Summary
כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאושש בהצלחה על ידי הפריה חוץ גופית.
Abstract
אלפי החדשה שונה גנטית (GM) זנים של עכברים שנוצרו מאז כניסתו של טכנולוגיות transgenesis ו בנוקאאוט. רבים מהם בעלי ערך קיים רק בבעלי חיים, בלי תוכנית גיבוי למקרה חירום. Cryopreservation של עוברים יכולים לספק גיבוי זה, אבל הוא יקר, יכול להיות תהליך ארוך, ובדרך כלל דורש מספר רב של בעלי חיים להצלחה. מאז גילויו כי זרע העכבר ניתן cryopreserved בהצלחה עם סוכן cryoprotective בסיסי (רו"ח) המורכב raffinose 18% ו 3% חלב רזה, cryopreservation הזרע הפך הליך מקובל וחסכוני עבור אחסון, הפצה ההתאוששות של אלו זנים בעלי ערך .
כאן אנו מדגימים פיתח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. הזרע של חמישה זנים נפוץ בשימוש של עכברים טבועה הוקפאו באמצעות ערכת התאושש לאחר מכן. הגנה יחס גבוה של תנועתיות הזרע (>60%) ו תנועתיות פרוגרסיבית מהירה (> 45%) לעומת לשלוט (בסיסי רו"ח) נראו עבור זרע קפוא עם ערכת זה 5 זנים עכבר מולדת. בשלב שני התא עובר התפתחות לאחר הפריה חוץ גופית עם הזרע התאוששה היה שיפור עקבי בכל 5 זנים העכבר נבדק. במשך 1.5 שנים, 49 קווי GM עכבר היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכת והתאושש מאוחר יותר על ידי הפריה חוץ גופית.
Protocol
1. הזרע עכבר cryopreservation
- עבור כל שורה להיות cryopreserved, להכין את הדברים הבאים לפני תחילת.
- 1 גם מנה 4-היטב עם l 240 של ערכת רו"ח
- 15 cryopreservation זרע בקש כדלקמן
- חבר את קשיות 0.25 מ"ל ל 1 מזרקים מ"ל עם פקק הכותנה הקרובים המזרק. ב קש כל העומס 8 ס"מ (כ 160 μl) של המדיום IVF, אז 1 ס"מ של אוויר. תווית קשיות עם השם של הקו להישמר.
- LN 2 צריך להיות 15 ס"מ עמוק בתיבה קצף. סגור את המכסה.
- להרדים 2 עכברים זכרים מכל קו להיות cryopreserved. העכברים צריכים להיות בין 10 ל 60 שבועות. הסר את שני epididymides הזנב יחד עם הזרע הזרע של כל עכבר.
- מניחים את epididymides לתוך מוכן בעבר רו"ח המכילים גם מנה של 4 באר (שלב 1.1).
- לקצץ אורך 5-7 ב יותרת האשך כל ובעדינותלסחוט כל הזרע הזרע כדי לדחוף את הזרע החוצה.
- לנער את התערובת רו"ח יותרת האשך ביד בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות. זה יאפשר הזרע לשחות החוצה.
- בעזרת קש מוכן קודם לכן, לשאוב 5 מ"מ (כ 10 μl) ההשעיה הזרע ולאחר מכן 1 ס"מ של אוויר.
- חזור על תהליך זה עם עד לסך של 15 קשיות. טען ולאטום קשיות בתוך 10 דקות להישרדות הזרע הטוב ביותר.
- מחממים חותם בשני הצדדים של הקשית בזהירות. מניחים את קשיות במכל הקפאת זרע עם הטור הראשון.
- צרף את פיפטה 1 מ"ל המסופק כחלק של ערכת אל מיכל להאריך את הידית. מניחים את מיכל ב LN 2 בתיבה קצף דרך החור במכסה. אפשר את המכל לצוף אנכית ב LN 2 במשך 10 דקות.
- לטבול את המכל על LN2. הזרע הוא cryopreserved כעת ניתן להעביר את האחסון לטווח ארוך 2 LN.
- המכל לא אמור לשמש עבורלשורה הבאה עד שהוא מחומם לטמפרטורת החדר.
