Hybridisering Published: June 28, 2012 doi: 10.3791/3709

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jennifer Juhn¹, Anthony A. James^1,2

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Summary

Tidsmessige og romlig genekspresjon analyser har en avgjørende rolle i funksjonell genomforskning. Hel-mount hybridisering

Abstract

Mygg er vektor for et mangfoldig sett av patogener inkludert arboviruses og protozo parasitter og nematoder. Gransking av vitnemål og gen regulatorer som er uttrykt i vev der myggen vert og patogen samhandler, og i organer involvert i reproduksjon er av stor interesse for strategier for å redusere mygg-borne smitteoverføring og forstyrre egg utvikling. En rekke verktøy er ansatt for å studere og validere timelige og vev-spesifikk regulering av genuttrykk. Her beskriver vi protokoller som er utviklet for å oppnå romlig informasjon, som øker vår forståelse av hvor spesifikke gener kommer til uttrykk og sine produkter akkumuleres. Protokollen er beskrevet har blitt brukt til å validere uttrykk og bestemme akkumulering mønstre av vitnemål i vev knyttet til mygg-patogen overføring, for eksempel kvinnelige spyttkjertler, samt subcellulære avdelinger av ovarier og befruktede egg, som resent til mygg reproduksjon og utvikling.

Følgende prosedyrer representerer en optimalisert metodikk som forbedrer effektiviteten av ulike trinn i protokollen uten tap av mål-spesifikke hybridisering signaler. Retningslinjer for RNA probe forberedelse, er disseksjon av myke vev og den generelle prosedyren for fiksering og hybridisering er beskrevet i del A, mens trinn som er spesifikke for innsamling, fiksering, pre-hybridisering og hybridisering av mygg embryoer er beskrevet i del B.

Protocol

A. Hybridisering in situ for bløtvev: Mosquito spyttkjertler og eggstokker

Oppskrifter for løsninger og buffere som kreves for følgende prosedyrer er beskrevet i Tabell 1.

1. RNA Probe utarbeidelse og kvalitetssikring analyse

1. Design primere til PCR forsterke karakterutskriften målet av interesse. Det anbefales at fragment er ≥ 600 nukleotidene i lengde og enda viktigere at fragment sekvensen er unik for målet karakterutskriften. Sekvenser som ikke-unik unngås, for å eliminere muligheten for å generere cross-reaktive RNA prober.
2. Klone PCR produktet, i pCR4-TOPO vektor, eller lignende kloning vektor. Den pCR4-TOPO kloning vektor inneholder T7 og T3 RNA polymerase primersystemer nettsteder som muliggjør produksjon av både fornuft og antisens avrenning transkripsjon produkter fra en enkelt klon.
3. Sekvensere klonet fragment å bekrefte sekvens FIDelity og orientering i vektoren plasmidet.
4. Utfør en begrensning digest reaksjon med et enzym egnet til å produsere en antisens in vitro transkripsjon produktet. Plasmidet linearisering er laget enkel ved å velge en begrensning område som ligger i flere kloning regionen i pCR4-TOPO vektor som Spe jeg, Pst jeg eller Not I. Kontroller at det valgte restriksjonen området ikke er til stede i det klonede fragment. Det samme klon kan brukes til å generere en følelse-tråd RNA probe, som fungerer som en bakgrunn kontroll. Hybridisering in situ med en følelse sonde bør gi liten eller ingen signal, når sammenlignet med den komplementære antisens sonden.
5. Bekreft ved gelelektroforese at pCR4-TOPO kloning er helt lineært.
6. Renser lineær plasmid DNA ved å utføre en fenol-kloroform ekstraksjon, etterfulgt av etanol nedbør. Når fremskynde plasmidet DNA anbefales det å bruke en endelig Samtykkerasjon av 2 M ammonium acetat med 2,5 mengder etanol for å redusere overhenget av gjenværende salt i in vitro transkripsjon reaksjon.
7. Klargjør digoxigenin (DIG)-merket enkelt-strandet RNA probe ved å utføre en run-off in vitro transkripsjon reaksjon, bruke 1 mikrogram av lineær plasmid DNA som en mal. Klargjør reaksjon med RNA polymerase, transkripsjon buffer og DIG RNA merking mix som beskrevet av produsentens instruksjoner.
8. Renser DIG-merket, in vitro transkripsjon produkter av etanol nedbør og resuspender de pelleterte RNA i DEPC behandlet destillert vann.
9. Kontrollere kvaliteten og forventet molekylvekt av renset DIG-merket RNA probe av formaldehyd gel elektroforese. Det preparerte RNA probe kan deles inn i alikvoter og lagret ved -80 ° C inntil bruk.

