Summary
وتلقيح
Abstract
والكروزية الالتهابات الحادة المثقبية المكتسبة في سن الرضاعة والطفولة تبدو أعراض، ولكن ما يقرب من ثلث الحالات المصابة بشكل مزمن تظهر داء شاغاس تصل إلى ثلاثة عقود أو في وقت لاحق. المناعة الذاتية والمثابرة طفيلي تتنافس النظريات لتفسير الآلية المرضية لداء شاغاس 1 و 2. إلى أدوار منفصلة لعبت من قبل استمرار طفيلي والمناعة الذاتية في مرض شاغاس نحن تطعيم في T. الكروزية في غرفة الهواء من البويضات المخصبة. النظام المناعي الدجاج ناضج هو حاجز ضيق البيولوجية ضد ت. يتم القضاء على الكروزية والعدوى وعلى تطوير نظام المناعة في نهاية الأسبوع الأول من نمو 3. الكتاكيت هي خالية من طفيلي عند الفقس، ولكنها تحتفظ دمجها طفيلي الميتوكوندريا kinetoplast الحمض النووي (kDNA) minicircle ضمن الجينوم الخاصة بهم التي يتم نقلها إلى ذريتها. تم الحصول على وثائق من التكامل kDNA minicircle في جينوم الدجاج من قبل targeted رئيس الذيل PCR، التهجين الجنوبية، والاستنساخ، والتسلسل 3 و 4. وkDNA minicircle التكامل تمزق الإطارات القراءة مفتوحة للنسخ والعوامل الجهاز المناعي، والفوسفاتيز (GTPase)، محلقة الأدينيلات وphosphorylases (بي كي سي، NF-B كابا المنشط، PI-3K) المرتبطة فسيولوجيا الخلية، والنمو، والتمايز 3، 5 - 7 وظائف الجينات الأخرى. ويعتبر التهاب عضلة القلب شديدة بسبب الرفض من ألياف قلب الهدف بواسطة الخلايا اللمفية المستجيبات السامة للخلايا في الدجاج kDNA تحور، مبديا التهابات عضلة القلب شبيهة بتلك التي شوهدت في مرض شاغاس الإنسان. وجدير بالذكر أن فشل القلب والهيكل العظمي وضعف العضلات موجودة في الدجاج الكبار مع تمزق kDNA من الجين dystrophin في كروموسوم 1 8. وترتبط التعديلات genotipic مماثلة مع تدمير الأنسجة التي تقوم بها المستجيبات CD45 +، + CD8γδ، CD8α الخلايا اللمفية. وبالتالي يمكن لهذه العدوى الأوالي حمل أمراض المناعة الذاتية يحركها وراثيا.
Protocol
1. نمو الطفيليات
- تنمو أشكال السائط المثقبي ت. الكروزية برنيس وβ-غالاكتوزيداز في التعبير عن T. Tulahuen الكروزية MHOM/CH/00 C4 في الخلية العضلية الفئران (L6) المزروعة في المتوسط Dulbecco أساسي مع الحد الأدنى من الاستقرار المالي بنسبة 10٪، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / لتر، و 250 نيوتن متر L-glutamin (درجة الحموضة 7.2)، 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. استخدمت trypomastigotes الحرة السباحة في المتوسط طاف لتطعيم بيض الدجاج.
- تنمو الليشمانية البرازيلية (رطل) LTB300 الأوراق المالية التي تزرع في DMEM مع FBS 20٪. وقد استخدم النموذج المشيقة رطل في مرحلة النمو المتسارع لتطعيم البيض 9.
