Summary
هذا البروتوكول الفيديو يشرح طريقة جديدة لتوليد وتنقية لاحق من الخلايا العصبية السلف من مصدر متجدد للخلايا الجذعية العصبية (NSCs) على أساس (الحبوبية حجم والداخلية) والخصائص الجسدية فلوري باستخدام تكنولوجيا تدفق الخلوي.
Abstract
يمكن عزل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، وتوسعت في نطاق واسع، وذلك باستخدام الفحص neurosphere ومتباينة إلى ثلاثة أنواع رئيسية من خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي الخلايا النجمية، oligodendrocytes والخلايا العصبية. هذه الخصائص تجعل الجذعية العصبية والخلايا الاولية مصدرا قيما قابلة للتجديد الخلايا للدراسات في المختبر مثل فحص المخدرات، neurotoxicology والكهربية، وكذلك لعلاج استبدال الخلية في العديد من الأمراض العصبية. في الممارسة العملية، ومع ذلك، عدم تجانس ذرية مجلس الأمن القومي، وإنتاج منخفض من الخلايا العصبية وoligodendrocytes، وغلبة تمايز الخلايا النجمية بعد تحد تطبيقاتها السريرية. هنا، نحن تصف منهجية جديدة لتنقية جيل لاحق من الخلايا العصبية وغير ناضج من ذرية NSC الفئران باستخدام مضان الفرز الخلية تفعيلها (FACS) التكنولوجيا. باستخدام هذه المنهجية، يمكن التوصل الى التخصيب الخلية العصبية سلف سكان خفة دمالحوت أي نجمية ملحوظ وبحسن نية تلوث مجلس الأمن القومي. الإجراء يشمل التفريق بين ذرية معزولة وتوسيع مجلس الأمن القومي من eminences الماوس E14 العقدية باستخدام مقايسة neurosphere، تليها العزلة وإثراء غير ناضج الخلايا العصبية على أساس خصائصها الفيزيائية (الحجم والتعقيد الداخلية) وفلوري باستخدام تكنولوجيا تدفق الخلوي. وعموما، يستغرق 5-7 أيام لتوليد neurospheres و 6-8 أيام في التفريق NSC ذرية وعزل عالي النقاء الخلايا العصبية غير ناضج.
Protocol
1. مجموعة أساسية حتى قبل الشروع في زراعة الخلايا
- يتم خلط NeuroCult NSC متوسطة القاعدية وNeuroCult ملاحق مجلس الأمن القومي انتشار الأسلحة النووية في نسبة 9:1، على التوالي، إلى جعل مجلس الأمن القومي الشامل المتوسطة.
- ويتم استخدام المياه 37 درجة مئوية حمام في عملية الاحماء في المتوسط.
- يتم إذابة كمية مناسبة من حرارة المعطل مصل العجل الجنين (FCS).
- مخزنة كمية مناسبة من حلول المخزون عامل النمو بما في ذلك عامل نمو البشرة (EGF في 10 ميكروغرام / مل)، عامل نمو الأرومة الليفية الأساسية (B-جمعية جيل المستقبل في 10 ميكروغرام / مل)، والحل الهيبارين بنسبة 0.2٪ في الفوسفات المالحة (PBS) ومذاب.
- وهناك حاجة إلى قوارير زراعة الأنسجة (T25، T75 أو وT175) لتوسيع مجلس الأمن القومي والتمايز.
- تعامل زراعة الأنسجة 96 و 24 لوحات بشكل جيد وهناك حاجة لcoverslips الزجاج لطلاء الخلايا التي تم فرزها.
2. العزلة، والتوسع (الركض) من NSCs
- يتم عزل الجذعية العصبية والأسلاف وتوسعت من الفأر بتمطر كما هو موضح في بروتوكولات منفصلة 1، 2 3.