2. Disseksjon av Mosquito spyttkjertler og eggstokker

1. Dissekere mygg spytt Glands ved hjelp av en sonde og tang som beskrevet tidligere for AE. aegypti. ^1,2 For An. gambiae, spyttkjertler kan dissekert som beskrevet for Ae. aegypti, eller alternativt som beskrevet i MR4 Metoder for Anopheles forskning manuell. ³
2. Dissekere mygg eggstokkene med tang som beskrevet tidligere for Ae. aegypti. ^fire kort, bruk en pinsett til å forstå thorax, mens en annen pinsett trekker av den nest siste abdominal segmentet å frigjøre eggstokkene.
3. Samle dissekert spyttkjertler eller eggstokkene i Ambion RNase-frie 1,5 ml microfuge rør som inneholder 50 mL PBS.
4. Opprettholde prøver på is inntil fiksering.

3. Fiksering

1. Fastsette dissekert vev i ferskt preparert mykt vev fiksering løsning (Tabell 1) i romtemperatur med nutation i 30 min til 1 time. Den fiksering Løsningen er forberedt frisk for å hindre oxidation av formaldehyd bindemiddel. Fiksering for 1 til 1,5 time er anbefalt for spyttkjertlene. Et minimum volum på 1 ml anbefales for feste vev i et 1,5 ml microfuge tube.
2. La vev å bosette til bunnen av microfuge røret. Dette er et viktig skritt, som følger alle endringer av løsninger i protokollen, og vil minimere betydelig prøven tap.
3. Dekanter fiksering løsningen ved forsiktig pipettering, etterlot 50-100 mL av volum i microfuge røret og deretter vaske 3 ×, 5 min hver med PBT.
4. Valgfrie ekvilibrering steg for vev lagring. Trinnvis skylle ut PBT med enten etanol eller metanol. Utfør trinnvis vasker med PBT / alkohol (3:1, 1:1 og 1:3, 5 min hver). Lagres i 100% (200 proof) alkohol ved -20 ° C. Vev kan lagres i flere måneder uten nedbrytning av vev ultrastructure. Før du utfører etterfølgende trinn i protokollen, må vev bli returnert til PBT ved trinnvis likevekt med alkohol / PBT (3:1, 1:1,01:03, 5 min hver).
5. Utfør PBT vasker 3 ×, 5 min hver.
6. Utfør protein fordøyelse med 0,01 mg / ml Proteinase K / PBT, 5 min ved romtemperatur. Alternativt, hvis begge immunolocalization av protein mål og hybridisering i situ av RNA er ønskelig, kan eggstokkene bli inkubert med 80% aceton / H ₂ O ved -20 ° C i 10 min i stedet for å behandle med Proteinase K.
   Proteinase K behandling er utelatt for utarbeidelse av spyttkjertlene. Gå direkte til trinn 3.10.
7. Umiddelbart dekanter fordøyelsen løsningen ved forsiktig pipettering. Vask 2 ×, 5 min hver med iskald PBT å stoppe fordøyelsen.
8. Utfør ekstra PBT vasker 2 ×, 5 min hver ved romtemperatur.
9. Post-fikse i bløtvevet fiksering løsning ved romtemperatur med nutation i 30 min. Post-fiksering trinnene er ikke utført for spyttkjertlene.
10. Utfør PBT vasker 5 ×, 5 min hver.

4. Hybridisering

1. Dekanter så mye Hyb / PBT som mulig. Tilsett 1 ml Hyb i hvert prøverør.
2. Pakk prøverøret i lukket-luft beskyttende emballasje (bobleplast) og plass inne i en hybridisering flaske. Tett flasken med en hybridisering korken.
3. Pre-hybridisering og hybridisering tiltak kan utføres lett i en hybridisering ovn. Utfør pre-hybridisering ved 55 ° C i 30 min med rotasjon.
4. Får tilstrekkelig tid til vevene å bosette til bunnen av microfuge tube, som Hyb er mer tett enn PBT. Nøye dekanter pre-hybridisering løsning. Vev kan bli gjennomsiktig og vanskelig å visualisere. Eksempel tap kan reduseres ved å la 50-100 mL av løsning volum i hvert prøverør.
5. Tilsett 50 mL volumet Hyb inn i prøverøret og vedlikeholde i en varme blokk ved 55 ° C.
6. Denature RNA probe ved 85 ° C i 5-10 min. Umiddelbart, plasserer denaturert sonden på is i 5 min.
7. Pipettering RNA sonden inn i prøverør. RNA probe vil flyte til overflaten av Hyb. Bland ved å slå røret forsiktig.
8. Utfør hybridisering i et totalt volum på 50-100 mL av Hyb per prøve. Inkuber prøvene i en fast microfuge stativ inne i en hybridisering ovn, eller i et flytende microfuge tube rack i et vannbad, ved 55 ° C i 16-24 timer.