2. طفيلي التلقيح في بيض الدجاج المخصب
- تطعيم تعليق من 100 T. الكروزية trypomastigotes في 10 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة من خلال فتحة قطرها 2 ملم في قشرة البيضة على رأس غرفة هواء من مرحلةX البيض الخصبة. وسيتم عرض وتكرار غزو الطفيليات الخبيثة إلى خلايا الجنين في S1 الفيديو. مجموعات المراقبة هي كما يلي: دجاجة السيطرة)؛ ب) بيض سيطرة وهمية التي تتلقى 10 ميكرولتر من متوسط الثقافة، ج) المرحلة X البيض خصبة تلقيح مع تعليق promastigotes 100 رطلا في 10 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة ت. الكروزية ورطل تنتمي إلى عائلة kinetoplastid. على التوالي، وهذه الأوليات تنمو حرة في السيتوبلازم أو في فجوة parasitophorous من الخلايا المضيفة 10.
- اغلاق الثقوب بشريط لاصق.
- احتضان T. الكروزية المصابين البيض وعينات سيطرة وهمية وغير المصابة على 37،5 درجة مئوية والرطوبة 65٪ لمدة 21 يوما.
- الحفاظ على الدجاج الذي يفقس في الحاضنة لمدة 24 ساعة وبعد ذلك في 32 درجة مئوية لمدة ثلاثة أسابيع.
3. الحصول على عينات لاستخراج الحمض النووي
- وقد تم الحصول على الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى من الدجاج: أ)تحاك من T. بيض الكروزية تلقيح ب) الضوابط ج) يسخر التي تتلقى 10 ميكرولتر من متوسط الثقافة، د) من فقس البيض رطل تلقيح؛ تتم معالجة خلايا الدم البيضاء من الدواجن لاستخراج الحمض النووي وفقا لبروتوكول قياسي 11.
- استخراج الحمض النووي أيضا من السائل المنوي جمعها من الديكة، و من البويضات unfertile (<5 ملم) التي تم جمعها من الدجاج والبيض فقس من تلقيح مع ت. الكروزية، والدجاج من فقس البيض من سيطرة 3 و 4.
- استخراج kDNA من T. الكروزية شعرورة أشكال و، أيضا، من promastigotes رطل، كما هو موضح في مكان آخر 9.
4. الاشعال وتحقيقات مستعملة
وسيتم عرض الاشعال تستخدم لتضخيم ال PCR والظروف الحرارية في الجدول رقم 1.
وكانت تحقيقات المستخدمة في التهجين وصمة عار الجنوبية:
- من النوع البري minicircle (~ 1.4 كيلوبايت) متواليات بوريfied من T. الكروزية أشكال شعرورة؛
- Minicircle شظايا (362 بي بي) التي حصلت عليها من هضم NSI أنا من النوع البري kDNA؛
- النووي DNA (nDNA) تسلسل المتكررة (188 بي بي) التي حصلت عليها من تضخيم الحمض النووي طفيلي مع الاشعال Tcz1 / 2. وتنقيته من تحقيقات من 1٪ الاغاروز المواد الهلامية 3.
- من النوع البري minicircle (~ 0،820 كيلو بايت) متواليات من promastigotes رطل.
5. تحليل PCR
- تشغيل معيار PCR الداخلي مع السلطات الوطنية المعينة الجينومية من الفراخ المصابة وغير المصابة، ونسخر من الضوابط باستخدام T. الكروزية nDNA Tcz1 2/12 و 13 kDNA s35/s36 الاشعال. أيضا، تشغيل PCR مع السلطات الوطنية المعينة الجينومية من الدجاج والبيض فقس من المصابين رطل باستخدام الأوالي محددة Lb3 وLb5 الاشعال (الجدول 1).
- جعل مزيج التفاعل مع 100 نانوغرام قالب الحمض النووي، 0.4 ميكرومتر من كل زوج من البادئات (2)، الحمض النووي بوليميريز طق U، 0.2 ملم dNTP، و 1.5 ملي MgCl
- وضع برنامج thermocycler عن 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و 30 دورات من 30 ثانية في 95 ° C/30 ثانية في 68 ° C / 1 دقيقة في 72 درجة مئوية مع تمديد 5 دقائق الأخيرة قبل التبريد.