- عندما neurospheres (neurospheres الأولية أو passaged) مستعدون للثقافة فرعية (150-200 ميكرون في القطر)، يتم نقل مجالات المتوسطة التي تحتوي على حجم مناسب معقم الأنسجة أنبوب والثقافة، وطرد في الدقيقة 800 (110 غ) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تتم إزالة المتوسطة طاف ومجالات إعادة علقت في 1 مل من 0.05٪ قبل حرارة التربسين-EDTA.
- بعد حضانة في 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 2-3 دقائق، يضاف حجم مساو من مثبطات التربسين فول الصويا إلى تعليق خلية لوقف نشاط التربسين.
- للتأكد من أنه تم التربسين المعطل تماما، وpipetted بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا 3-5 مرات.
- بعد الطرد المركزي في 800 دورة في الدقيقة (110 غ) لمدة 5 دقائق، يتم إزالة طاف والخلايا إعادة علقت في 1 مل من المتوسط مجلس الأمن القومي الشامل.
- يتم خلط 10μl لتعليق الخلية مع 90 ميكرولتر من trypaن الزرقاء لتنفيذ عدد خلايا.
ملاحظة: يمكن أيضا اخرى التخفيفات الخلية المناسبة يتم استخدامها. - ثم يتم استخدام هذه الخلايا لثقافة فرعية 1 أو 2 أو للتمييز على النحو المبين أدناه.
3. تمايز الخلايا الجذعية العصبية، والسلف، والفحص Neuroblast (NBA)
- ومطلي الخلايا الناتجة من neurospheres فصلها عند تركيز من 2-3 خلايا س 5 10 / مل في مجلس الأمن القومي المتوسطة كاملة تستكمل مع 20 نانوغرام / مل EGF، 10 نانوغرام / مل bFGF، 1 ميكروليتر / مل من الهيبارين بنسبة 0.2٪ و 5٪ حرارة المعطل FCS في قارورة الحجم المناسب زراعة الأنسجة. ويستخدم 5 مل المتوسطة لT25 مل 20، لT75 و 40 مل T175 القوارير.
ملاحظة: FCS سوف يسبب الخلايا لتعلق بحزم إلى الركيزة وليس هناك حاجة لطلاء قوارير للثقافة الدوري الاميركي للمحترفين. - عبادةثم يتم تحضين القوارير لدى عودتهم في حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 لمدة 3-4 أيام. وتسمى هذه الفترة مرحلة الانتشار، وخلالها مجلس الأمن القومي ذرية نعلق على الركيزة وتتكاثر كما أحادي الطبقة من الخلايا.
- عندما تصبح متكدسة ثقافة 90-95٪، في المتوسط من كل قارورة ووجوده في مجلس الأمن القومي المتوسطة كاملة تستكمل مع FCS 5٪ من دون أي عوامل النمو.
- يتم تحضين ثانية قوارير ثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 لآخر 3-4 أيام. وتسمى هذه الفترة مرحلة التمايز، وخلالها الأسلاف العصبية تظهر على رأس لأحادي الطبقة نجمي وتتكاثر لجعل مستعمرات الخلايا العصبية غير ناضج. في يوم 4-5 من مرحلة التمايز، والثقافة هي على استعداد لعزل الخلايا neuroblast باستخدام تكنولوجيا تدفق الخلوي.
4. التحضير لخلية التدفق الخلوي
Trypsiniالأسلحة سواء
- يغتسل ثقافة التفرقة NSC ذرية في يوم 4-5 من مرحلة التمايز مرة واحدة مع مبلغ مناسب من برنامج تلفزيوني (2 مل T25، T75 4 مل لو 8 مل T175 قارورة) لإزالة FCS من الثقافة.
ملاحظة: كتل FCS التربسين-EDTA النشاط. - ثم، يضاف كمية كافية من 0.05٪ قبل حرارة التربسين-EDTA (2 مل T25، T75 لل4 مل و 8 مل T175 قارورة) على كل قارورة لتغطية أحادي الطبقة الخلية وحضنت لمدة 1-2 دقيقة في 37 درجة مئوية حاضنة مرطب.