5. RNase A Behandling

1. Fjern Hyb inneholder sonden. Det er viktig å opprettholde prøvene ved 55 ° C i løpet av de vask tiltak for å redusere ikke-spesifikk binding av gjenværende ubundet probe. Hvis flere prøver er hybridisert, anbefales det å holde prøverør i en varme blokk innstilt på 55 ° C for å opprettholde den hybridiseringen temperatur i hele vaske trappen.
2. Utfør en rask vask med Hyb ved pipettere 1 ml inn i microfuge badekarete og invertere prøverør 5-6 ganger.
   Alle påfølgende raske vasker i protokollen er utført på samme måte ved å legge den nødvendige løsningen og invertere prøverør flere ganger.
3. Utfør to ekstra vask med Hyb ved 55 ° C, 30 min hver med rotasjon i hybridisering ovnen.
4. Stabilisere seg inn PBT ved å inkubere ved romtemperatur med Hyb / PBT (1:1) i 15 min med nutation.
5. Utfør PBT vasker 5 ×, 5 min hver.
6. Forbered frisk RNase A buffer. Utfør RNase En behandling ved inkubasjon i 20 mikrogram / ml RNase A / PBT ved 37 ° C, i 30 min. RNase A kløyver enkelt RNA og vil resultere i degradering av unhybridized RNA probe.
7. Dekanter RNase En buffer og utføre en rask vask med PBT.
8. Utfør PBT vasker 3 ×, 5 min hver.

6. Antistoff Inkubasjon

1. Forbered fersk blokkering løsning (5% kylling serum / 1% vestlige Stenging reagens / PBT) og blokk prøver av incubaTing i en ml 30 min ved romtemperatur med nutation.
2. Tilsett 200 mL av en 1:1000 fortynning av anti-DIG-alkalisk fosfatase (AP) antistoffet i blokkering løsning. Inkuber ved 4 ° C, overnatting med nutation.

7. Alkalisk fosfatase Farging

1. Fjern antistoff og blokkerer løsning.
2. Utfør en rask vask med PBT.
3. Utfør ekstra PBT vasker 5 ×, 10 min hver. Alternativt prøvene kan vaskes 3x, 10 min hver etterfulgt av en utvidet vask ved 4 ° C, overnatting med nutation.
4. Forbered frisk AP farging buffer.
5. Utfør rask vask med AP farging buffer.
6. Utføre flere vask med AP farging buffer 3 ×, 5 min hver med nutation.
7. Forbered, i henhold til produsentens instruksjoner, frisk AP farging løsning som inneholder AP underlaget NBT / BCIP.
8. Inkuber hver prøve med 500 mL av AP farging løsning ved romtemperature med nutation, i mørket. Prøvene kan ruges av dekke rør med en ugjennomsiktig container eller aluminiumsfolie. Reaksjon progresjon skal overvåkes hver 1-2 minutter for dannelsen av en lilla bunnfall. Avhengig av sonden konsentrasjon, konsentrasjon av målet RNA og tilstedeværelse av ikke-spesifikke mål, kan farging fortsette i flere minutter til flere timer.
9. Fjern så mye av farging løsning som mulig. Utilfredsstillende avhelling resulterer i dannelsen av en hvit flocculent utfelling under påfølgende vask trinn.
10. Den farging stoppes helt ved å utføre to raske vasker med PBT.
11. Utfør ekstra PBT vasker 3 ×, 5 min hver.