- تحليل منتجات التضخيم في 1.3٪ الاغاروز هلام، والتي يتم نقلها إلى غشاء نايلون إيجابيا المشحون (GE علوم الحياة) من خلال طريقة القلوية للتهجين مع تحقيقات محددة المسمى مع [α P-32] dATP استخدام عشوائي التمهيدي كيت وصفها (إينفيتروجن ، كارلسباد، كاليفورنيا).
6. جنوب البقع الجينومية
- استخدم مبو أنا و / أو مع RI ايكو (إينفيتروجن) الانزيمات التي تجعل من التخفيضات واحد في minicircles دمجها في عينات من الحمض النووي من أنسجة الجسم.
- هضم الحمض النووي من سيطرة الدجاج غير المصاب والدجاج من فقس البيض من تلقيح مع T. ضراوة الكروزية النماذج.
- موضوع للهضم من الحمض النووي من T. والكروزيةلفحص عينات الدجاج إلى الكهربائي في 0.8٪ الاغاروز هلام في 50 V بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- نقل نطاقات فصل الحمض النووي إلى غشاء نايلون موجبة.
- هجن العصابات الحمض النووي مع kDNA راديو التحقيق المسمى.
- غسل غشاء مرتين لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية مع SSC 2X و 0.1٪ SDS، مرتين لمدة 15 دقيقة في 65 درجة مئوية مع كل SSC 0.2X و 0.1٪ SDS، وصورة الإشعاع الذاتي لفترات متفاوتة من الزمن.
7. استهدفت رئيس الذيل PCR
- الحصول على التضخيم من kDNA minicircle تندمج في جينوم الدجاج بواسطة تقنية PCR تعديل الذيل، والذي يجمع بين الاشعال kDNA مع التمهيدي معين يحدد 2 في 3 المشي في دورات متداخلة PCR، كما هو مبين في الشكل رقم 1.
- دورة الابتدائية: كل رد فعل تشمل 200 نانوغرام قالب الحمض النووي، 2.5 ملم MgCl 2، و 0.4 ميكرومتر من الاشعال kDNA (S34 أو S67)، dNTPs 0.2 ملم، 2.5 البلاتين طق يو (إينفيتروجن، كارلسباد، CA). استخدام بادئات kDNA في تركيبة مع 0.04 ميكرومتر من الاشعال جيغاغرام (Gg1 إلى Gg6، الجدول رقم 1)، على حدة. ضبط درجات الحرارة 57،9 حتي 60،1 درجة مئوية لمدة الاشعال kDNA و 59،9 حتي 65،6 درجة مئوية لمدة التمهيدي CR-1. لاحظ أن هذه تكون درجات الحرارة أعلى من تلك التي (~ 45 درجة مئوية) المطلوبة لالاشعال التعسفي تدهورت المستخدمة في ال 10 الذيل PCR. استخدام درجة الحرارة ودورات (MyCycle Thermocycler، بيو راد مختبرات، هرقل، كاليفورنيا) وصفها في ورقة عمل سابقة 3.
- المرحلة الثانوية: خفف من منتجات PCR 1:40 المرحلة الابتدائية (V / V) في الماء. استبدال kDNA الاشعال S35 و S35 والعقاقير السابقة، جنبا إلى جنب مع الاشعال جيغاغرام نفسه.
- دورة التعليم العالي: خفف من منتجات PCR 1:10 المرحلة الثانوية (V / V) في الجمع بين الماء والاشعال جيغاغرام مع العقاقير أو S67 S36، بشكل منفصل.
- استنساخ PCR المنتجات دورة الثالثة: استنساخ مباشرة في ناقلات تي pGEM سهل (Promega، ماديسون، ويسكونسن)منتجات التضخيم الماضي ان التحقيق مع هجن kDNA.
- حدد استنساخ بواسطة التهجين مع مسبار kDNA وتسلسل.
- تحقق من صحة tpTAIL-PCR في مزيج من 300 خريج من kDNA من T. الكروزية مع 200 نانوغرام من الحمض النووي من الطيور المعرضة للسيطرة أبدا kDNA. دورات درجة الحرارة والتضخيم هي نفسها المستخدمة في الحمض النووي للطيور اختبار '.
