Den Neuroblast analysen: en analyse for generering og berikelse av neuronal stamceller fra Skille Neural Stem Cell familie Bruke flowcytometrisystemer

Summary

Denne videoen protokollen viser en ny metode for produksjon og etterfølgende rensing av nevrale stamceller fra en fornybar kilde til nevrale stamceller (NSCs) basert på deres fysiske (størrelse og intern granularitet) og fluorescerende egenskaper ved hjelp av flowcytometri teknologi.

Abstract

Nevrale stamceller (NSCs) kan isoleres og utvidet i stor skala, med neurosphere analysen og differensiert i de tre store celletyper i sentralnervesystemet (CNS), nemlig astrocytes og oligodendrocytes og nevroner. Disse egenskapene gjør nevrale stilk og stamceller en uvurderlig fornybar kilde til celler for in vitro-studier som narkotika screening, neurotoxicology og elektrofysiologi og også for celle erstatning terapi i mange nevrologiske sykdommer. I praksis vil imidlertid heterogenitet av NSC avkom, lav produksjon av nevroner og oligodendrocytes, og overvekt av astrocytes følgende differensiering begrense sine kliniske anvendelser. Her beskriver vi en roman metode for generering og påfølgende rensing av umodne nerveceller fra murine NSC avkom med fluorescens aktivert celle sortering (FACS) teknologi. Ved hjelp av denne metoden, kan en høyanriket nevronale stamceller befolkning oppnås viddHout noen merkbar astrocyte og bona fide NSC forurensning. Prosedyren omfatter differensiering av NSC avkom isolert og utvidet fra E14 mus ganglionic eminenser bruker neurosphere analysen, etterfulgt av isolasjon og berikelse av umodne nevrale celler basert på deres fysiske (størrelse og intern kompleksitet) og fluoriserende egenskaper ved hjelp av flowcytometri teknologi. Samlet, tar det 5-7 dager å generere neurospheres og 6-8 dager til å differensiere NSC avkommet og isolere svært renset umodne nevronale celler.

Protocol

1. Grunnleggende satt opp før du går videre til Cell Culture

1. NeuroCult NSC Basal Medium og NeuroCult NSC spredning Kosttilskudd er blandet på en 9:01 ratio, henholdsvis, for å gjøre ferdig NSC medium.
2. En 37 ° C vannbad brukes til å varme opp medium.
3. Passende mengde varme inaktivert kalvefoster serum (FCS) er tint.
4. Passende mengde lager vekstfaktor løsninger inkludert epidermal vekstfaktor (EGF på 10 mikrogram / ml), grunnleggende fibroblastic vekstfaktor (b-FGF på 10 mikrogram / ml) og 0,2% heparin løsning i fosfatbufret saltvann (PBS) er tint.
5. Vevskulturstudier kolber (T25, T75 eller & T175) er nødvendig for NSC ekspansjon og differensiering.
6. Tissue kultur behandlet 96 og 24 brønners plater og glass Dekkglass er nødvendig for plating sortert celler.

2. Isolasjon, og utvidelse (Passaging) av NSCs

1. Neural stilk og stamfedre er isolert og utvidet fra mus bregn som beskrevet i egne protokoller ^{1, 2 3.}
2. Når neurospheres (enten primær eller passaged neurospheres) er klar for subkultur (150-200 mikrometer i diameter), er det medium som inneholder sfærer overført til en passende størrelse sterilt vev kultur tube, og sentrifugeres ved 800 rpm (110 g) i 5 min ved romtemperatur.
3. Supernatanten medium fjernes og kulene er re-suspendert i 1 ml forvarmes 0,05% trypsin-EDTA.
4. Etter inkubering i en 37 ° C vannbad i 2-3 min, er en tilsvarende volum soyabønner trypsin inhibitor lagt til cellesuspensjonen å stoppe trypsinaktivitet.
5. For å sikre at trypsin har blitt fullstendig inaktivert, er cellesuspensjonen forsiktig pipetteres opp og ned 3-5 ganger.
6. Etter sentrifugering ved 800 rpm (110 g) i 5 min, blir bunnfallet fjernes og cellene blir re-suspendert i 1 ml komplett NSC medium.
7. 10μl av cellesuspensjon blandes med 90 mL av trypan blå å utføre en celletall.
   Merk: Andre aktuelle celle fortynninger kan også brukes.
   