8. Glyserol Montering

1. Ved hjelp av en grov 200 mL pipette, overføre prøver fra microfuge rør inn individuelle rundbunnet brønner på en Pyrex sted plate.
2. Fjern forsiktig fra prøven så mye av PBT som mulig.
3. Pipetter på toppen av prøven 70% glycerol / H ₂ O. Tillat glyserol å gjennomsyre prøven vevet ved 4 ° C, over natten. Glyserol behandling hindrer uttørking av vev under lysbilder montering.
4. Forbered objektglass ved å tørke den Gliflaten rengjør med Kimwipes. Påfør på å slide to stykker av usynlige bånd parallelt med hverandre slik at de danner en smal kanal (figur 2).
5. Ved hjelp av en kunstnerisk børste, plukke opp prøvene en etter en og plassere dem langs kanalen, posisjonerer hver prøve med samme retning, med hensyn til fremre / bakre og dorsal / ventral justeringer.
6. Etter posisjonerer hver prøve, bruker en Kimwipe vattpinne til å absorbere overflødig glyserol løsning rundt vev (figur 3). Fjerning av overflødig glyserol er viktig å hindre dannelsen av bobler, når forsegling montert prøvene inn på lysbildet under et dekkglass.
7. Center og sted nøye acom slip over kanalen inneholder de sammenstilte prøvene. Fest dekselet gli semipermanently på lysbildet ved dabbing hjørnene av dekselet slip med gjennomsiktig neglelakk.
8. Ved hjelp av en 200 mL pipettor, dispensere sakte inn i den ene enden av kanalen nok 70% glyserol å fylle av kapillærkraft hele plassen av kanalen og området under dekkglass.
9. Permanent forsegle montert prøvene ved å påføre neglelakk langs alle fire sider av dekkglass. La neglelakk tørke tilstrekkelig før fotografering av de hybridisert hel-mount vev. Det anbefales å fotografere bilder av prøvene umiddelbart etter montering.

B. Hybridisering in situ for Mosquito Embryoer

Løsninger og buffere som kreves for hybridisering i situ for mygg embryoer er beskrevet (Tabell 1). Fiksering og hybridisering prosedyrer som presenteres her har blitt forandret fra Those først rapportert for Anopheles gambiae, ^5,6 Aedes aegypti ⁷ og Culex quinquefasciatus. ⁸

1. Embryo Collection

1. Embryoer er hentet fra 300 parret, kvinnelige voksne mygg (lov til å pare seg med hanner for 48 timer, 3 dager etter fremveksten) 72 timer etter blod fôring. Myggen blir opprettholdt på 3 M sukroseløsning, for å hindre oviposition før den tiltenkte innsamlingsperioden.
2. Forbered embryo innsamlingscontainere av kø en 16 oz. pappkruset med Saatilene Hitech netting slik at innsiden av koppen er dekket helt. Nettet kan være festet ved hjelp av en enkelt stift. Ved hjelp av denne mesh reduserer fibrøse forurensninger som er tilstede hvis Whatman filter papir, eller papirhåndklær benyttes.
3. Fyll beholderen halvfull med destillert vann.
4. Embryoer samles for en time ved å plassere samlingen container i buret, som deretter dekkesav en mørk klut for å stimulere oviposition.
5. Innsamlede embryo får lov til å modne til ønskede utviklingsstadier utenfor buret i standard oppdretter forhold (85% relativ fuktighet / 26 ° C). Modning av befruktede egg til ulike stadier kan være korrelert til tid (timer etter oviposition) etter omtrentlig utviklingsmessige tidsforløpet av embryonale hendelser beskrevet (tabell 2). Denne tabellen oppsummerer store begivenheter i embryoutvikling for Aedes aegypti, rapportert av Raminani og Cupp, beskrev ^9,10 Anopheles gambiae første av Ivanova-Kazas ¹¹ og ytterligere utdypet ved Goltsev og kolleger, ^12,13 og Culex quinquefasciatus rapportert av Davis. ^14. tid kursene som beskrives er ment å tjene som første estimatene, snarere enn absolutte tidspunkter, for innsamling av befruktede egg på bestemte stadier av utvikling.