2. עכבר superovulation
- בדרך כלל, להשתמש נקבות עכברים צעירים בעלי רקע זהה תורמי זרע.
- עכברים צריך להיות ~ 12 גרם (3-4 שבועות של גיל).
- ביצוע זריקה intraperitoneal עם 5-10 IU של סוסה בהריון גונדוטרופין בסרום (PMSG).
- המתן 46-48 שעות.
- ביצוע זריקה intraperitoneal עם 5-10 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG).
- ביציות קציר 14-16 שעות לאחר ההזרקה hCG כמתואר להלן.
3. הזרע עכבר התאוששות IVF
- לפני IVF, קש עבור כל צורך להפשיר, להכין את הבאים לאזן לפחות שעה אחת 37 ° C-CO 2 באינקובטור.
- הדגירה צלחת הזרע: האחת צלחת פטרי 35 מ"מ, עם ירידה של 90 μl של המדיום זרע הטיפול (STM) מכוסה בשמן.
- חיתוך המנה: עבור אוסף הביצית מתוך מקסימום של 10 sהנקבות uperovulated, אחד 35 מ"מ צלחת פטרי עם 3 מ"ל של מדיום IVF.
- הפריה חוץ גופית היטב: עבור כל קבוצה של 5 נשים superovulated עבור הפריה חוץ גופית, אחד טוב של תבשיל 4 היטב עם 500 μl של המדיום IVF (אם אתה משתמש ב 10 נקבות superovulated, למשל, תצטרך 2 בארות...)
- כביסה צלחת: אחד צלחת פטרי 35 מ"מ עם 3 מ"ל של אשלגן סימפלקס בינוני אופטימיזציה (KSOM) לרחצה גם כל מנה 4-IVF היטב בשימוש
- צלחת תרבות: אחד 35 מ"מ צלחת פטרי עם 50 טיפות של μl בינוני KSOM מכוסה שמן לתרבות עובר מבאר כל המנה IVF.
- הסרת קש מ LN 2 ומניחים אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים למשך 2-3 דקות.
- הסר את הקש מן האמבט במים ולנגב כדי להסיר את עודפי המים. בצע את החיתוך הראשון קרוב בעמודה האווירית הראשונה הקרוב התקע כותנה. חותכים את קש במדיום IVF יש עדיין יהיה טור אוויר גלוי לפני הטור הזרע.
- ואז לחתוך את קצה הקשית בשנות הטור econd האוויר, להיות זהיר, כדי למנוע קיצוץ טור הזרע. גזור בזווית של 45 - זה יעשה את זה הרבה יותר קל לשאוב את הזרע.
- לשאוב את ההשעיה זרע מהקצה הדיסטלי של קש עם pipettor 200 μl.
- מניחים את ההשעיה הזרע במרכז טיפת STM ו דגירה את המנה עבור 45-60 דקות 37 ° C 5% CO 2 באינקובטור.
- במהלך הדגירה הזרע, לנתח את oviducts של הנקבות superovulated לתוך צלחת החיתוך. שימוש במחט 30 גרם או מלקחיים לקרוע כל oviduct, שחרור הביצית קומולוס-מתחמי (COCs). הימנע שומן ודם במדיום IVF כמזוהם התקשורת עושה צעדים כביסה נוספת.
- לאחר כל oviducts היו קרועים, העברת COCs מתוך 5 נקבות לכל בארות IVF. מספר COCs המיוצר על ידי superovulation הוא זן מאוד תלוי.
- איסוף 10-15 μl של זרע מהפריפריה הירידה STM ולדשן one IVF גם כ 14-16 שעות שלאחר inj hCGection. חזור על הפריה עבור כל שימוש היטב. ריכוז הזרע הסופי יהיה כ 1 מיליון / מ"ל.
- Coculture זרע וביציות של 4-6 שעות 37 ° C 5% CO 2 באינקובטור.
- לשטוף את העוברים עם מינימום של 2 פעמים KSOM ותרבות טיפות KSOM לפיתוח ב 37 ° C 5% CO 2 באינקובטור.
