Summary
Aquí se demuestra que el nuevo desarrollo • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. Dos células etapa de desarrollo del embrión con esperma congelado-descongelado se ha mejorado consistentemente en cinco cepas de ratón con el uso de este kit. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones genéticamente modificados fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado con éxito por fecundación in vitro.
Abstract
Miles de nuevos genéticamente modificados (GM) de las cepas de ratones han sido creados desde el advenimiento de las tecnologías de la transgénesis y el golpe de gracia. Muchos de estos valiosos animales sólo existen como animales vivos, sin un plan de copia de seguridad en caso de emergencia. La criopreservación de embriones puede ofrecer esta copia de seguridad, pero es costoso, puede ser un procedimiento prolongado y generalmente requiere de un gran número de animales para el éxito. Desde el descubrimiento de que los espermatozoides de ratón pueden ser criopreservados con éxito con un agente crioprotector básicos (CPA) que consiste de 18% de rafinosa y 3% de leche desnatada, la criopreservación de espermatozoides se ha convertido en un procedimiento aceptable y rentable para el almacenamiento, distribución y recuperación de estas cepas valiosas .
Aquí se demuestra un nuevo desarrollo de I • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. El esperma de cinco cepas de uso común de los ratones consanguíneos fueron congelados con este kit y luego se recuperó. Mayores relaciones de protección de la motilidad espermática (>60%) y la motilidad progresiva rápida (> 45%) en comparación con el control (básica CPA) se observó que los espermatozoides congelados con este kit de cinco cepas de ratones endogámicos. Dos etapas de desarrollo de las células de embriones después de la fecundación in vitro con el esperma recuperado se ha mejorado consistentemente en todas las cinco cepas de ratones examinados. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones transgénicos fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado por fecundación in vitro.
Protocol
1. Criopreservación de espermatozoides de ratón
- Para cada línea para ser criopreservados, prepare lo siguiente antes de comenzar.
- Un pozo de una placa de cuatro pocillos con 240 l de kit de CPA
- 15 pajuelas de criopreservación de espermatozoides de la siguiente manera
- Conecte el pajuelas de 0,25 ml a las jeringas de 1 ml con tapón de algodón cercano a la jeringa. En cada uno de paja, carga de 8 cm (aproximadamente 160 l) de medio de fertilización in vitro, y luego de 1 cm de aire. Etiqueta de la paja con el nombre de la línea para ser preservado.
- LN 2 debe ser de 15 cm de profundidad en el cuadro de espuma. Cierre la tapa.
- La eutanasia a dos ratones machos de cada línea para ser criopreservados. Los ratones deben ser entre 10 y 60 semanas. Retire los dos epidídimos caudal, junto con el conducto deferente de cada ratón.
- Coloque el epidídimo en el CPA previamente preparado que contiene los pocillos de una placa de 4 pocillos (paso 1.1).
- Hacer 5-7 cortes longitudinales en cada epidídimo y suavementeApriete cada conducto deferente para empujar el esperma hacia fuera.
- Agite la mezcla de CPA y el epidídimo con la mano suavemente a temperatura ambiente durante 3-5 minutos. Esto permitirá a los espermatozoides a nadar.
- Utilizando la paja previamente preparado, aspirar 5 mm (aproximadamente 10 l) de suspensión de esperma y luego de 1 cm de aire.
- Repita este proceso con hasta un total de 15 pajillas. De carga y el sello paja a los 10 minutos para la supervivencia mejores espermatozoides.
- Termosellado ambos lados de la paja con cuidado. Coloque la paja en el recipiente de congelación con la columna de los espermatozoides en primer lugar.
- Coloque la pipeta de 1 ml proporciona como parte del kit de la lata para extender el mango. Coloque el recipiente en LN 2 en el cuadro de espuma a través del agujero en la tapa. Deje que el frasco para flotar verticalmente en la LN 2 durante 10 minutos.
- Sumergir el recipiente en el LN2. Los espermatozoides criopreservados y ahora se puede mover a largo plazo de almacenamiento de LN 2.
- El envase no debe ser utilizado parala siguiente línea hasta que se calienta hasta la temperatura ambiente.
2. Ratón superovulación
- En general, el uso de ratones hembra jóvenes el mismo fondo que los donantes de esperma.
- Los ratones deben ser ~ 12 g (3-4 semanas de edad).
- Realizar una inyección intraperitoneal con IU 5.10 de embarazadas gonadotropina de suero de yegua (PMSG).
- Espere 46 a 48 horas.
- Realizar una inyección intraperitoneal con IU 5.10 de la gonadotropina coriónica humana (hCG).
- Los ovocitos de la cosecha 14-16 h después de la inyección de hCG como se describe a continuación.
3. Ratón de recuperación de espermatozoides y fecundación in vitro
- Antes de la FIV, para cada uno de paja para ser descongelado, preparar la siguiente y equilibrar durante al menos una hora en un 37 ° C incubadora de CO 2.
- Espermatozoides plato de incubación: una placa de Petri de 35 mm, con una caída de 90 l de medio de tratamiento de esperma (STM) cubierto con aceite.
- Corte de plato: Para la recogida de ovocitos de un máximo de 10 superovulated mujeres, una de 35 mm placa de Petri con 3 ml de medio de fertilización in vitro.
- Fecundación in vitro, así: Para cada grupo de 5 mujeres superovuladas para la FIV, un pocillo de una placa de 4 y con 500 l de medio de FIV (si está utilizando 10 hembras superovuladas, por ejemplo, se necesitan 2 pozos...)
- Lavar los platos: una placa de Petri de 35 mm con 3 ml de potasio simple medio optimizado (KSOM) para el lavado de cada pocillo de la placa de FIV 4-bien utilizado
- Placa de cultivo: una placa de Petri de 35 mm con 50 gotas l de medio KSOM cubiertos con aceite para el cultivo de embriones de cada pocillo de la placa de la FIV.