- يتم فحص قارورة تحت المجهر لتقييم تأثير التربسين-EDTA على الثقافة. ويعقد بعد ذلك القارورة بيد واحدة وضرب بحزم مع من جهة أخرى لإزاحة الخلايا من الجزء السفلي من القارورة.
- يضاف حجم مساو من مثبطات التربسين فول الصويا إلى قارورة إخماد نشاط التربسين. وpipetted بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا لضمان تعطيل التربسين وتحقيق خلية واحدة متجانسةتعليق.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم المتوسطة تستكمل مع FCS 5٪ لإخماد نشاط التربسين. - لإزالة عدم فصل كتل، يتم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح شبكة 40 ميكرون الحجم.
- يتم طرد بعد ذلك في تعليق خلية في 800 دورة في الدقيقة (110g) لمدة 5 دقائق، يتم إزالة طاف والخلايا إعادة علقت في حجم مناسب من مجلس الأمن القومي المتوسطة كاملة.
- يتم ضبط حجم النهائي لتعليق الخلية بحيث كثافة خلية لا يتجاوز 2-3x10 6 -cells/ml. قد يسبب ارتفاع كثافة الخلية انسداد في تدفق تيار آلة الخلوي.
- إذا كنت ترغب في عزل الخلايا العصبية تقوم فقط على خصائصها الفيزيائية، والآن يمكنك الانتقال إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز كما هو موضح في الجزء 4.
- قبل الفرز، يضاف Propidium يوديد (PI، سيغما، 500 ميكروغرام / مل في PBS) بتركيز من 1 ميكروليتر / مل من تعليق خلية لاستبعاد الخلايا الميتة.
ويعيش سلل الوسم المناعي
ويمكن لتحقيق أعلى نقاء من الخلايا العصبية، التي تحصد خلية واحدة من الثقافة الدوري الاميركي للمحترفين يمكن ملطخة لدعم البرامج والإدارة، NCAM (علامة من الأسلاف في وقت مبكر العصبية غير ناضج) وبعد ذلك الخلايا ايجابية من عدد السكان يمكن عزل الخلايا العصبية باستخدام آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- بعد تنفيذ عدد خلايا، يتم تقسيم تعليق خلية واحدة من الثقافة الدوري الاميركي للمحترفين إلى أربع مجموعات:
- وحدها مجموعة خلايا، بمثابة مراقبة لضبط المعلمات وبوابات (0.5-1 × 10 6 خلايا).
- خلايا زائد PI، بمثابة مراقبة لضبط المعلمات وبوابات (0.5-10 × 10 6 خلايا). ويمكن أيضا أن الخلايا PI سلبي من هذه المجموعة يتم فرزها على أساس الخصائص الخلايا الجسدية.
- الثانوية وحدها (Isotype السيطرة) المجموعة التي أيضا بمثابة مراقبة لضبط المعلمات وبوابات (1-2 × 10 6 خلايا).
- مجموعة المناعي لبروتين (8-10 × 10 6 خلايا) التي اتسخت لدعم البرامج والإدارة، لتحقيق NCAMمزيد من تنقية الخلايا العصبية غير ناضج. لاستبعاد الخلايا الميتة على الفرز، وأضاف بي إلى هذه المجموعة أيضا.
- لبدء الوسم المناعي، وطرد الخلايا في 800 دورة في الدقيقة (110 غ) لمدة 5 دقائق. تتم إزالة طاف والخلايا إعادة علقت في 100 ميكروليتر من المتوسطة مجلس الأمن القومي الشامل.
- يضاف فيكوإيريترين (PE) مترافق مكافحة PSA-NCAM الجسم المضاد على نسبة 10 ميكروليتر / 5-10 خلايا X 6 10 الى تعليق الخلية التي تلطخ لدعم البرامج والإدارة، NCAM. بالطريقة نفسها، يضاف مترافق PE الماوس سيطرة isotype IgG1 الضد إلى الخلية تعليق isotype السيطرة. اتبع الإرشادات التي تظهر على ورقة الضد مواصفات فيما يتعلق تركيز الأجسام المضادة لاستخدامها. ثم يتم خلط تعليق خلية بلطف وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة في الظلام.