8. شاغاس مظهر من مظاهر مرض عيادة
- رصد النمو والتنمية من الدجاج التي تحاك من T. الكروزية المصابين من البيض وتفقس من الاصحاء غير المصابين البيض يوميا لمدة الوفيات والأسبوعية لمظاهر المرض.
- كشف العيوب السريرية في تلك الدجاج (الشكل 2) وجعل تخطيط القلب (ECG) تسجيلات لتقييم محاور الكهربائية، ومعدل ضربات القلب وعدم انتظام ضربات القلب 3.
- موضوع kDNA-تحور وتسيطر على الدجاج شهريا لتسجيلات تخطيط القلب من البطين المعزز للامم المتحدةipolar يؤدي الاتجاهات: I (ساقه اليسرى)، اتجاه الذراع (الذراع اليسرى)، وAVR (الذراع الأيمن)، وتقييم الانحراف من محور الكهربائية يعني إلى اليسار، والذي هو موح من تضخم القلب 3.
9. علم الأمراض وImmunochemical تحليلات
- سجل قلب والفهارس من وزن الجسم بعد وفاة طبيعية من الدجاج kDNA تحور (الشكل 3). الحصول على فهارس للدجاج أيضا مراقبة من نفس العمر والجنس.
- أخذ المقاطع من القلب والمريء والأمعاء والعضلات والهيكل العظمي والرئتين والكبد، والكليتين.
- إصلاح الأنسجة في 10٪ مخزنة الفورمالين (درجة الحموضة 7.4)، تغرس في البارافين وخفض الى 4 ميكرون أبواب سميكة لالهيماتوكسيلين-يوزين (سعادة) وتلطيخ تحليل النسيجي (الشكل 3).
- الحصاد وتنصيف أنسجة من الأجنة التي تحاك من البيض تلقيح مع طفيليات معربا عن β-غالاكتوزيداز، وتخضع لX-غال، وصمة عار. 9
- تحديد النصف الآخر من أنسجة الجنين في 10٪ من الفورمالين، ودرجة الحموضة 7.4 والمضي قدما كما في الخطوة 9.3.
- قطع رقيقة 4μm قسم البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج وجبل على شريحة زجاجية للفحص المجهري.
- احتضان المقاطع تظهر X-غال الملطخة الخلايا الزرقاء مع مصل داء شاغاس البشري (1:1024 تخفيف) ضد المضادة للت. الكروزية مستضد.
- غسل أقسام محة بصر مع برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق لكل منهما.
- وصمة عار الخلايا الزرقاء في أنسجة الجنين بواسطة حضانة الثانية مع أرنب فلوريسئين مترافق المضادة للمفتش الإنسان.
- غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني (الخطوة 8)، وجبل مع ساترة ومراقبة الخلايا الضوء الأزرق الهاتفي الأخضر عند الفحص تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في طول الموجة نانومتر 502، 200X التكبير، لcolocalizing ت. الكروزية في خلايا الجنين.
10. خلايا الجهاز المناعي النمط الظاهري في آفات القلب
- النمط الظاهري المناعي المستجيبات الخلايا في المقاطع النسيجية من قلب من kDNA إيجابية والدجاج من kDNA سلبية السيطرة.
- وضع الشرائح معقسم الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإذابة الشمع السابقة لتقديمه في أربع يغسل في 100٪ إلى 70٪ الزايلين وبعد ذلك في برنامج تلفزيوني الإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- شطف الشرائح في الماء المقطر، الهواء الجاف، والتعامل مع الاجسام المضادة المحددة (فلوريسئين أو R-فيكوإيريترين مترافق الاجسام المضادة) التي تم الحصول عليها من SouthernBiotech، برمنغهام، ال.
- استخدام الماوس المضادة للدجاج بو-1 (بو 1 (أ) و بو-1 الأليلات ب، السيد 70-75 كيلو دالتون) ماب AV20 الاعتراف المحدد monomorphic على مستضدات الخلايا B من الدجاج الفطرية.