2. Dechorionation, fiksering, og Endochoripå Avbrudd

1. Overfør embryoer fra samlingen beholderen til et Saatilene mesh dechorionation fangst rør (figur 3).
   For Aedes embryoer, plasser fangsten røret inn i et begerglass som er fylt med nok destillert vann slik at volumet av fangsten tube er en halv full. En kunstnerisk børsten kan brukes til å løsne embryoer fra Saatilene mesh og overføre dem til vannfylt fangst tube.
   For Anopheles embryoer, løsne Saatilene mesh fra samlingen beholderen og brett mesh nøye for å danne en trakt. Hold mesh trakt med en hånd, bruk den andre hånden til å dispensere destillert vann gjennom en polyetylen skvett flaske langs sidene av trakten å vaske embryoene inn fangsten røret. Denne metoden kan brukes til Anopheles embryoer fordi de mangler den selvklebende stoff som finnes på overflaten av Aedes embryo, som gjør egg å feste seg oviposition underlag.
2. Prepare 40 ml dechorionation løsning (1 volum 5,25% natriumhypokloritt: 3 mengder destillert vann). Hell blandingen i en 100 mm petriskål.
3. Forbered en 100 ml begerglass som inneholder 50 ml destillert vann og sett til side. Det dechorionation trinnet er tidskritiske og umiddelbart etter natriumhypokloritt behandling embryoene vil bli nedsenket i dette vannet, for å fortynne dechorionation løsningen.
4. Dechorionate embryoene i mesh fange slangen ved å plassere slangen i petriskål fylt med dechorionation løsning. Bruk en engangs polyetylen overføringspipetten eller Pasteur pipette for å vaske embryoer, mens virvlende fangsten hetteglasset slik at embryoer forblir neddykket og opprørt i dechorionation løsningen.
   Maksimalt 35 sek kreves for dechorionation av Aedes embryo, mens 75 sek er tilstrekkelig for Anopheles og Culex embryoer (Tabell 3). Dechorionation er en av de mest sensitive trinnene i protocol og over-utvidelse av natriumhypokloritt behandling, spesielt for Aedes embryoer vil forhindre skikkelige sprekkdannelser i chorion.
5. Umiddelbart senk fangsten hetteglasset i begerglasset som inneholder vann.
6. Vask av de resterende dechorionation løsningen fra embryoer ved å fjerne fangsten røret fra vannfylt begerglass og skylle av de indre og ytre veggene av fangsten rør med destillert vann fra en skvett flaske eller kran utstyrt med slange.
7. Dechorionation kan verifiseres ved å visualisere embryoer med en dissekere mikroskop ved lav forstørrelse. Dechorionated Aedes embryo mangler nettingen-lignende exochorion og bare glatt, polert overflate av svart endochorion fremgår for dechorionated Anopheles embryoer, de exochorionic flottører og ridge strukturer er fraværende (figur 4).
8. Ved hjelp av en kunstnerisk børste, overføre dechorionated embryoene inn i en scintillation hetteglass med 5 ml destillert waTer (figur 5-1). Hvis flere prøver er under utarbeidelse, opprettholde fangstratene rør i vann for å hindre uttørking av embryoene.
9. La embryoene bosette til bunnen av scintillation hetteglasset og fjern så mye vann fra hetteglasset som mulig.
10. Tilsett 5 ml heptan i scintillation hetteglasset (figur 5-2). Fjern eventuelle gjenværende vann som forblir i scintillation hetteglasset.
11. Legg inn scintillation hetteglasset 5 ml fersk forberedt embryo fiksering løsning (Tabell 1).
12. Fest embryoer for 30 min med inversjon slik at de økologiske og vandig faser bland godt, men ikke kraftig.
13. Fjern fiksering løsningen ved hjelp av et glass Pasteur pipette, være forsiktig for ikke å forstyrre interfase, som inneholder embryoene (figur 5-3).
14. Vask av den gjenværende fikseringsløsning ved å fylle scintillation hetteglass med så mye destillert vann som mulig. Snu hetteglasset 5 ganger ogderetter fjerne all destillert vann.
15. Fyll scintillation hetteglass med 20 ml destillert vann og bland ved å snu hetteglasset i 30 min.
16. Fjern alt vann fra scintillation hetteglasset.
17. Legg nok kokende destillert vann i scintillation hetteglasset slik at uorganisk heptan fasen når toppen av hetteglasset.
18. Inkuber i 30 sek, og deretter fjerne alt av det kokende vannet.
19. Legg iskaldt destillert vann til den uorganiske fasen når toppen av hetteglasset. Inkuber hetteglasset i isen for 10 min.
20. Ta første de vandige og deretter organiske faser. Den heptan vises ugjennomsiktig på dette trinnet (Figur 5-4).
21. Tilsett 5 ml av ny heptan i hetteglasset. Fjern alle gjenværende vannet fra flasken.
22. Tilsett 5 ml metanol i hetteglasset. Swirl flasken 1-2 ganger energisk, uten risting (figur 6). Hvis uorganiske heptan og organiske metanol fasene ristes kraftig embryoene will bli ødelagt under endochorion ruptur. Det er bemerkelsesverdig å nevne at vi har observert variasjon i effektiviteten av endochorion avbrudd for ulike stammer av Aedes aegypti embryoer.
23. Inkuber ved romtemperatur i 15-20 min. I denne fasen vil de fasene blir grumset på grunn av utgivelsen av eggeplomme komponenter (figur 5-5).
24. Fjern både organiske og uorganiske faser og vask med metanol 3 ganger for å fjerne alle rester heptan.
25. Embryoet kan lagres i metanol ved -20 ° C i opptil flere måneder.

