ואתנול.
2. באמצעות משעמם גדולים (כ 3 מ"מ קוטר) 200 קצה פיפטה μl, עוברים העברה מ מתנול על גבי קלטת דו צדדית.
3. אפשר 1-2 דק 'עבור העוברים להתיישב ו ADHפה אל פני השטח את הקלטת.
4. עודף מתנול לערות ולאפשר פני השטח להתייבש מעט דקות 1-2.
5. הוסף 4 מ"ל של 95% (190 הוכחה) אתנול לתוך צלחת פטרי.
6. פיפטה 600 μl של מים מזוקקים לתוך אתנול ו מערבולת לערבב. הסרט יהיה אטום בצבע. תוספת של מים מזוקקים יגרמו קלטת להיות דביק ולא לשתק את העוברים במהלך קילוף. בשלב זה ניתן להשמיט אם רוצים.
7. השתמש מחט מד 27.5 מחובר לחבית מזרק 1 מ"ל להתקלף endochorion סדוק (איור 7). לאחר שחרור העובר לבן שרידי endochorion שחורים, להעביר את העוברים מהקלטת למאגר אתנול של צלחת פטרי בעזרת מברשת עצה עדין אמנותי. באמצעות טיפ 3 מ"מ טפטפת משעמם, להעביר את העוברים לתוך צינור 1.5 Ambion microfuge מ"ל המכיל 500 μl של אתנול 200 הוכחה.
   עוברי קלופים לא צריך להישאר על קלטת במשך תקופה ארוכה של זמן, כי הם עלולים להיצמד לכלהאתיקה מיוסדת על קלטת.
8. בצעו 2-3 שוטף מהיר עם 100% (200 הוכחה) אתנול לאחסן את העוברים באתנול מקפיד על -20 ° C. עוברים קלופים ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים מבלי להשפיע על מורפולוגיה או את האות הכלאה לאחר מכן.

4. הבהרה של חלמון

1. לבצע שטיפה מהירה עם אתנול 200 הוכחה. אתנול דקדקני יש להשתמש בכל האמצעים לשטוף הבאים ועל הכנת פתרון חלמון P-קסילן הבהרה.
2. בצע אחת לשטוף אתנול, 5 דק 'עם nutation.
3. דגירה של P-xylene/ethanol (09:01) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1-1.5 עם nutation. צעד קסילן מאפשר בירור המוני החלמון כדי לשפר את יחס האות לרעש.
4. הסר את הפתרון קסילן, אתנול לבצע שתי שטיפות מהירים עם אתנול.
5. בצע אחת לשטוף אתנול, 5 דק 'עם nutation.
6. לבצע שתי שטיפות מהירים עם מתנול, ואחריו רחצה 1 מתנול, 5 דקות עםnutation.
7. לאזן את הפתרון 4% קיבעון פורמלדהיד על ידי שטיפה אחת עם פתרון מתנול / פורמלדהיד קיבעון (1:1).

5. קיבוע ו הכלאה באתרו

קיבעון ואת ההכלאה בהליכי באתרו זהים לאלה המתוארים בפרוטוקול סעיף א '

ג נציג תוצאות

ההכלאה בפרוטוקול באתרו המתואר כאן, התוצאות בדפוסי צביעה בצבע המעידים נוכחות ולוקליזציה של mRNA ממוקד. חשוב להדגיש כי רמות יחסית של שפע התמליל לא ניתן לקבוע על ידי הכלאה באתרו. תוצאות הכלאה תלויים בדיקה mRNA ספציפי המשמש הליך ההכלאה, שפע של mRNA המטרה ברקמה הכלאה, כמו גם ריכוז החללית והטמפרטורה ההכלאה. השוואה בין הרקמות הכלאה עם antisense ו המתאימים mRNA בדיקות תחושת לאפשר פרשנות מדויקת של תבניות צביעה.

הכלאה באתרו של שלמה-mount בלוטות הרוק של נקבות Aedes aegypti עם בדיקות ה-mRNA כי amylase1 היעד (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423), ו D7L2 (AAEL006424) מצביעים על הצטברות של אלה תמלילי ב-הפרוקסימלי לרוחב, דיסטלי, לרוחב, ו המשני האונות הצדדיות / המדיאלי, בהתאמה (איור 8). ¹ כולו הר השחלות של שלושה מינים יתושים היו הכלאה עם בדיקות ה-mRNA שמתמקדים את תמלילי orthologous בהתאמה של אוסקר (איור 9). ^7,8 הכלאה באתרו של שלמה, הר עוברים של AE. aegypti,. gambiae ו Cx. quinquefasciatus בוצעה באמצעות antisense בדיקות רנ"א מיקוד אוסקר המתאים יתושים תמלילי orthologous (איור 10). ^7,8

igure 1 "src =" / files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg "/>
באיור 1. תרשים סכמטי של הכלאה שלאחר גובר הגדרת.