- وطرد بعد ذلك في تعليق خلية (PSA-NCAM وأنابيب التحكم Isotype) في 800 دورة في الدقيقة (110 غ) لمدة 5 دقائق، يتم إزالة طاف والخلايا وإعادة suspended في 1 مل من المتوسط مجلس الأمن القومي الشامل.
- لإزالة الفائض من الامم المتحدة ويحدها الأجسام المضادة من العينات، يتم تكرار الخطوة 4 2-3 مرات.
- بعد إعادة تعليق الخلايا في حجم مناسب من المتوسط، Propidium يوديد (PI، سيغما، 500 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) يضاف بتركيز 1 مل / ميكرولتر من الايقاف الخلية (الخلايا زائد PI، ومراقبة isotype ودعم البرامج والإدارة، NCAM الملطخة عينات) لاستبعاد الخلايا الميتة عند تحليلها من قبل التدفق الخلوي.
- وتعد 15 مل العقيمة التي تحتوي على أنابيب الصقر 1 مل من متوسط كاملة لجمع الخلايا مرتبة من السكان مختلفة من الخلايا.
5. مضان تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) من الخلايا العصبية غير ناضج
- تم تعيين الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية حتى على أساس لها المستخدم كتيب التعليمات عن طريق فني التدفق الخلوي خبير منشأة.
- الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو أي دولة أخرى dependin الحل المناسبز بناء على تعليمات الشركة المصنعة، يمكن أن تستخدم مثل السائل غمد في 28 PSI من خلال فوهة 90 ميكرون.
- ويتم ضبط الضغط التفاضلي على مثل هذا النظام أن معدل الزناد نوع لا يتجاوز 2500 أحداث / ثانية.
- تعليق خلية من الخلايا وحدها يتم تشغيل المجموعة من خلال الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- أولا، يتم رسم الخلايا (الأحداث) على أساس حجمها (مبعثر الأمام (FSC) الضوء) مقابل تعقيد داخلي (مبعثر الجانبية (SSC) الضوء) للتمييز بين السكان مختلفة من الخلايا. للقيام بذلك، ينبغي تعديل المعلمات الجهد لجنة الخدمات المالية والضمان الاجتماعي بحيث يمكن أن ينظر إلى الخلايا في تدفق مؤامرة الخلوي.
- استبعاد كتل الخلايا والحلل، وأول من خلايا تآمر على أساس منطقة المبعثر إلى الأمام (FSC-A) إلى الأمام مقابل عرض نبض مبعثر (FSC-W) والسكان خلية واحدة هي بوابات والسكان 1 (P1). ثم يتم رسم الخلايا P1 على أساس منطقة مبعثر الجانب (SSC-A) مقابل عرض الجانب نبض مبعثر (FSC-W) وهذه المرة على الخلايا وحيدة هي جاتإد كما عدد السكان 2 (P2). وقد أنشئت هذه البوابات مرتين متتاليتين، أو كتل الحلل (FSC ارتفاع عرض النبض وارتفاع عرض نبض SSC) يتم استبعادها.
- لاستبعاد الخلايا الميتة أو المتضررة، يتم رسم الخلايا واحد (P2) على أساس التفاعل PI مقابل FSC-A واحد سكان الخلية الحية هي بوابات.
- يتم رسم الخلايا الحية واحد على أساس FSC مقابل SSC لتمييز السكان خلية مختلفة على أساس حجم الخلية والتفاصيل الداخلية. في هذه المرحلة اثنين من السكان الخلية الرئيسية هي بوابات كما SSC FSC منخفض منخفض (P3) و FSC ارتفاع محكمة أمن الدولة العليا (P4) سكان الخلية.