3. Peeling

1. Plasser et stykke dobbeltsidig klærne tape i sentrum av en 3 cm petriskål. Tupé tape brukes fordi limet er stabilt i nærvær av metanol og etanol.
2. Hjelp av en stor boring (ca 3 mm diameter) 200 mL pipette, overføre foster fra metanol på dobbeltsidig tape.
3. Tillat 1-2 min for embryoene å bosette og ADHere til tapen overflaten.
4. Dekanter overflødig metanol og la overflaten tørke litt for 1-2 min.
5. Tilsett 4 ml 95% (190 proof) etanol i petriskål.
6. Pipetter 600 mL destillert vann i etanol og swirl å blande. Tapen blir ugjennomsiktig i farger. Tilsetting av destillert vann vil føre til at tapen blir tacky og immobilisere embryoer under peeling. Dette trinnet kan utelates hvis ønskelig.
7. Bruk en 27,5 kanyle festet til en 1 ml sprøyte fat til å skrelle av det sprakk endochorion (figur 7). Etter utgivelsen av hvite embryo fra de svarte endochorion restene, overføre embryoene fra tapen til etanol reservoar av petriskål med en fin-tip kunstnerisk børste. Ved hjelp av en 3-mm boring pipettespissen, overføre embryoene inn i en Ambion 1,5 ml microfuge tube inneholder 500 mL av 200 bevis etanol.
   De skrelte embryoer ikke bør være på båndet for en lengre periode fordi de kan forholde seg permanently til tape.
8. Utfør 2-3 raske vasker med 100% (200 proof) etanol og lagre embryoer i punctilious etanol ved -20 ° C. Skrelte embryo kan oppbevares ved -20 ° C i noen måneder uten at det påvirker morfologi eller den påfølgende hybridisering signal.

4. Avklaring av eggeplomme

1. Utfør en rask vask med 200 bevis etanol. Punctilious etanol skal brukes for alle påfølgende vask trinn og for utarbeidelse av P-xylene eggeplomme avklaring løsning.
2. Utfør en etanol vask, 5 min med nutation.
3. Inkuber i P-xylene/ethanol (09:01) ved romtemperatur i 1 til 1,5 timer med nutation. Det xylen trinnet tillater avklaring av eggeplomme masse å forbedre signal til støyforhold.
4. Fjern xylen-etanol løsning og utføre to kjappe vasker med etanol.
5. Utfør en etanol vask, 5 min med nutation.
6. Utfør to raske vasker med metanol, etterfulgt av en metanol vask, 5 min mednutation.
7. Stabilisere seg i 4% formaldehyd fiksering løsning ved å vaske en gang med metanol / formaldehyd fiksering løsning (1:1).

5. Fiksering og Hybridisering in situ

Fiksering og hybridisering in situ prosedyrer er identiske med dem som er beskrevet i protokollen avsnitt A.

C. Representant Resultater

Den hybridisering in situ-protokollen som er beskrevet her, resulterer i fargede flekker mønstre som indikerer tilstedeværelse og lokalisering av målrettet mRNA. Det er viktig å understreke at relative nivåer av karakterutskrift overflod ikke kan bestemmes ved hybridisering in situ. Hybridisering resultatene er avhengig av den spesifikke mRNA sonde brukes for hybridisering prosedyren, overflod av målet mRNA i hybridisert vev, samt sonde konsentrasjon og hybridisering temperatur. Sammenligning av vev hybridisert med antisens og tilsvarende sans mRNA sonder gjøre det mulig å nøyaktig tolkning av flekker mønstre.

Hybridisering in situ av hel-mount spyttkjertler av kvinnelige Aedes aegypti med mRNA sonder som mål amylase1 (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423), og D7L2 (AAEL006424) indikerer opphopning av disse transkripsjoner i proksimal-lateral, distal-lateral, og distal- laterale / mediale lobes, henholdsvis (Figur 8). ¹ hel-mount eggstokkene til tre mygg arter ble hybridisert med mRNA prober som spesifikt retter de respektive orthologous transkripsjoner av Oskar (figur 9). ^7,8 Hybridisering in situ av hel-mount embryoer av AE. aegypti, An. gambiae og Cx. quinquefasciatus ble utført ved hjelp antisens RNA prober rettet mot de respektive mygg Oskar orthologous transkripsjoner (Figur 10). ^7,8

igure 1 "src =" / files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk diagram av post-hybridisering montering set-up.