8. Cellene blir så brukt for subkultur ^{1, 2} eller for differensiering som beskrevet nedenfor.

3. Differensiering av Neural Stem og stamceller, The Neuroblast analyse (NBA)

1. Celler som følge av dissosiert neurospheres er belagt med en konsentrasjon på 2-3 x 10 ⁵ celler / ml i hele NSC medium supplert med 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 mL / ml 0,2% heparin og 5% varme inaktiveres FCS i en passende størrelse vevskultur kolbe. 5 ml medium brukes for T25, 20 ml for T75 og 40 ml for T175 kolber.
   Merk: FCS vil føre til at cellene til fast feste til underlaget, og det er ikke behov for belegg flaskene for NBA kultur.
   
2. Culture kolber blir deretter inkubert i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO ₂ i 3-4 dager. Denne perioden kalles spredning stadium, hvor NSC avkom feste til underlaget og sprer som en monolayer av celler.
3. Når kultur blir 90-95% konfluent, mediet for hver kolbe er byttet til komplett NSC medium supplert med 5% FCS uten vekstfaktorer.
4. Kultur kolber er igjen inkuberes i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO ₂ i ytterligere 3-4 dager. Denne perioden kalles differensiering scenen, der nevrale stamceller vises på toppen av en astrocytic monolayer og spre å lage kolonier av umodne nevronale celler. På dag 4-5 av differensiering scenen, er kulturen klar for isolering av neuroblast celler ved hjelp av flowcytometri teknologi.

4. Celleforberedelsen for flowcytometrisystemer

Trypsinization

1. Kulturen i differensiere NSC avkom på dag 4-5 av differensiering scenen blir vasket en gang med en passende mengde PBS (2 ml for T25, 4 ml for T75 og 8 ml for T175 kolbe) for å fjerne FCS fra kulturen.
   Merk: FCS blokker Trypsin-EDTA aktivitet.
   
2. Deretter blir en tilstrekkelig mengde forvarmes 0,05% Trypsin-EDTA (2 ml for T25, 4 ml for T75 og 8 ml for T175 kolbe) lagt til hver kolbe å dekke cellen monolayer og inkuberes 1-2 min i en 37 ° C fuktet inkubator.
3. Kolben er sjekket under mikroskop for å evaluere effekten av Trypsin-EDTA på kultur. Kolben er da holdt med den ene hånden og slo fast med den andre hånden til å løsne cellene fra bunnen av kolben.
4. Lik volum av soyabønner trypsin inhibitor legges til Kolben for å slukke trypsinaktivitet. Cellesuspensjonen er forsiktig pipetteres opp og ned for å sikre trypsin inaktivering og for å oppnå en homogen enkelt cellesuspensjon.
   Merk: Alternativt kunne medium supplert med 5% FCS brukes til å slukke trypsinaktivitet.
   
5. For å fjerne ikke-dissosiert klumper, er cellesuspensjonen passert gjennom en 40-mikrometer-size mesh filter.
6. Cellesuspensjonen blir deretter sentrifugeres ved 800 rpm (110g) i 5 min, blir bunnfallet fjernes og cellene blir re-suspendert i en passende mengde av komplett NSC medium.
7. Den endelige volum cellesuspensjon er justert slik at cellen tettheten ikke overstiger 2-3x10 ⁶ -cells/ml. Høy celle tetthet kan føre strøm blokkering i flowcytometri maskinen.
8. Hvis du ønsker å isolere nevronale celler bare basert på deres fysiske egenskaper, nå kan du fortsette å FACS sortering som beskrevet i del 4.
9. Før sortering, er propidium jodid (PI, Sigma, 500 mikrogram / ml i PBS) lagt ved en konsentrasjon på 1 mL / ml cellesuspensjon å utelukke døde celler.

Lev CELl immunolabeling

For å oppnå en høyere renhet nevrale celler, høstet enkelt celle fra NBA kultur kan farges for PSA-NCAM (en markør for tidlige umodne nevrale stamceller) og deretter de positive celler fra nevronale befolkningen kan bli isolert ved hjelp av FACS maskinen.