- لفرز PSA-NCAM المناعة على رد الفعل الخلايا العصبية غير ناضج من السكان FSC SSC منخفض منخفض، لأول مرة FSC سكان SSC منخفض منخفض من سيطرة (خلايا بي زائد والسيطرة isotype) يتم رسم مجموعات على أساس PE تفاعلية مناعية مقابل FSC-A والسلبية لل الخلايا المغلقة (P5)، وخلايا ثم إيجابي من PSA-NCAMمجموعة الملون وبوابات وعدد السكان 6 (P6).
- بعد تسوية جميع البوابات اللازمة، يتم فرز الخلايا من مصالح في 15 مل العقيمة أنابيب زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1ml NSC المتوسط.
- وطرد بعد ذلك الخلايا مرتبة في 1200 دورة في الدقيقة (240 غ) لمدة 5 دقائق.
- يتم تجاهل وطاف هو بيليه إعادة علقت في حجم مناسب من المتوسط (اعتمادا على حجم بيليه)، وعدد خلايا يتم تنفيذها.
- ومطلي ثم الخلايا في بولي-L-96-الأورنيثين لوحات مغلفة بشكل جيد في مناطق ذات كثافة الخلايا من 20-30 س 3 10 / جيد في 200-250 ميكروليتر من متوسط الكامل مع مجلس الأمن القومي FCS 5٪ و 20 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف BMP4 5 .
ملاحظة: إلى معطف 96 بئرا، و 100 ميكرولتر من حل الفريق بولي-L-الأورنيثين (1.5 مل بولي-O و 8.5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة) يضاف إلى كل بئر وحضنت لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية واحدة على الأقل ساعة. ثم، يتم إزالة بولي-O ويتم غسل كل بئر ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة(السماح للبرنامج تلفزيوني لا تزال في البئر لمدة 10 دقيقة كل مرة). استخدام 500 ميكرولتر من بولي-L-الأورنيثين العمل حل / جيد إذا تم استخدام 24 لوحات جيدة.
- ثم يتم إصلاح الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد فرز باستخدام الباردة بارافورمالدهيد 4٪ وimmunostained لمناسبة علامات الخلية العصبية والدبقية لتقييم النمط الظاهري للخلايا فرزها من السكان مختلفة من الخلايا.
6. ممثل النتائج
في الثقافة فحص neuroblast التمايز (NBA)، وخلايا مطلي نعلق على النسيج الركيزة ثقافة وتنمو كما أحادي الطبقة. اعتمادا على كثافة الخلية الأولي والطلاء، وسوف يتحول الى ثقافة ثقافة متكدسة 90-95٪ بعد 3-4 أيام. في هذه المرحلة، يمكن للأحادي الطبقة من الخلايا أساسا نجمي تكون تحت تصور مع جولة صغيرة الخلايا العصبية في سلف 4،5 أعلى (الشكل 1). بعد تحويل المتوسط إلى نمو متوسط عامل حر، والخلايا العصبية تبدأ سلفتقسيم بسرعة وتوليد مجموعات من الخلايا غير الناضجة neuroblast على رأس أحادي الطبقة نجمي في 4-5 أيام (الشكل 2). تدفق تحليل الخلوي الثقافة الدوري الاميركي للمحترفين في فصل يوم 4-5 من مرحلة التمايز، يظهر اثنين من سكان الخلية الرئيسية؛ FSC منخفض SSC المنخفضة والعالية FSC ارتفاع محكمة أمن الدولة بناء على حجم الخلية (FSC) والتفاصيل الداخلية (SSC) (الشكل 3). المناعية فلوري تحليل الخلايا مرتبة يدل على أن تقع أساسا على الخلايا العصبية في السكان FSC SSC منخفضة منخفضة (مع أكثر من 75٪ منهم من التعبير عن β-III تويولين)، في حين أن الخلايا مرتبة من السكان FSC SSC عالية عالية هي في معظمها GFAP النجمية متفاعل مناعيا (الشكل 4). ويمكن تحقيق مزيد من تنقية الخلايا العصبية غير الناضجة تصل إلى تجانس القريب (97٪) مع اختيار إيجابي من الخلايا IR-PSA NCAM من السكان FSC SSC منخفض منخفض (الشكل3، 4). الخلايا العصبية المخصب المتولدة من NSCs معزولة عن eminences الماوس E14 العقدية الحصول على النمط الظاهري GABAergic وصريحة DARPP-32، وهي علامة من الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة، على تمايز (الشكل 5).