Figur 2. Utarbeidelse av Kimwipe mopp brukes under prøven montering. En Kimwipe vev er vridd tett for å produsere en tynn mopp å absorbere overflødig montering medium fra prøvene og Side.

Figur 3. Skjematisk av Saatilene mesh dechorionation fangst tube. A) i bunnen av en 50 ml polystyren konisk rør er avskåret for å gi et hult rør 4,5 cm i lengde, åpen i begge ender. En sirkulær åpning er skåret ut av den koniske røret lokket til å tillate væske skal vaskes gjennom en 6,5 cm ² firkantet stykke av Saatilene mesh. De 330 tråder per tomme, beholder 34 micron diameter tråden mesh skjermen myggen embryoer. B) Assembled fange tube.

Figur 4. Aedes aegypti og Anopheles gambiae egg, før og etter dechorionation. A) Aedes aegypti egg før dechorionation. Den mesh-aktig exochorion ligger over den svarte endochorion og gir egget en strukturert utseende (innfelt utvidelse). Etter fjerning av exochorion, gjenstår bare den glatte og polerte endochorion (B og innfelt utvidelse). C) Egg av Anopheles gambiae før dechorionation. Exochorion strukturer som flyter er synlige (piler). D) Den glatte og polerte overflaten av endochorion er synlig etter dechorionation. Bar = 100 mikrometer.

Figur 5. En rekke sekvensielle trinn for fiksering og endochorion avbrudd i Ae. aegypti egg. A) Slanted-forfraog B) lateral-vis av scintillation hetteglass som inneholder Ae. aegypti egg under sekvensielle trinn av fiksering og endochorion avbrudd. 1) Embryoer i destillert vann. 2) Embryoer flyte i interfase mellom øvre heptan fase og nedre vandige fasen. 3) Etter fiksering embryoene pakke sammen i en rund masse. Embryoer blir værende i interfase mellom heptan og Fikseringsoppløsning faser. 4) Etter behandling med kokende vann og inkubasjon i is, blir heptan fase litt ugjennomsiktig. 5) embryoer med forstyrret endochorions er vist i interfase mellom en ugjennomsiktig heptan fase og gjennomsiktig metanol fase.

Figur 6. Endochorion forstyrrelse av fast Ae. aegypti egg. A) Umiddelbart etter energisk virvlende av heptan og metanol faser, kan dannelsen av bobler og forstyrrelse av endochorion bli visualisert. B) Following fem minutter av inkubasjon ved romtemperatur.

Figur 7. Mosquito egg etter avbrudd og fjerning av endochorion. Egg av AE. aegypti (A), An. gambiae (B) og CX. quinquefasciatus (C) etter fiksering og forstyrrelse av endochorion. Hvite, gjennomskinnelige embryo kan ses innenfor sprakk endochorion. Etter fjerning av endochorion, gjennomskinnelige embryoer av AE. aegypti (D), An. gambiae (E) og CX. quinquefasciatus (F) er godt synlig. Bar = 100 mikrometer.

Figur 8. Hybridizations i situ for tre gener som uttrykkes i ulike fliker av hel-mount, kvinnelig AE. aegypti spyttkjertler. Farging er et tegn på lokalisering og akkumulering av amylase1 (AAE L006719) (A), D7s2 (AAEL006423) (B) og D7L2 (AAEL006424) (B). Bar = 100 mikrometer.

Figur 9. Hybridisering in situ for mygg Oskar antisens RNA prober til hel-mount mygg egg og sykepleier celler. Stage IV oocytter (ooc) dissekert fra eggstokkene til An. gambiae (A), Ae. aegypti (B) og CX. quinquefasciatus (C) og hybridisert med RNA prober rettet respektive mygg Oskar mRNAs. Primære follicles er orientert med fremre på venstre. Farging i bakre pol (blå pilspiss) viser akkumulert Oskar mRNAs. Sekundære (f2) og tertiær (F3) follicles er vist og flekker (svart pilspiss) indikerer opphopning av Oskar mRNA i sykepleier cellen cytoplasma (NCC). Farging blir ekskludert fra sykepleier cellekjerner (ncn). Bar = 50 mikrometer.