- استخدام الماوس المضادة للدجاج CD45، الإيج isotype IgM1 κ محددة لخلايا الدجاج نسب الغدة الصعترية (السيد 190-215 كيلو دالتون، البديل).
- استخدام الماوس المضادة للدجاج TCRγδ + (السيد 90 كيلو دالتون مثنوي مغاير) ماب محددة لخلايا الغدة الصعترية تعتمد + CD8α تي.
- استخدام الماوس المضادة للدجاج ماب CD-8 محددة لسلسلة α الدجاج (السيد 34 كيلو دالتون) تعترف عشره CD8 الخلايا في thymocytes والطحال، والقلب، والأنسجة الأخرى.
- استخدام الماوس المضادة للدجاج KuL01 على الاعتراف على وجه الحصر حيدات / الضامة للنظام بلعمية.
- غسل الشريحة ثلاث مرات مع PBS 0.1 M، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق كل حضانة بعد مع الجسم المضاد لمكافحة النمط الظاهري محددة لمدة 90 دقيقة في غرفة رطبة.
- تجمع الشريحة مع الجلسرين مخزنة للامتحان تحت المجهر ضوء الفلورسنت مع مرشح الانبعاثات من 567 نانومتر الطول الموجي و502، على التوالي، للكشف عن الخلايا الحمراء والخضراء مضان المسمى (الشكل 4).
11. بيانات التحاليل
- استخدام قاعدة بيانات الجينوم الدجاج ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi؟taxid=9031 ) لتحليل تسلسل BLASTn.
- استخدم التحالفات CLUSTALW لتحديد البريد قيمة العشرات.
- توظيف GIخوارزمية RI اخفاء تكرار الرقيب ( http://girinst.org/censor/index.php ) لتوطين فئات مختلفة من يكرر في تسلسل خيالية.
- توظيف الإدراج Kinetoplastid وأداة الحذف البحث تسلسل (قبلة) للتعرف على gRNAs المحتملة في متواليات kDNA، مع المعونة من وو Blastn المعدلة مصفوفة 3.
- استخدم ت. تسلسل الكروزية http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas للبحث في gRNAs في الوهم الحمض النووي kDNA المضيف. 11.6) يستخدم الطالب في تي والاختبارات Kolmorov-سميرنوف، على التوالي، للكشف عن اختلافات كبيرة بين الانحرافات من محاور الكهربائية وبين الفهارس وزن القلب / الجسم تم الحصول عليها في المجموعتين التجريبية والضابطة، والكشف عن نسب وفيات اختلافات كبيرة بين مجموعات من الدجاج التي تحاك من T. أنا الكروزيةnoculated من البيض والضوابط.
12. ممثل النتائج
من التلقيح من 100 T. ضراوة trypomastigotes الكروزية الى غرفة الهواء من بيض الدجاج خصبة لا يقلل بشكل كبير من نسب الكتاكيت فقس على قيد الحياة. ما يقرب من 60٪ تفقس الصيصان صحي و 40٪ قد يتعرض لتسييل الغاز الطبيعي الجنين أو وفاة الجنين عند الفقس. الدجاج على قيد الحياة الاحتفاظ تسلسل minicircle kDNA متكاملة في الجينوم. ومع ذلك، فإنه من المتوقع أن بعض الدجاج يموت مع تضخم القلب والفشل في الأسابيع بعد الفقس. وسوف الدجاج المتبقية تنمو إلى البالغين الأصحاء ظاهريا. في جميع مراحل الحياة من شأنها أن الحمض النووي المستخرج من خلايا الدم وحيدات النوى تسفر عن التضخيم PCR من kDNA، ولكن ليس nDNA. وسوف المستهدفة العقاري الذيل PCR 3، 4 المنتجات التي يتم استنساخ وتسلسل عرض minicircles دمج kDNA بشكل رئيسي في مناطق الترميز macrochromosomes 1 إلى 5. الدجاج تبين kDNA متعددة أناntegrations في الجينات ترميز لنمو الخلايا والتمايز، المناعي العوامل تنظيم النظام، وإصلاح الحمض النووي من المرشحين للخضوع لرفض الأنسجة المستهدفة النفس (الشكل 3). على سبيل المثال، تظهر الدجاج kDNA طفرة مع تمزق في الجين dystrophin (الشكل 5)، والترميز وهو البروتين الذي يربط الهيكل الخلوي لغشاء الخلية، هو مرشح لتطوير التهابات عضلة القلب المناعة الذاتية والفشل.