- Eliminar una paja de LN 2 y colóquelo en un baño de agua 37 º C durante 2-3 minutos.
- Quitar la paja del baño de agua y limpiar para eliminar el exceso de agua. Haga el primer corte cerca de la primera columna de aire más cercano al tapón de algodón. Cortar la paja en el medio de FIV seguirá habiendo una columna de aire visible antes de la columna de los espermatozoides.
- A continuación, corte el extremo de la paja en el segunda columna de aire, teniendo cuidado de evitar el corte de la columna de los espermatozoides. Corte en un ángulo de 45 - esto hará que sea mucho más fácil para aspirar a los espermatozoides.
- Aspirar la suspensión de esperma desde el extremo distal de la paja con una pipeta 200 microlitros.
- Lugar la suspensión de esperma en el centro de la caída de STM y se incuba la placa durante 45-60 minutos en un 37 ° C al 5% de CO 2 incubadora.
- Durante la incubación de espermatozoides, diseccionar los oviductos de las hembras superovuladas en el plato de corte. Use una aguja de 30 g o fórceps para rasgar cada oviducto, la liberación de los complejos cumulus-ovocito (COC). Evite la grasa y la sangre en el medio de la FIV como sucio para los medios de comunicación hace que el lavado de medidas adicionales.
- Una vez que todos los oviductos se han roto, la transferencia de los anticonceptivos orales combinados de cinco mujeres de cada pozos de fecundación in vitro. El número de AOC producidos por superovulación es muy dependiente de la cepa.
- Recoger 10-15 l de esperma de la periferia de la caída de STM y abonar una fecundación in vitro y aproximadamente 14-16 horas después de la hCG injexión. Repita la fertilización para cada bien utilizado. La concentración de esperma final será de aproximadamente 1 millón / ml.
- Cocultivo de espermatozoides y ovocitos durante 4-6 horas en un 37 ° C 5% de CO 2 incubadora.
- Lavado de los embriones con KSOM un mínimo de 2 veces y la cultura en forma de gotas KSOM para el desarrollo en un 37 ° C 5% de CO 2 incubadora.
- Tasa de fecundación in vitro se ha calculado como dos embriones de células etapa de total de ovocitos utilizados después de la cultura durante la noche.
4. Resultados representante
El esperma de 5 cepas puras ratón Charles River se congeló. Las relaciones de protección se calcula dividiendo los valores de evaluación de los espermatozoides congelados en fresco valores de esperma de evaluación. Relaciones de protección de la motilidad de los espermatozoides fueron 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% para C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl y BALB / cAnNCrl, respectivamente. Relaciones de protección para la motilidad progresiva rápida fueron 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl y BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 1).
Las tasas de fecundación in vitro con esperma congelado-descongelado fueron el 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% y 26,2% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl y BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 2) .
Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones transgénicos fueron archivados por la crioconservación de esperma. Estas líneas fueron más tarde recuperados con éxito (según la definición de los cachorros nacidos vivos) por fecundación in vitro en 4 cepas de mujeres (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 y 129Sv) (Fig. 3).
Figura 1. Las relaciones de protección de la motilidad espermática y la motilidad progresiva rápida en los ratones
Figura 2. Fertilización in vitro con semen congelado-descongelado en ratones
3713fig3.jpg "/>
Figura 3. Fecundación in vitro con espermatozoides congelados-descongelados en ratones modificados genéticamente
Discussion
Desde 1990, el Protocolo de congelar el semen básico con 18% de rafinosa y 3% de leche desnatada se ha demostrado su fiabilidad en muchas cepas de ratones y un gran número de líneas de ratón han sido criopreservados 1,2,3,4,5,6,7. Las principales causas de daño a las células de esperma durante el proceso de congelación y descongelación se han asociado con la formación de hielo 8,9 y especies reactivas de oxígeno 10. La suplementación con atrapadores de radicales libres, tales como los aminoácidos, y agentes reductores, como monotioglicerol, en el medio de congelación fue investigado y probado para incrementar sustancialmente la tasa de FIV con espermatozoides congelados-descongelados en las cepas puras como los C57BL / 6 11,6.
En el presente Protocolo, se desarrolló un nuevo I • Cryo kit para la criopreservación de espermatozoides de ratón mediante la optimización de la CPA básicos disponibles en el mercado con los antioxidantes y los bloqueadores de hielo y modificando la congelación de espermatozoides y la fecundación in vitro. Relaciones de protección de la motilidad de los espermatozoides(> 60%) y la motilidad progresiva rápida (> 45%) se observó que los espermatozoides de cinco cepas de ratones endogámicos congelados con el I • Kit de Cryo. El 2 de células embrión en su fase de desarrollo con tasa de espermatozoides congelados-descongelados en cinco cepas de ratones endogámicos se mejoró notablemente en comparación con el que, con base CPA 11,6.
En el uso del kit, el usuario crea una suspensión de esperma concentrado por congelar el semen de dos machos por cada línea. Sólo por congelación 15 pajillas el proceso es rápido, sencillo y ocupa menos espacio de almacenamiento para el almacenamiento de corto o largo plazo. Mayoría de las veces, las líneas de ratón pueden ser recuperados por la descongelación sólo 1 o 2 popotes.
Disclosures
Los autores son empleados de Charles River, el fabricante de este equipo.
Acknowledgments
La investigación presentada aquí fue apoyado por Charles River. Los autores están muy agradecidos a los modelos obtenidos mediante ingeniería genética y el grupo de servicios y el personal de Embriología de cuidado de los animales y la inyección de la hormona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