- שיעור IVF חושבה כמו שני עוברים שלב התא מתוך סה"כ ביציות שימוש לאחר תרבות לילה.
4. נציג תוצאות
זרע מ -5 זנים צ'ארלס ריבר עכבר מולדת היה קפוא. יחסי להגנת הם מחושב על ידי חלוקת קפואים הערכה ערכים זרע ידי ערכים הערכה זרע טרי. יחסי הגנה על תנועתיות הזרע היו 60.2%, 81.3%, 78.6%, 66.5%, 61.0% עבור C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ו BALB / cAnNCrl, בהתאמה. יחסי הגנה תנועתיות פרוגרסיבית מהיר היו 47.3%, 69.4%, 57.0%, 52.8%, 54.1% ב C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ו BALB / cAnNCrl, בהתאמה (איור 1).
שיעורי הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא מופשר היו 55.7%, 26.4%, 87.3%, 87.8% ו 26.2% ב C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ו BALB / cAnNCrl, בהתאמה (איור 2) .
במשך 1.5 שנים, 49 קווי GM עכבר היו בארכיון cryopreservation על ידי הזרע. קווים אלה היו לאחר מכן התאושש בהצלחה (כפי שהוגדר על ידי חיים גורי נולד) על ידי הפריה חוץ גופית ב 4 זנים נקביים (C57BL / 6, BALB / C, DBA / 1 ו 129Sv) (איור 3).
באיור 1. יחסי הגנה על תנועתיות הזרע ואת תנועתיות פרוגרסיבית מהיר ב עכברים
2. איור הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא, מופשר של עכברים
3713fig3.jpg "/>
באיור 3. הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא, מופשר ב עכברים GM
Discussion
מאז שנת 1990, הקפאת הזרע בסיסי באמצעות פרוטוקול raffinose 18% ו 3% חלב רזה הוכח אמין זנים רבים של עכברים מספר רב של קווי העכבר כבר cryopreserved 1,2,3,4,5,6,7. הגורמים העיקריים לנזק לתאי זרע במהלך הקפאת תהליך ההפשרה קושרו עם היווצרות קרח 8,9 ו - 10 מינים חמצן תגובתי. תוספת של נוגדי רדיקלים חופשיים, כגון חומצות אמינו, וסוכני צמצום, כגון monothioglycerol, במדיום הקפאת נחקר והוכח באופן משמעותי להגדיל את שיעור הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא מופשר של זנים טהורים כולל C57BL / 6 11,6.
בפרוטוקול הנוכחי, פיתחנו חדש אני cryo • ערכת cryopreservation זרע העכבר על ידי אופטימיזציה של רו"ח בסיסית עם נוגדי חמצון זמינים מסחרית חוסמי קרח על ידי שינוי הקפאת זרע הליך ההפריה החוץ גופית. הגנה יחסי של תנועתיות הזרע(> 60%) ו תנועתיות פרוגרסיבית מהירה (> 45%) נצפו במשך הזרע של חמישה זנים טהורים עכבר קפוא עם • אני cryo הערכה. 2 תאים העובר בשלב התפתחות שיעור עם זרע קפוא מופשר ב 5 זנים טהורים העכבר היה שיפור ניכר בהשוואה לזו עם בסיסי רו"ח 11,6.
במהלך השימוש בערכה, המשתמש יוצר ההשעיה זרע מרוכז על ידי הקפאת זרע של 2 גברים על כל שורה. על ידי הקפאה רק 15 קשיות התהליך הוא מהיר, קל תופסת פחות מקום אחסון לאחסון קצר או לטווח ארוך. רוב הפעמים, קווי העכבר ניתן לשחזר על ידי הפשרת רק 1 או 2 קשיות.
Disclosures
המחברים הם עובדים של צ'ארלס ריבר, יצרנית ערכת הזה.
Acknowledgments
המחקר המוצג כאן נתמכה על ידי צ'ארלס ריבר. המחברים מודים ביותר של מודלים מהונדסים גנטית וקבוצת שירותים וצוות אמבריולוגיה לטיפול בבעלי חיים הזרקת ההורמון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