لا ينظر إلى هذه التعديلات الجينية في الكتاكيت فقس البيض رطل من المصابين. هناك اختلافات بين T. الكروزية ورطل kDNA minicircles، وت. الكروزية ك DNA minicircle متوسط 1.4 كيلوبايت هيكل مع أربعة منطقة متغير (VR) تتخللها مناطق المحمية (CR) تقديم كل CSB1، CSB2، والمناطق CSB3، في كاليفورنيا التي تعتبر غنية الحمض النووي عازمة مواقع محددة لبدء النسخ المتماثل، النسخ، إعادة التركيب، وبالنسبة لنقل الحمض النووي الأفقي
| كتاب تمهيدي | الهدف الحمض النووي | تسلسل | TM * |
| S 34 | ت. الكروزية kDNA | 5 'ACA CCA ACC CCA ATC غا CC 3' | 57.9 |
| S 67 | ت.الكروزية kDNA | 5 'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' | 60.1 |
| S 35 | ت. الكروزية kDNA | 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' | 59.4 |
| S 36 | ت. الكروزية kDNA | 5 'GGT ATT TCG GGG GTT GGT جي 3 " | 57،9 |
| Lb3 | رطل kDNA | 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG البوابة الخضراء G 3' | 55.9 |
| Lb5 | رطل kDNA | 5 'CTA ATT GTG GAG GGG كاك جي 3 " | 61.4 |
| زز 1 | جالوس جالوس | 5 'AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3' | 60.1 |
| Gg2 | جالوس G. | 5 'CTG AGC لجنة مكافحة الإرهاب TGCTTT غا A 3 ' | 56.8 |
| Gg3 | جالوس G. | 5 'TTT الجهاز المركزي للمحاسبات AGC AGA GGC TCG جي 3 " | 60.1 |
| Gg4 | جالوس G. | 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' | 64.2 |
| Gg5 | جالوس G. | 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' | 62.3 |
| Gg6 | جالوس G. | 3 'CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA A 5' | 60.4 |
الجدول رقم 1. الأعداد الأولية المستخدمة في تضخيم ال PCR. * تيم = متوسط درجة الحرارة الصلب درجة مئوية.
الشكل 1. يستخدم الذيل PCR TP استراتيجية للكشف عن المثقبية التكامل kDNA الكروزية إلى جينوم جالوس جالوس. أ) تسلسل خيالية مع جزء من kDNA minicircle المحمية (الأزرق الداكن) والمتغير (الضوء الأزرق) مناطق متكاملة في موضع NW_001471687.1 على كروموسوم 4 (AY237306) للجينوم 10 دجاجة (الخضراء) كانت تستخدم للحصول على المضيف مجموعات التمهيدي محددة (Gg1 إلى Gg6). B) وشرع في الذيل-PCR التكبير TP (المرحلة الابتدائية) من قبل الصلب في الاشعال S34 أو S67 minicircle معينة في تركيبة مع الاشعال Gg1 إلى Gg6 الدجاج محددة. في توفير منتجات المخفف قالب للدورة الثانوية مع S35 (إحساس / العقاقير) الاشعال ومجموعات من الاشعال جيغاغرام. في الدورة الثالثة تعرضت 1 التخفيف من المنتجات الثانوية لتضخيم مع kDNA S36 أو S67 الاشعال العقاقير في تركيبة مع التمهيدي جيغاغرامق. ج) تم فصل هذه المنتجات التضخيم في 1٪ الاغاروز المواد الهلامية ونقل إلى غشاء نايلون، تهجين مع التحقيق kDNA محددة. واستخدمت عينات تظهر إشارة إيجابية للاستنساخ لتحديد نقطة من التكامل. وسيتم عرض مجموعات من kDNA واستهدفت Gg1 إلى Gg6 على أعلى من هلام. في ردود الفعل المتسلسل PCR تضخيم تسلسل الحمض النووي الهدف kDNA المضيف مع minicircles kDNA (الأزرق)، وتسلسل الطيور (الخضراء). (نقلا عن أمراض المناطق المدارية المهملة بلوس 3).