1. Etter å ha utført en celle teller, er det enkelt celle suspensjon fra NBA kulturen delt inn i fire grupper:
   • Celler alene gruppe, fungerer som en kontroll for å justere parametere og porter (0,5-1 x 10 ⁶ celler).
   • Celler pluss Pi, fungerer som en kontroll for å justere parametere og Gates (0,5-10 x 10 ⁶ celler). PI negative celler fra denne gruppen kan også sorteres basert på cellenes fysiske egenskaper.
   • Sekundær alene (isotype kontroll) som også fungerer som en kontroll for å justere parametere og porter (1-2 x 10 ⁶ celler).
   • Immunolabeling gruppe (8-10 x 10 ⁶ celler) som er beiset for PSA-NCAM å oppnåytterligere rensing av de umodne nevrale celler. Hvis du vil utelate døde celler upon sortering, blir PI lagt til denne gruppen også.
2. For å starte immunolabeling, blir cellene sentrifugeres ved 800 rpm (110 g) i 5 min. Supernatanten fjernes og cellene blir re-suspendert i 100 mL av fullstendig NSC medium.
3. Phycoerythrin (PE) konjugert anti-PSA-NCAM antistoffet er lagt i forholdet 10 mL / 5-10 x 10 ⁶ celler til cellesuspensjonen skal farges for PSA-NCAM. På samme måte blir en PE konjugert mus IgG1 isotype kontroll antistoff lagt til isotype kontrollen cellesuspensjon. Følg instruksjonene på antistoffet spesifikasjonsark om konsentrasjonen av antistoff som skal brukes. Cellesuspensjonen blandes deretter forsiktig og inkuberes ved romtemperatur i 10-15 min i mørket.
4. De cellesuspensjoner (PSA-NCAM og isotype kontrollrørene) blir deretter sentrifugeres ved 800 rpm (110 g) i 5 min, blir bunnfallet fjernes og cellene er re-suspended i 1 ml komplett NSC medium.
5. For å fjerne overflødig un-begrensede antistoffer fra prøvene, blir trinn 4 gjentas 2-3 ganger.
6. Etter re-suspendere celler i en passende mengde medium, propidium jodid (PI, Sigma, 500 mikrogram / ml i PBS) er lagt ved en konsentrasjon på 1 mL / ml av cellesuspensjoner (celler pluss PI, isotype kontroll og PSA- NCAM Fargede prøver) for å utelukke døde celler når analysert av flowcytometri.
7. 15 ml sterile falcon rør som inneholder 1 ml av komplett medium er forberedt på å samle sortert celler fra ulike celle populasjoner.

5. Fluorescens-aktivert Cell Sorting (FACS) av umodne Neurons

1. Den FACS maskinen er satt opp basert på bruksanvisningen instruksjon via flowcytometri anlegget ekspert tekniker.
2. Fosfatbufret saltvann (PBS) eller enhver annen egnet løsning depending på produsentens instruksjoner, kunne brukes som skjede væske på 28 PSI gjennom en 90 mikrometer dyse.
3. Differansetrykk på systemet er justert slik at den slags trigger hastigheten ikke overskrider 2500 events / sekund.
4. Cellesuspensjonen fra cellene alene gruppen drives gjennom FACS maskinen.
5. Først blir cellene (hendelser) plottet basert på deres størrelse (Forward Scatter (FSC) lys) versus intern kompleksitet (Side Scatter (SSC) lys) for å skille forskjellige celle populasjoner. For å gjøre dette, bør spenning parametere for FSC og SSC justeres slik at cellene kan ses i flowcytometri tomten.
6. Hvis du vil utelate celle klumper og dubletter, blir cellene første plottet basert på fremover scatter område (FSC-A) versus fremover scatter pulsbredde (FSC-W) og én celle befolkningen er inngjerdet som befolkningen 1 (P1). Så P1 cellene er plottet basert på side scatter område (SSC-A) versus side scatter pulsbredde (FSC-W), og denne gangen enkeltceller er gated som befolkningen 2 (P2). Etter å ha etablert disse to påfølgende porter, klumper eller dubletter (høy FSC pulsbredde og høy SSC pulsbredde) blir ekskludert.
7. For å utelukke døde eller skadede celler, blir enkeltceller (P2) plottet basert på PI reaktivitet versus FSC-A og singelen levende celle befolkning er inngjerdet.
8. Enkle levende celler er plottet basert på FSC versus SSC å skille mellom forskjellige celle populasjoner basert på celle størrelse og intern detaljnivå. På dette stadiet to viktigste celle populasjoner er inngjerdet som FSC ^lav SSC ^lav (P3) og FSC ^høy SSC ^høy (P4) celle populasjoner.
9. For å sortere PSA-NCAM immuno-reaktive umodne nevronale celler fra FSC ^lav SSC ^lav befolkning, først FSC ^lav SSC ^liten befolkning fra kontroll (celler pluss PI og isotype kontroll) grupper er plottet basert på PE immunoreaktivitets versus FSC-A og den negative cellene er gated (P5), og deretter positive celler fra PSA-NCAMbeiset gruppe er inngjerdet som befolkningen 6 (P6).
10. Etter justering alle nødvendige porter, er celler interessante sortert i 15 ml sterilt vev kultur rør som inneholder 1ml NSC medium.
11. Sortert cellene blir deretter sentrifugeres ved 1200 rpm (240 g) i 5 min.
12. Supernatanten er forkastet, og pellet på nytt suspendert i en passende mengde medium (avhengig av pellet størrelse) og en celletall utføres.
13. Cellene blir deretter belagt i Poly-L-Ornithine belagte 96-brønns plater ved en tetthet på 20-30 x 10 ³ celler / brønn i 200-250 mL av komplett NSC medium med 5% FCS og 20 ng / ml humant rekombinant BMP4 ⁵ .