איור 2. הכנת Kimwipe מגב שימוש במהלך מדגם גובר. רקמות Kimwipe הוא מעוות בכוח לייצר רעמת שקצהו לספוג בינוני גובר העולה מן דגימות שקופיות.

איור 3. סכמטי של צינור Saatilene רשת לתפוס dechorionation.) התחתון של הצינור 50 מ"ל קלקר חרוטי מנותק להניב צינור חלול 4.5 ס"מ אורך, פתוח בשני קצותיו. פתיחת מעגלי נחתך מתוך המכסה צינור חרוטי לאפשר נוזל להישטף דרך חתיכת 6.5 ס"מ מרובע ² של רשת Saatilene. את 330 האשכולות לאינץ', בקוטר 34 מיקרון חוט מסך רשת שומרת לעצמה את העוברים יתושים. ב) Assembled לתפוס צינור.

איור 4. Aedes aegypti ו אנופלס ביצים gambiae, לפני ואחרי dechorionation.) Aedes ביצים aegypti לפני dechorionation. Exochorion רשת כמו שוכן מעל endochorion שחור נותן את הביצה מראה מחוספס (הרחבת השיבוץ). בעקבות הסרת exochorion, רק endochorion חלק ומלוטש נשאר (הגדלה ב 'הבלעה). ג) ביצי אנופלס gambiae שקדמו dechorionation. מבנים Exochorion כמו צף גלויים (חיצים). D) משטח חלק ומלוטש של endochorion גלוי לאחר dechorionation. בר = 100 מיקרומטר.

איור 5. שורה של צעדים עוקבים של קיבעון ושיבוש endochorion של AE. ביצים aegypti.) משופעת חזיתית נוףו-B) צפייה לרוחב של בקבוקונים המכילים נצנץ AE. aegypti ביצים במהלך שלבים עוקבים של קיבעון ושיבוש endochorion. 1) עוברים מים מזוקקים. 2) עוברים צפים שלבי הביניים בין שלב heptane העליון בשלב מימית נמוכה יותר. 3) קיבוע לאחר עוברים את לארוז יחד המונית עגול. עוברים להישאר שלבי הביניים בין שלבי פתרון heptane ו מקבע. 4) לאחר הטיפול במים רותחים הדגירה בקרח, בשלב heptane הופך שקוף מעט. 5) עוברים עם endochorions המשובשים מוצגים שלבי הביניים בין שלב heptane אטום בשלב מתנול שקוף.

איור 6. Endochorion שיבוש של AE קבוע. aegypti ביצים. א) מיד לאחר אנרגטי מתערבל של heptane שלבי מתנול, היווצרות בועות שיבוש endochorion ניתן דמיינו. ב) followiנג חמש דקות של הדגירה, בטמפרטורת החדר.

איור 7. ביצי יתושים בעקבות שיבוש והסרה של endochorion. ביצים של AE. aegypti (). gambiae (ב ') Cx. quinquefasciatus (C) הבאה קיבעון והפרעה endochorion. לבן, עוברים שקופים ניתן לראות בתוך endochorion נסדק. לאחר הסרת endochorion, העוברים שקופים של AE. aegypti (ד '). gambiae (ה) ו - Cx. quinquefasciatus (ו ') נראים בבירור. בר = 100 מיקרומטר.

איור 8. הכלאות באתרם במשך שלושה גנים לידי ביטוי אונות שונות של שלמה, הר, נקבה AE. aegypti בלוטות הרוק. מכתים מעיד על לוקליזציה וצבירת amylase1 (AAE L006719) (א), D7s2 (AAEL006423) (ב) ו D7L2 (AAEL006424) (ב). בר = 100 מיקרומטר.

איור 9. הכלאה באתרו של יתושים אוסקר בדיקות antisense רנ"א לשלם-mount ביציות ותאי יתושים אחות. שלב ביציות IV (OOC) גזור מן השחלות של. gambiae (א '), AE. aegypti (ב ') Cx. quinquefasciatus (C) הכלאה עם בדיקות רנ"א מיקוד בהתאמה אוסקר mRNAs יתושים. הזקיקים הראשוניים מכוונים עם הקדמי בצד שמאל. מכתים בקוטב האחורי (ראש חץ כחול) מצביעים על צבר mRNAs אוסקר. משניים (F2) ושלישוניים (F3) זקיקי מוצגים ו מכתים (שחור ראש חץ) עולה הצטברות של אוסקר mRNA בציטופלסמה אחות תא (NCC). מכתים נכלל גרעינים אחות תא (NCN). בר = 50 מיקרומטר.

ad/3709/3709fig10.jpg "/>
איור 10. הכלאה באתרו של יתושים אוסקר בדיקות antisense רנ"א לשלם-mount עוברים יתושים. עוברים מכוונים עם הקדמי בצד שמאל. הסלולר הבמה blastoderm של עוברי. gambiae (א) ו - Cx. quinquefasciatus (C) הם הכלאה עם זנים המתאימים ספציפית יתושים בדיקות אוסקר RNA. ב) blastoderm סינסיציאלי הבמה AE. העובר aegypti הכלאה עם בדיקות רנ"א מיקוד AE. aegypti פרוטוקול אוסקר. מכתים ניכרת בתאי מוט האחוריים של כל העוברים, מה שמצביע לוקליזציה הצטברות ה-mRNA אוסקר יתושים בתאים אלה. בר = 50 מיקרומטר.