الشكل 2. المظاهر السريرية من وظيفة القلب ضعف في دجاجة في 9 أشهر من العمر المعدلة وراثيا من خلال تكامل وkDNA الميتوكوندريا minicircle من T. الكروزية. والأوكسجين في الدم الفقراء من الدجاج kDNA الميتوكوندريا تحور تظهر التناقضات مشط الأرجواني مع تمشيط أحمر مشرق للتحكم في 9 أشهر من العمر الدجاجن خال من الضرر في القلب. (معدلة من أمراض المناطق المدارية المهملة بلوس 3).
الشكل 3. الإجمالي المجهرية وعلم الأمراض في جالوس جالوس مع الطفرات kDNA. أ) توسيع شاذ في القلب في دجاجة في 9 أشهر من العمر الذي توفي نتيجة ازمة قلبية. ب) تحكم من قلب دجاجة في 9 أشهر من العمر غير مصاب. سي) رفض من خلايا القلب المستهدفة من قبل الخلايا اللمفية السامة للخلايا: وصفت وحدة الرفض مع الحد الأدنى من lyses من الخلايا المستهدفة من قبل الخلايا الليمفاوية المناعية (دائرة). د) مراقبة قلب الأنسجة (معدلة من أمراض المناطق المدارية المهملة بلوس 3).
الشكل 4. تحليلات Immunocytochemical من خلايا الجهاز المناعي التسلل الى قلب kDNA-تحور الدجاج هو مبين في الشكل (3). أ) CD45 + الخلايا اللمفاوية التي تم تحديدها (الأسهم) في قلب جنيهاالنبعاثات من قبل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة فيكوإيريترين المسمى محددة. B) CD8 + الخلايا الليمفاوية γδ المناعي (الأسهم) تشارك في تدمير شديد في القلب. C) وفرة CD8α + الخلايا التائية الموجودة في الآفات شديدة مع lyses خلية القلب. يدرج تبين عدم وجود خلايا جهاز المناعة في الدجاج قلب سيطرة غير مصاب (معدلة من أمراض المناطق المدارية المهملة بلوس 3).
الشكل 5. شاغاس، مثل التهاب عضلة القلب عضلة في ذرية F2 مع التكامل kDNA في الجينات dystrophin. أ) قلب المتوسعة في الدجاج 10 شهرا التي تحتل معظم تجويف الصدر (وزن القلب = 16 ز). B) جولة وحيدات النوى الظلام تتسرب الخلايا ويدمر عضلة القلب من الدجاجة kDNA-تحور. ج) حجم القلب العادي (وزن 7 غ) من الدجاج التحكم 10 شهرا. D) الأنسجة عادي لمراقبة قلب الدجاج. (معدلة من بلوس مدار المهملةآل الأمراض 3).
الشكل 6. علم الأمراض المقارن في kDNA-تحور الدجاج ومرض شاغاس في الإنسان. أ) التهاب عضلة القلب الحاد وlyses الهدف خلية القلب في الدجاج kDNA-تحور. ب) التهاب عضلة القلب الحاد وlyses الخلية المستهدفة من قبل الخلايا الليمفاوية المناعية في حالة الإصابة بأمراض القلب شاغاس. سي) رفض من خلايا القلب من قبل الخلايا الليمفاوية المناعية في الدجاج kDNA-تحور. د) رفض من خلايا القلب من قبل الخلايا الليمفاوية المناعية في مرض شاغاس الإنسان. ملطخة بواسطة Hematoxilin ويوزين. (معدلة من Memórias قيام معهد اوزفالدو كروز، ريو دي جانيرو 14).
