Summary
Her kan vi demonstrere nyutviklet I • Cryo kit for mus sperm nedfrysing. To-cellers stadiet embryo utvikling med frossen-tint sperm ble forbedret konsekvent i 5 musestammer med bruk av dette settet. Over en 1,5 års periode, var 49 genmodifiserte mus linjer arkivert av sperm nedfrysing med I • Cryo kit og senere hell gjenopprettes ved IVF.
Abstract
Tusenvis av nye genmodifiserte (GM) stammer av mus har blitt opprettet siden advent av transgenesis og knockout teknologier. Mange av disse verdifulle dyr eksisterer bare som levende dyr, med ingen backup plan i tilfelle nødssituasjon. Nedfrysing av befruktede egg kan gi denne backup, men er kostbare, kan være en lang prosedyre, og generelt krever et stort antall dyr for å lykkes. Siden oppdagelsen av at musen sperm kan være vellykket cryopreserved med en grunnleggende cryoprotective agent (CPA) bestående av 18% raffinose og 3% skummet melk, har sperm nedfrysing blitt en akseptabel og kostnadseffektiv prosedyre for arkivering, distribusjon og gjenvinning av disse verdifulle stammer .
Her kan vi demonstrere en nyutviklet I • Cryo kit for mus sperm nedfrysing. Sperm fra fem brukte stammer av innavlede mus ble frosset bruke dette settet og deretter gjenopprettes. Høyere beskyttelse forholdstall på sperm motilitet (>60%) og rask progressiv motilitet (> 45%) sammenliknet med kontrollgruppen (grunnleggende CPA) ble sett for spermier frosset med dette settet i 5 innavlede mus stammer. To celle stadiet embryo utvikling etter IVF med den gjenopprettede sperm ble forbedret konsekvent i alle 5 musestammer undersøkt. Over en 1,5 års periode, ble 49 GM mus linjer arkivert av sperm nedfrysing med I • Cryo kit og senere gjenfunnet ved IVF.
Protocol
1. Mus sperm nedfrysing
- For hver linje å være cryopreserved, forberede følgende før begynnelsen.
- 1-brønnen i en 4-godt parabolen med 240 l kit CPA
- 15 sperm nedfrysing sugerør som følger
- Koble 0,25 ml sugerør til 1 ml sprøyter med bomull plugg nærmest sprøyten. I hvert strå, last 8 cm (ca. 160 mL) av IVF medium, deretter 1 cm av luft. Label strå med navnet på linjen for å bli bevart.
- LN 2 bør være 15 cm dypt i skum boksen. Lukk lokket.
- Avlive to hannmus fra hver linje å være cryopreserved. Mus bør være mellom 10 og 60 uker gamle. Fjern de to caudal epididymides sammen med vas deferens fra hver mus.
- Plasser epididymides inn den tidligere forberedt CPA-holdige vel om en 4-godt parabolen (trinn 1.1).
- Lag 5-7 langsgående kutt i hver bitestikkel og forsiktigklem hver vas deferens å presse sperm ut.
- Rist CPA og bitestikkel blanding hånd forsiktig ved romtemperatur i 3-5 minutter. Dette vil tillate sædcellene å svømme ut.
- Bruke tidligere forberedt halm, aspirer 5 mm (ca. 10 mL) av sperm suspensjon og deretter 1 cm av luft.
- Gjenta denne prosessen med opp til totalt 15 sugerør. Load og forsegle sugerør innen 10 minutter for best sperm overleve.
- Varmeforseglet begge sider av halm nøye. Plasser strå i den iskalde beholderen med sperm kolonnen først.
- Fest 1 ml pipette leveres som en del av settet til beholderen for å forlenge håndtaket. Plasser beholderen i LN 2 i skum boksen gjennom hullet i lokket. La beholderen til å flyte vertikalt i LN 2 for 10 minutter.
- Dypp beholderen i LN2. Sperm er nå cryopreserved og kan flyttes til langsiktig LN 2 lagring.
- Beholderen bør ikke brukes forneste linje før det er varmet opp til romtemperatur.
2. Mus superovulasjon
- Vanligvis bruker unge kvinnelige mus av den samme bakgrunnen som sædgiver.
- Mus bør ~ 12 g (3-4 ukers alder).
- Utfør en intraperitoneal injeksjon med 5-10 IE Pregnant hoppen serum gonadotropin (PMSG).
- Vent 46-48 timer.
- Utfør en intraperitoneal injeksjon med 5-10 IE av humant choriongonadotropin (hCG).
- Høste oocytter 14-16 timer etter hCG-injeksjon som beskrevet nedenfor.
3. Mus sperm utvinning og IVF
- Før IVF, for hver halm å bli tint, klargjøre følgende og likevekt i minst en time i en 37 ° C CO 2 inkubator.
- Sperm inkubering rett: en 35 mm petriskål, med en 90 mL dråpe sperm behandling medium (STM) dekket med olje.
- Cutting rett: For oocytten samling fra maksimalt 10 superovulated hunner, en 35 mm petriskål med 3 ml IVF medium.
- IVF godt: For hver gruppe på 5 superovulated kvinner for IVF, én brønn av en 4 godt tallerken med 500 mL av IVF medium (hvis du bruker 10 superovulated kvinner, for eksempel, vil du trenger 2 brønner...)