Merk: å belegge 96 brønner, 100 mL av Poly-L-Ornithine arbeidende løsning (1,5 ml Poly-O og 8,5 ml steril PBS) tilsettes til hver brønn og platen inkuberes i en 37 ° C inkubator for minst ett time. Deretter er Poly-O fjernet og hver brønn vaskes tre ganger med steril PBS(La PBS forbli i brønnen i 10 min hver gang). Bruk 500 mL av Poly-L-Ornithine jobber løsning / godt hvis 24-brønns plater brukes.

14. Cellene blir deretter fast ved ulike tidspunkt etter Sorter etter kald 4% paraformaldehyde og immunostained for hensiktsmessige nevrale og glial celle markører for å vurdere fenotypen av sorterte celler fra forskjellige celle populasjoner.

6. Representative Resultater

I neuroblast analysen (NBA) differensiering kultur, gullbelagte celler feste til vevskultur underlaget og vokse som en monolayer. Avhengig første celle plating tetthet, vil kulturen slå inn en 90-95% konfluent kultur etter 3-4 dager. På dette stadiet, kan en monolayer av hovedsakelig astrocytic celler bli visualisert under med små runde nevrale stamceller på toppen ^4,5 (figur 1). Etter bytte mediet til en vekstfaktor gratis medium, nevrale stamceller startdele raskt og generere klynger av umodne neuroblast celler på toppen av astrocytic monolayer i 4-5 dager (figur 2). Flowcytometri analyse av dissosiert NBA kultur på dag 4-5 av differensiering scenen, viser to viktigste celle populasjoner; FSC ^lav SSC ^lave og FSC ^høy SSC ^høy basert på celle størrelse (FSC) og intern granularitet (SSC) (figur 3). Immuno-fluorescerende analyse av de sorterte cellene viser at de nevrale celler er hovedsakelig lokalisert i FSC ^lave SSC ^lave populasjoner (med mer enn 75% av dem uttrykke β-III tubulin), mens sortert celler fra FSC ^høy SSC ^høy befolkningen er for det meste GFAP immunoreactive astrocytes (figur 4). Ytterligere rensing av umodne nevrale celler opp til nær homogenitet (97%) kunne oppnås med positiv utvelgelse av PSA-NCAM IR celler fra FSC ^lav SSC ^lav befolkning (figur3, 4). Beriket nevronale celler generert fra NSCs isolert fra E14 mus ganglionic eminenser anskaffe en GABAergic fenotype og ekspress DARPP-32, en markør for middels spiny nevroner, ved differensiering (figur 5).

Figur 1. Neuroblast analysen kultur fra E14 mus nevrale stamceller på dag 4 av spredning scenen. Dette monolayer kultur består av flate astrocytic celler (pilspisser) under og runde nevrale progenitorceller (piler) på toppen. Opprinnelig forstørrelse, 20 x.

. Figur 2 Neuroblast analysen kultur fra E14 mus nevrale stamceller på dag 4 av differensiering scenen: A) Fase kontrast, B) Immunofluorescent flekker. Legg merke til klyngen av umodne nevrale celler (pilene i A B) på toppen av astrocytic monolayer (pil hoder i A, GFAP farging i B). Opprinnelig forstørrelse, 20 x.

. Figur 3 Representative sortere plott: A). FSC vs SSC slags tomt før ekskludering av dubletter og døde celler. B, C). Sorter tomter for utelukkelse av dubletter basert på FSC og SSC pulsbredde. D). Utelukkelse av døde og skadede celler basert på propidium jodid immunoreaktivitets. E). FSC vs SSC tomt etter ekskludering av dubletter og døde celler, som viser de to viktigste bestandene merket som FSC ^lav SSC ^lav og FSC ^høye SSC ^høye bestander. F, G). Sorter tomter å isolere PSA-NCAM IR umodne celler fra FSC ^lav SSC ^lav befolkning.