الرقم فحص Neuroblast 1. ثقافة من خلايا فأر E14 الجذعية العصبية في يوم 4 من مرحلة الانتشار. هذه الثقافة تتكون من خلايا أحادي الطبقة نجمي شقة (النصال) تحت وجولة الخلايا الاولية العصبية (الأسهم) في الأعلى. الأصلي التكبير، 20 ×.
. الرقم فحص Neuroblast 2 ثقافة من خلايا فأر E14 الجذعية العصبية في يوم 4 من مرحلة التمايز: وعلى النقيض المرحلة)، B) تلطيخ مناعي. لاحظ مجموعة من الخلايا العصبية غير ناضج (الأسهم في A نانوغرام> وتويولين الثالث β تلطيخ في B) على رأس أحادي الطبقة نجمي (رؤساء سهم في تلطيخ GFAP، في B). الأصلي التكبير، 20 ×.
. الرقم نوع الممثل 3 قطع: أ). FSC مقابل SSC مؤامرة الفرز قبل الاستبعاد من الحلل والخلايا الميتة. B، C). مؤامرات الفرز لاستبعاد الحلل على أساس FSC والتعاون بين بلدان الجنوب نبض العرض. D). الاستبعاد من الخلايا الميتة والتالفة على أساس تفاعلية مناعية يوديد Propidium. E). FSC مقابل مؤامرة محكمة أمن الدولة بعد استبعاد الحلل والخلايا الميتة، والتي تبين السكان الرئيسيين وصفها بأنها انخفاض FSC SSC المنخفضة والعالية FSC السكان محكمة أمن الدولة العليا. F، G). المؤامرات لعزل نوع PSA-NCAM الخلايا الحمراء غير الناضجة من السكان FSC SSC المنخفضة.
الحمار = "jove_content"> 
الميكروسكوب الممثل الشكل 4. من الخلايا تم فرزها من مختلف قطاعات السكان بعد يوم واحد الطلاء. A) FSC سكان SSC منخفضة منخفضة (أكثر من 75٪ من هذه الخلايا هي الخلايا العصبية). B) FSC سكان SSC عالية عالية (غالبية هذه الخلايا هي الخلايا النجمية ). C) PSA-NCAM + الخلايا مرتبة من سكان FSC SSC منخفضة منخفضة (تقريبا كافة الخلايا مرتبة هي الخلايا العصبية). الأصلي التكبير، 20 ×.