- Vasking rett: en 35 mm petriskål med 3 ml av kalium simplex optimalisert medium (KSOM) for vask hver brønn av de 4-brønnen IVF parabolen brukt
- Kultur parabol: en 35 mm petriskål med 50 mL dråper KSOM medium dekket med olje for embryo kultur fra hver brønn på IVF parabolen.
- Ta et strå fra LN 2 og sted i en 37 ° C vannbad i 2-3 minutter.
- Fjern halm fra vannbad og tørk for å fjerne overflødig vann. Gjør det første kuttet nær den første luften kolonnen nærmest bomull pluggen. Skjær halm i IVF medium vil det fortsatt være en luft kolonne synlig før sperm kolonnen.
- Deretter kuttet enden av halm i Second luft kolonne, er forsiktig med å slippe å klippe sperm kolonnen. Skjær i 45 vinkel - dette vil gjøre det mye lettere å suge sperm.
- Aspirer sperm suspensjon fra den distale enden av halm med en 200 mL pipette.
- Plasser sperm suspensjon i midten av STM slipp og inkuber fatet i 45-60 minutter i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Under sperm inkubasjonstiden, dissekere oviduktene av superovulated kvinner inn i cutting parabolen. Bruk en 30 g nål eller pinsett til å rive hver oviduct, slippe cumulus-oocytten komplekser (p-piller). Unngå fett og blod i IVF medium som skitne media gjør for ekstra vask trinn.
- Når alle oviduktene har blitt revet, overføre p-piller fra 5 hunner til hver IVF brønner. Antall p-piller produsert av superovulasjon er belastningen veldig avhengig.
- Samle 10-15 mL av spermier fra periferien av STM slipp og befrukte en IVF vel ca 14-16 timer etter hCG injection. Gjenta befruktning for hver brønn som brukes. Endelig sperm konsentrasjon vil være ca 1 million / ml.
- Coculture sædceller og eggceller for 4-6 timer i 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Vask embryoene med KSOM minimum 2 ganger og kultur i KSOM dråper for utvikling i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- IVF er beregnet som to celle stadiet embryo ut av total ubefruktede egg brukes etter natten kultur.
Fire. Representant Resultater
Sperm fra 5 Charles River mus innavlede stammer var frosset. Beskyttelse forholdstall beregnes ved å dividere frossen sperm vurdering verdier av frisk sperm vurdering verdier. Beskyttelse forholdstall på sperm motilitet var 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% for C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, og BALB / cAnNCrl, henholdsvis. Beskyttelse forholdstall for rask progressiv motilitet var 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% i C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, og BALB / cAnNCrl, henholdsvis (fig 1).
Den IVF priser med frossen-tint sperm var 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% og 26,2% i C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, og BALB / cAnNCrl, henholdsvis (fig 2) .
Over en 1,5 års periode, ble 49 GM mus linjer arkivert av sperm nedfrysing. Disse linjene ble senere vellykket resirkulasjon (som definert av levende valper født) ved IVF i 4 kvinnelige stammer (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 og 129Sv) (fig 3).
Figur 1. Vern prosenter av spermiemotilitet og Rapid progressiv motilitet i Mus
Figur 2. In vitro-fertilisering med Frozen-tint Sperm i Mus
3713fig3.jpg "/>
Figur 3. In vitro fertilisering med Frozen-tint Sperm i GM Mus
Discussion
Siden 1990 har de grunnleggende sperm frysing protokollen med 18% raffinose og 3% skummet melk blitt bevist pålitelig i mange stammer av mus og et stort antall mus linjer har blitt cryopreserved 1,2,3,4,5,6,7. De viktigste årsakene til skade på sædceller under frysing og tining prosessen har vært forbundet med isdannelse 8,9 og reaktive oksygen arter 10. Tilskudd med frie radikaler scavengers, som aminosyrer, og reduksjonsmidler som monothioglycerol, i iskalde medium ble undersøkt og vist seg å øke IVF sats med frossen-tint sperm i innavlede stammer inkludert C57BL / 6 11,6.
I den aktuelle protokollen, utviklet vi en ny I • Cryo kit for mus sperm nedfrysing ved å optimalisere grunnleggende CPA med kommersielt tilgjengelige antioksidanter og is blokkere og ved å endre sperm frysing og IVF prosedyre. Beskyttelse forholdstall på sperm motilitet(> 60%) og rask progressiv motilitet (> 45%) ble sett for sperm fra fem innavlede mus stammer frosset med I • Cryo kit. Det 2-cellers stadiet embryo utvikling sats med frossen-tint sperm i 5 mus innavlede stammer har blitt kraftig forbedret sammenlignet med grunnleggende CPA 11,6.
Ved å bruke kit, oppretter brukeren en konsentrert sperm suspensjon ved frysing sperm fra to hanner for hver linje. Ved å kun frysing 15 sugerør prosessen er rask, enkel og opptar mindre lagringsplass for kort eller lang tids lagring. De fleste ganger, kan mus linjer gjenvinnes ved tining bare 1 eller 2 sugerør.
Disclosures
Forfatterne er ansatt av Charles River, skaperen av dette settet.
Acknowledgments
Forskningen presenteres her ble støttet av Charles River. Forfatterne er mest takknemlig for genmodifisert Modeller og tjenester gruppen og Embryology personalet for dyr omsorg og hormon injeksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