Figur 4. Representative mikrografer fra celler sortert fra ulike populasjoner en dag etter platekledning. A) FSC ^lav SSC ^lav befolkning (mer enn 75% av disse cellene er nevroner). B) FSC ^høy SSC ^høy befolkning (de fleste av disse cellene er astrocytes ). C) PSA-NCAM ⁺ sorterte celler fra FSC ^lav SSC ^lav befolkning (nesten alle de sorterte cellene er nevroner). Original Forstørrelse, 20 x.

Figur 5. Sortert umodne nerveceller differensiere i GABAergic nevroner (A) og hurtigbåter DARPP-32 (B), en markør for middels spiny nevroner.

Discussion

Muligheten til å isolere definerte nevrale celle populasjoner (dvs. nevroner, astrocytes og oligodendrocytes) kan løse noen av de hindringer knyttet til klinisk anvendelse av nevrale stamceller (NSCs). Først gjør det oss til å fullt ut karakterisere starter befolkning av donor cellene. For det andre gir det oss å bruke en bestemt celletype eller en kombinasjon av forskjellige celletyper med en bestemt ratio, avhengig av art eller stadium av sykdommen. Til slutt kan bruke høyanriket pre-differensierte nevrale celler stamfedre dramatisk redusere mulig ukontrollert spredning og svulst formasjonen forbundet med å bruke heterogene nevrale forløpere inneholder bona fide NSC ^seks. Vanligvis differensiering av nevrale stamceller vil resultere i 5-10% nevronale celler og mer enn 80% astrocytes. Bruke NBA metode for differensiering, vil andelen av nevrale celler øke opp til 20-30%, men fortsatt er det mange astrocytes og andre stevner og progenitor celler i kultur, som kanskje ikke er ønskelig hvis man ville tenkt å studere rene nevronale celler in vitro eller for å studere deres terapeutiske effekt i dyremodeller av nevrologiske sykdommer. I denne protokollen, tok vi fordel av iboende forskjeller i de fysiske og fluoriserende egenskaper differensiere NSC avkom å rense umodne nevronale celler ^fem. Vår flowcytometri rensing metodikk øker andelen av nevrale celler fra 20-30% til 75-97% uten påvisbare astrocytes og un-differensiert bona fide nevrale stamceller og progenitorceller.

Anvendelse av denne metodikken til menneskelige NSCs kan ha nytte neuronal celle erstatning terapi i nevrologisk sykdom. Denne tilnærmingen kan også være nyttig for in vitro-studier som trenger høyt renset nevrale stamceller som narkotika screening, neurotoxicology, utviklingsstudier og elektrofysiologi.

For å kunne konsekvent generate høy kvalitet umodne nerveceller fra NSCs generert fra E14 mus ganglionic eminenser, anbefaler vi:

1. Ikke for å la kulene blir for stor. Store neurospheres er assosiert med mer celledød og mindre nevrogene evner.
2. Ikke for å trypsinize kulene for mer enn 2-3 minutter. Leaving trypsin for mer enn 3 minutter forårsaker skade på cellene og reduserer deres nevrogen effektivitet.
3. Ikke for å la proliferating monolayer bli over-konfluent. Dette kan forstyrre normal differensiering prosess. Alltid, bytter medium når kulturen når omtrent 90% confluency.
4. For å gi kulturen et medium endring på dagen før sorteringen. Dette betinget medium kan hentes på dagen for slag og brukes for plating celler. Dette mediet inneholder en rekke uidentifiserte løselige faktorer fra de astrocytic cellene som vil hjelpe de sorterte umodne neuronal celler til å overleve og få en mer moden fenotype.
5. Som ulemper til denne technology, passerer cellesuspensjon om flowcytometri maskin kan assosieres med noen risiko, inkludert klipping kraft som kan skade cellene og forårsake celledød ved slag og også sopp eller bakteriell forurensning. For å unngå skader ved klipping kraft, anbefaler vi sortering cellen i en passende hastighet, og bruker akkurat slire væske (PBS anbefales) og riktig størrelse dyser (90-100 mikrometer) ikke å la den slags trigger hastigheten overstiger 2500 events / sekund. For å unngå forurensning, pass på at instrumentet er rengjort ordentlig ved desinfiserende reagenser før sortere og også bruke antibiotika i din innsamling medium.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Antibody	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE- Conjugated mouse IgG1	Isotype control antibody	BD Biosciences	556029
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
HrBMP-4	Growth factor	R&D Systems	314-BP-010
Poly-L-Ornithine	Reagent	Sigma-Aldrich	P4957
Fetal Calf Serum	Medium Supplement	GIBCO, by Life Technologies	10099-141
GFAP	Antibody	Dako	Z0334
B-III tubulin	Antibody	Promega Corp.	G7121
*To make HEM, mix 1 x 10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.