Summary
Här kan vi visa den nyutvecklade I • Cryo-kit för mus spermier frysförvaring. Två-cell stadium embryo utveckling med frysta-tinade spermier förbättrades genomgående i 5 musstammar med hjälp av denna sats. Över en 1,5 år, var 49 genförändrad mus linjer arkiveras av spermier frysförvaring med I • Cryo-kit och senare lyckosamt har bärgats med IVF.
Abstract
Tusentals nya genetiskt modifierade (GM) stammar av möss har skapats sedan tillkomsten av genmodifiering och knockout-teknik. Många av dessa värdefulla djur endast existerar som levande djur, utan backup plan i en nödsituation. Frysförvaring av embryon kan ge den här säkerhetskopian, men är kostsamt, kan vara en långdragen procedur, och i allmänhet kräver ett stort antal djur för framgång. Sedan upptäckten att musen spermier framgångsrikt kan frysförvarade med en grundläggande cryoprotective agent (CPA) som består av 18% raffinos och 3% skummjölk, har spermier frysförvaring blivit en acceptabel och kostnadseffektiv förfarande för arkivering, distribution och återvinning av dessa värdefulla stammar .
Här visar vi en nyutvecklad I • Cryo-kit för mus spermier frysförvaring. Spermier från fem ofta använda stammar av inavlade möss frystes med hjälp av detta kit och sedan återvinnas. Högre skydd förhållandet mellan spermierörlighet (>60%) och snabb progressiv motilitet (> 45%) jämfört med kontrollgruppen (grundläggande CPA) sågs för spermier frysas med detta kit i 5 inavlade musstammar. Två cell stadium embryots utveckling efter IVF med det återvunna spermier förbättrades konsekvent på samtliga fem granskade musstammar. Över en 1,5 år, var 49 GM mus linjer arkiveras av spermier frysförvaring med I • Cryo-kit och senare återvinnas genom IVF.
Protocol
1. Mus spermier frysförvaring
- För varje rad ska frysförvarade, förbereda följande innan du börjar.
- 1 brunn på en 4-väl fat med 240 liter kit CPA
- 15 spermier frysförvaring strån enligt följande
- Anslut 0,25 ml strån till 1 ml sprutor med den bomull kontakten närmast sprutan. I varje halm, last 8 cm (cirka 160 l) av IVF medium, då 1 cm luft. Märk sugrör med namnet på den linje som skall bevaras.
- LN 2 bör vara 15 cm djup i skummet rutan. Stäng locket.
- Euthanize 2 hanmöss från varje rad som ska frysförvarade. Möss ska vara mellan 10 och 60 veckor gamla. Ta bort de två caudal bitestiklar tillsammans med sädesledaren från varje mus.
- Placera bitestiklar i den tidigare beredda CPA-innehållande väl om en 4-väl skål (steg 1,1).
- Gör 5-7 längsgående snitt i varje bitestiklarna och försiktigtkrama varje sädesledarna att driva spermier ut.
- Skaka CPA och bitestiklarna blandning för hand försiktigt i rumstemperatur i 3-5 minuter. Detta gör att spermier att simma ut.
- Utifrån den tidigare beredda halm, aspirera 5 mm (ca 10 l) av spermier fjädring och sedan 1 cm av luft.
- Upprepa processen med upp till totalt 15 sugrör. Ladda och tätning sugrör inom 10 minuter för bästa spermierna överleva.
- Värmeförseglat båda sidorna av halm noggrant. Placera strån i det iskalla burk med spermier kolumnen först.
- Fäst 1 ml pipett som en del av satsen för att kapseln att förlänga handtaget. Placera behållaren i LN 2 i skummet lådan genom hålet i locket. Låt behållaren flyta vertikalt i LN 2 i 10 minuter.
- Sänk behållaren i LN2. Spermierna är nu frysförvarade och kan flyttas till långsiktiga LN 2 lagring.
- Behållaren bör inte användas förnästa rad tills den värms upp till rumstemperatur.
2. Mus superovulation
- Generellt använder unga honmöss i samma bakgrund som spermadonatorer.
- Möss ska ~ 12 g (3-4 veckors ålder).
- Gör en intraperitoneal injektion med 5-10 IE Gravida sto serum gonadotropin (PMSG).
- Vänta 46-48 timmar.
- Gör en intraperitoneal injektion med 5-10 IE humant koriongonadotropin (hCG).
- Harvest oocyter 14-16 timmar efter hCG-injektionen som beskrivs nedan.
3. Mus spermier återhämtning och IVF
- Innan IVF, för varje halm som ska tinas, förbereda följande och jämvikta i minst en timme vid 37 ° C CO 2 inkubator.
- Spermier inkubation maträtt: en 35 mm petriskål, med en 90 l droppe sperma behandling medium (STM) täckt med olja.
- Kapning maträtt: För äggcellen samling från högst 10 superovulated kvinnor, en 35 mm petriskål med 3 ml IVF medium.
- IVF väl: För varje grupp av 5 superovulated honor för IVF, en brunn på en 4 väl rätt med 500 l av IVF medium (om du använder 10 superovulated honor, till exempel, behöver du 2 brunnar...)