ad/3709/3709fig10.jpg "/>
Figur 10. Hybridisering in situ for mygg Oskar antisens RNA prober til hel-mount mygg embryoer. Embryoet er orientert med fremre på venstre. Cellular blastoderm scene embryoer fra An. gambiae (A) og CX. quinquefasciatus (C) er hybridisert med respektive mygg artsspesifikke Oskar RNA sonder. B) En syncytial blastoderm scenen Ae. aegypti embryo hybridisert med RNA prober rettet Ae. aegypti Oskar karakterutskrift. Farging er tydelig i de bakre pol celler av alle embryoer, noe som indikerer lokalisering og akkumulering av mygg Oskar mRNA i disse cellene. Bar = 50 mikrometer.

Tabell 1. Solutions og buffere for formaldehyd gel elektroforese, fiksering og hybridisering in situ.

ftp_upload/3709/3709table2.jpg "/>
Tabell 2. Utviklingseffekter hendelser og morfologiske observasjoner tilsvarende etterfølgende stadier i mygg embryogenese.

Tabell 3. Sammendrag av viktige forskjeller i pre-hybridisering steg for ulike vevstyper.

Discussion

Den hybridisering in situ og kolorimetrisk farging protokoll presenteres her for hel-mount mygg vev og befruktede egg er en nyttig teknikk for lokalisering av vitnemål innenfor bestemte organer og celletyper. Disse prosedyrene er en forbedring over våre tidligere rapporterte metoder, både i strømlinjeforme omfattende vask skritt og gi flere tekniske detaljer og reagenser kilder.

Vår erfaring er kolorimetrisk påvisning av hybridisering signaler overlegen i følsomhet og klarhet av hybridisering signal i forhold til fluorescens-basert gjenkjenning ordninger. Videre kolorimetrisk påvisning omgår problemene forbundet med signal diskriminering i embryoer, som er iboende auto-fluorescerende. Begrensninger i å oppdage hybridisering signaler oppstår, når lav overflod transkripsjoner er målrettet og bakgrunn farging er tydelig. Økning av hybridisering temperaturen til 65 ° C har vist seg å redusere tilbakebakken hybridisering signaler, men er ikke en foreslått erstatning for å designe unike target-spesifikke RNA prober.

Denne protokollen har blitt brukt til å utføre hybridisering in situ av hel-mount spyttkjertler av Aedes aegypti og eggstokker og embryo av Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti og Culex quinquefasciatus. Denne metoden er også aktuelt for andre mygg vev, og antagelig de av andre insekter. I tillegg utarbeidet vi for første gang komparative retningslinjer for iscenesettelsen av embryoutvikling i tre vektor mygg, Ae. aegypti, An. gambiae og Cx. fatigans. Observasjoner har vært rapportert for bestemte typer av disse tre artene, under diskrete oppdretter forhold. Det er viktig å merke seg at utviklingsmessige tidsforløpet kan variere for ulike stammer av myggarter og under forskjellige oppdretter forhold. Hybridizations i situ supplement pågående innsats for å analyze de transcriptomes av mygg og andre leddyr, og kan gi et bedre bilde av regulering av genuttrykk i disse organismene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
1M Tris-HCl	Ambion	AM9855G	pH8.0
10X PBS	Ambion	AM9625
20X SSC	Ambion	AM9763
1.5 ml microfuge tubes	Ambion	AM12400	Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Storage at 4 °C
DEPC water	Ambion	AM9932
Proteinase K	Ambion	AM2546
5.25% Sodium hypochlorite	Austin’s		A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus	Ambion	AM2733	Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase	Ambion	AM2082	Storage at -20 °C
95% Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
HPLC-grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M87-500
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-542A	18 x18 mm
N-Heptane	Fisher Scientific	H350-1
P-xylene	Fisher Scientific	O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate	Fisher Scientific	13-748B	100x85 mm
Sodium chloride	Fisher Scientific	AC32730-0025
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape	Hair Direct	RED-75R12	Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli	Invitrogen	K457501 K457540	20 reactions 40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011	Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche Applied Science	1093274	Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix	Roche Applied Science	1277073	Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution	Roche Applied Science	1681451	Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent	Roche Applied Science	11921673001	Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130)	Saati Print	330.34 UO PW	330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol	Sigma	G6279-1	70% in PBT
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
Tween 20	Sigma	P1379-500
37% Formaldehyde	Ted Pella	18508	10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids	The Paper Company	SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap	VWR International	66022-128	20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material	VWR International	500018-081	10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum			Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.