الشكل 5. خلايا عصبية غير ناضجة الترتيب تفرق في الخلايا العصبية GABAergic (A) وصريحة DARPP-32 (B)، وهي علامة للحصول على الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قد القدرة على عزل تعريف السكان الخلايا العصبية (العصبونات، أي الخلايا النجمية وoligodendrocytes) حل بعض العقبات المرتبطة التطبيق السريري من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs). الأول، أنه يساعدنا على وصف كامل للسكان بدءا من الخلايا المانحة. الثانية، لأنها تتيح لنا استخدام نوع خلية معينة أو مزيج من أنواع مختلفة من الخلايا مع نسبة محددة، وتبعا لطبيعة أو مرحلة من مراحل المرض. وأخيرا، يمكن استخدام التخصيب قبل متباينة أسلاف الخلايا العصبية بشكل كبير تخفيض الانتشار غير المنظم ممكن، وتشكيل الأورام المرتبطة باستخدام السلائف العصبي غير المتجانسة التي تحتوي على مجلس الأمن القومي حسن النية 6. عموما سوف تمايز الخلايا الجذعية العصبية تنتج في الخلايا العصبية 5-10٪ والخلايا النجمية أكثر من 80٪. باستخدام طريقة الدوري الاميركي للمحترفين من التمايز، فإن النسبة المئوية للخلايا العصبية زيادة تصل إلى 20-30٪ ولكن لا يزال هناك الكثير من الخلايا النجمية والخلايا الجذعية وغيرها من فخلايا rogenitor في الثقافة، والتي قد لا يكون مرغوبا فيه إذا كان أحد وتنوي دراسة الخلايا العصبية في المختبر أو محض لدراسة تأثيرها العلاجي في النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية. في هذا البروتوكول، اتخذنا الاستفادة من الخلافات الكامنة في الخصائص الفيزيائية وفلوري التفرقة NSC ذرية لتنقية الخلايا العصبية غير ناضج 5. لدينا منهجية تدفق تنقية الخلوي يزيد من نسبة الخلايا العصبية 20-30٪ إلى 75-97٪ مع عدم وجود الخلايا النجمية يمكن اكتشافها والامم المتحدة ومتباينة بحسن نية الجذعية العصبية والخلايا الاولية.
قد تطبيق هذه المنهجية على NSCs الإنسان يستفيد العصبية العلاج ببدائل الخلية في مرض عصبي. يمكن لهذا النهج أيضا أن تكون مفيدة لفي الدراسات المختبرية التي تحتاج إلى عالي النقاء الخلايا الاولية العصبية مثل فحص المخدرات، neurotoxicology والدراسات التنموية والكهربية.
لتكون قادرة على شركة جنرال الكتريك على الدوامnerate عالية الجودة من الخلايا العصبية غير ناضج NSCs المتولدة من eminences الماوس E14 العقدية، ونحن نوصي بما يلي:
- عدم السماح للمجالات النمو كبيرة جدا. وترتبط neurospheres كبير مع وفاة أكثر من خلية وقدرات أقل عصبية.
- لا يعرض للتريبسين المجالات لأكثر من 2-3 دقائق. ترك التربسين لأكثر من 3 دقائق يسبب ضررا للخلايا ويقلل من كفاءتها العصبية.
- عدم السماح للأحادي الطبقة المتكاثرة أصبح الإفراط في متموجة. وهذا قد تتداخل مع عملية المفاضلة الخاصة بهم طبيعية. دائما، عندما تحول متوسطة ثقافة تصل إلى حوالي 90٪ confluency.
- لإعطاء ثقافة التغيير المتوسطة في اليوم قبل الفرز. ويمكن جمع هذه الوسيلة مكيفة في يوم الفرز واستخدامها لخلايا الطلاء. هذه الوسيلة يحتوي على الكثير من العوامل القابلة للذوبان مجهولة من الخلايا نجمي من شأنها أن تساعد في فرز الخلايا العصبية غير الناضجة من أجل البقاء والحصول على النمط الظاهري أكثر نضجا.
- كما المآخذ على هذا رتكنولوجية، ويمر على الرغم من تعليق الخلية يمكن أن تشارك فيها تدفق آلة الخلوي مع بعض المخاطر بما في ذلك قوة القص قد تؤدي إلى تلف الخلايا وتسبب موت الخلايا على نوع والتلوث الجرثومي أو الفطري أيضا. لتجنب الضرر من قبل قص قوة، ونحن نوصي فرز الخلية بسرعة مناسبة، واستخدام حق السائل غمد (ينصح PBS) وفوهات الحجم الصحيح (90-100 ميكرون) عدم السماح للمعدل الزناد نوع يتجاوز 2500 أحداث / ثانية. لتجنب التلوث، تأكد تم تنظيفها الصك بشكل صحيح باستخدام الكواشف مطهر قبل الفرز وأيضا استخدام المضادات الحيوية في المتوسط الخاص بك جمع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Biosciences | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | Dako | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega Corp. | G7121 | |
| *To make HEM, mix 1 x 10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