טבלה 1. פתרונות חוצצי עבור ג'ל קיבעון פורמלדהיד, אלקטרופורזה ו הכלאה באתרו.

ftp_upload/3709/3709table2.jpg "/>
טבלה 2. אירועים התפתחותיים ותצפיות מורפולוגיים המתאימות לשלבים רצופים במהלך embryogenesis יתושים.

לוח 3. סיכום ההבדלים המרכזיים מראש הכלאה השלבים סוגי רקמות שונות.

Discussion

ההכלאה בפרוטוקול מכתים באתרו colorimetric הציג כאן כולו הר רקמות היתושים ועוברים היא טכניקה שימושית לוקליזציה של תמלילי בתוך איברים ספציפיים סוגי תאים. נהלים אלה הם שיפור לעומת שיטות שפורסמו בעבר שלנו, הן ייעול צעדים לשטוף נרחבים ומתן פרטים טכניים נוספים ומקורות מגיב.

מניסיוננו, איתור colorimetric של אותות הכלאה עדיפה ברגישות ובהירות של אות הכלאה לעומת הקרינה המבוססים על ערכות זיהוי. איתור colorimetric יתר על כן עוקף בעיות הקשורות אפליה האות עוברים, שהם מטבעם אוטומטי ניאון. מגבלות של גילוי אותות הכלאה להתרחש, כאשר נמוכה שפע תמלילי ממוקדות ולא מכתים רקע ניכר. הגדלת הטמפרטורה הכלאה עד 65 ° C נמצא לצמצם חזרההכלאה הקרקע אותות, אך אינו מהווה תחליף הציע לעיצוב ייחודי יעד ספציפיים בדיקות RNA.

פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לבצע הכלאה באתרו של שלמה, הר בלוטות הרוק של Aedes aegypti, ושחלות ועוברים של gambiae אנופלס, אנופלס stephensi, AE. aegypti ו Culex quinquefasciatus. שיטה זו ישימה גם לרקמות יתושים אחרים, ומן הסתם אלה של חרקים אחרים. בנוסף, אנו נערך על ההנחיות הפעם הראשונה ההשוואה הזמני של ההתפתחות העוברית ב 3 וקטור יתושים, AE. aegypti,. gambiae ו Cx. fatigans. תוכן דווחו על זנים מסוימים של שלושת המינים, גידול בתנאים דיסקרטיים. חשוב לציין כי במהלך תקופה התפתחותית יכול להשתנות על זנים שונים של מין יתושים ובתנאים גידול שונים. הכלאות במוסף באתרו מתמשך המאמצים לאנהlyze את transcriptomes של יתושים פרוקי רגליים אחרים, עשויה לספק תמונה טובה יותר של רגולציה של ביטוי גנים באורגניזמים אלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
1M Tris-HCl	Ambion	AM9855G	pH8.0
10X PBS	Ambion	AM9625
20X SSC	Ambion	AM9763
1.5 ml microfuge tubes	Ambion	AM12400	Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Storage at 4 °C
DEPC water	Ambion	AM9932
Proteinase K	Ambion	AM2546
5.25% Sodium hypochlorite	Austin’s		A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus	Ambion	AM2733	Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase	Ambion	AM2082	Storage at -20 °C
95% Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
HPLC-grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M87-500
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-542A	18 x18 mm
N-Heptane	Fisher Scientific	H350-1
P-xylene	Fisher Scientific	O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate	Fisher Scientific	13-748B	100x85 mm
Sodium chloride	Fisher Scientific	AC32730-0025
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape	Hair Direct	RED-75R12	Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli	Invitrogen	K457501 K457540	20 reactions 40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011	Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche Applied Science	1093274	Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix	Roche Applied Science	1277073	Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution	Roche Applied Science	1681451	Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent	Roche Applied Science	11921673001	Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130)	Saati Print	330.34 UO PW	330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol	Sigma	G6279-1	70% in PBT
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
Tween 20	Sigma	P1379-500
37% Formaldehyde	Ted Pella	18508	10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids	The Paper Company	SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap	VWR International	66022-128	20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material	VWR International	500018-081	10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum			Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.