- Tvätt maträtt: en 35 mm petriskål med 3 ml kalium simplex optimerade medium (KSOM) för tvätt varje brunn på 4-välanvänt IVF maträtt
- Kultur maträtt: en 35 mm petriskål med 50 l droppar KSOM medelstora täckt med olja för embryo kultur från varje brunn på IVF skålen.
- Ta ett sugrör från LN-2 och placera i en 37 ° C vattenbad i 2-3 minuter.
- Ta bort halmen från vattenbadet och torka för att ta bort överflödigt vatten. Den första uttagningen nära den första luftpelaren närmast bomull kontakten. Skär halm i IVF-mediet kommer det fortfarande att vara en luftpelaren synligt innan spermierna kolumnen.
- Klipp slutet av halm i Second luftpelaren Var noga med att undvika att skära av spermier kolumnen. Skär i 45 vinkel - detta kommer att göra det mycket lättare att aspirera spermierna.
- Sug spermierna avstängning från distala änden av halm med en 200 l pipett.
- Placera spermier fjädring i mitten av STM droppe och inkubera skålen i 45-60 minuter i 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Under spermier inkubation dissekera äggledarna av superovulated honor i skärande skålen. Använd en 30 g nål eller pincett för att riva varje äggledare, släppa Cumulus-äggcellen komplex (COC). Undvik fett och blod i IVF-medium som smutsiga medier gör extra tvätt steg.
- När alla äggledarna har rivits, överföra kombinerade p-piller från 5 honor till varje IVF brunnar. Antalet p-piller som produceras av superovulation är stammen mycket beroende.
- Samla 10-15 l av spermier från periferin av STM droppe och befrukta en IVF väl ca 14-16 timmar efter hCG-injAvsnitt. Upprepa befruktning för varje används väl. Final spermiekoncentration blir ca 1 miljon / ml.
- Coculture spermier och ägg i 4-6 timmar i 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Tvätta embryon med KSOM minst 2 gånger och kultur i KSOM droppar för utvecklingen i ett 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- IVF beräknades som två embryon cell stadium av totalt oocyter användas efter natten kultur.
4. Representativa resultat
Spermier från 5 Charles River mus inavlade stammar var frusen. Skydd nyckeltal beräknas genom att dividera frysta värden sperma bedömning av färska värden spermier bedömning. Skydd förhållandet mellan spermierörlighet var 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% för C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl och BALB / cAnNCrl, respektive. Skydd nyckeltal för snabba progressiv motilitet var 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% i C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl och BALB / cAnNCrl, respektive (Fig. 1).
IVF priser med frysta-tinade spermier var 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% och 26,2% i C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl och BALB / cAnNCrl, respektive (Fig. 2) .
Över en 1,5 år, var 49 GM mus linjer arkiveras av spermier frysförvaring. Dessa rader har senare framgångsrikt återvinnas (enligt definitionen i levande födda ungar) genom IVF i 4 kvinnliga stammar (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 och 129Sv) (Fig. 3).
Figur 1. Skydd Nyckeltal för spermiernas rörlighet och snabbt tilltagande Motility hos möss
Figur 2. Befruktning in vitro med frysta-tinade spermier hos möss
3713fig3.jpg "/>
Figur 3. Provrörsbefruktning med frysta-tinade spermier i GM Möss
Discussion
Sedan 1990 har den grundläggande spermier frysning protokollet använder 18% raffinos och 3% lättmjölk har visat sig vara tillförlitliga i många stammar av möss och ett stort antal av mus-linjer har frysförvarade 1,2,3,4,5,6,7. De viktigaste orsakerna till skador på spermier under frysning och upptining processen har satts i samband med isbildning 8,9 och reaktiva ämnen syre 10. Tillskott av fria radikaler, såsom aminosyror, och reduktionsmedel såsom Monothioglycerol, i det iskalla mediet var undersökt och visat sig kraftigt öka IVF takt med frusna-tinade spermier i inavlade stammar inklusive C57BL / 6 11,6.
I det nuvarande protokollet, utvecklade vi en ny I • Cryo-kit för mus spermier frysförvaring genom att optimera den grundläggande CPA med kommersiellt tillgängliga antioxidanter och blockerare is och genom att ändra spermier frysning och IVF-förfarande. Skydd förhållandet mellan spermierörlighet(> 60%) och snabbt tilltagande motilitet (> 45%) observerades för spermier från fem inavlade musstammar frysta med det jag • Cryo kit. Den 2-cell stadium embryo utvecklingen takt med frusna-tinade spermier i 5 mus inavlade stammar har förbättrats markant jämfört med den som med grundläggande CPA 11,6.
Genom att använda satsen skapar användaren en koncentrerad spermier avstängning genom att frysa spermier från 2 hanar för varje rad. Genom att endast frysning 15 strån processen är snabb, enkel och upptar mindre utrymme för kortare eller långtidsförvaring. De flesta gånger kan musen linjer återvinnas genom upptining bara 1 eller 2 sugrör.
Disclosures
Författarna är anställda av Charles River, tillverkaren av denna sats.
Acknowledgments
Den forskning som presenteras här stöds av Charles River. Författarna är mycket tacksam mot genmanipulerade modeller och tjänster grupp och embryologi personal för djurvård och hormon injektion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