Discussion
وعلى النقيض من الثدييات عرضة لمدى الحياة ت. التهابات الكروزية، دجاجة وهي لصهر إلى T. الكروزية عدوى. والميزة الرئيسية لنظام الدجاج النموذج هو القضاء على هذا المرض في وقت مبكر في تطوير الجهاز المناعي الجنينية. وبالتالي، تم دمج الحمض النووي طفيلي الوحيدة المتبقية داخل الجسم الدجاج في مواضع عدة.
استخدم كمية الأمثل للT. ضراوة الكروزية trypomastigotes لتطعيم البيضة الخصبة هو خطوة حاسمة نحو الحصول على التكامل بين minicircles kDNA في الدجاج جينوم الجنين. معدل فقس بيض الدجاج الحي من تلقيح مع 100 trypomastigotes هو أربعة أضعاف أعلى من تلك التي تم الحصول عليها مع 500 الطفيليات. ينبغي الحرص على تطعيم تعليق طفيليات في 10 ميكرولتر من مستنبت داخل البويضة غرفة الهواء. وينبغي أن يكون هناك أي تسرب من بياض البيض. في الظروف المثالية، وإصابة الخلايا الطفيلية يأخذ واي مكانرقيق بعد بضع ساعات من الضرب وحضانة طفيلي داخل الخلايا المضيفة العائدات لمدة أسبوع، بعد ذلك يتم التخلص من العدوى من المناعة الفطرية. التكامل kDNA يتطلب عدوى المعيشة، وتلقيح minicircles عارية في وقت مبكر بيض الدجاج الجنين لا يؤدي إلى التكامل. وينبغي أن يضم الأجنة kDNA إيجابية والضوابط تحت ظروف خاضعة للرقابة على 37،5 درجة مئوية والرطوبة 65٪. يتم الاحتفاظ في أقفاص الدجاج لمدة أسبوعين عند 33 درجة مئوية درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك يتم الاحتفاظ بها في أقفاص الدجاج على رفوف معلقة فصل بمقدار 1.5 متر في عرض الممرات غرفة في 22 درجة مئوية مع الهواء التي تمت تصفيتها وتحت ضغط إيجابي استنفاد مستمر لتأمين ظروف رعاية الحيوان. ويتم تغذية الكبار الدجاج طعام والشراب شرب المياه الجارية لتحقيق النمو والنضج الكامل، وضع البيض في خمسة أشهر من العمر. صيانة الإجراءات الصحية ضرورية لاستنساخ نتائج عند العمل مع ت. الكروزية تلقيحفي بيض الدجاج الخصبة.
في الدجاج نظام النموذج T. يتم القضاء على العدوى الكروزية بعد تطوير نظام المناعة في الفترة المبكرة من نمو الجنين. وبالإضافة إلى ذلك إلى كونها خالية من العدوى، والدجاج الذي يفقس من T. الكروزية تلقيح البيض، في عدم وجود أجسام مضادة محددة، ومتسامحون للمستضدات الطفيلي. ويعتبر رفض خلايا القلب الهدف بواسطة الخلايا اللمفية السامة للخلايا (الحد الأدنى من وحدة الرفض، الشكل 3) في دجاجة kDNA-تحور تظهر التعديلات التركيب الوراثي وانهيار المراقبة المناعية 3. وتعديل genotypically الخلايا التائية رفض تقديم المتسارع للأنسجة النفس في الجسم. الموقع آفة الرئيسي هو القلب، والذي هو السمة المميزة لمرض شاغاس. ويعتبر الممر من الفسيولوجية (المراقبة) لدولة فيزيوباثي في الدجاج kDNA-تحور تظهر clonally انتشار الخلايا اللمفية السامة للخلايا 3.
تينظام له نموذج transkingdom يظهر الطفيلي التي يسببها، وراثيا يحركها أمراض المناعة الذاتية (الشكل 6)، الناجمة عن التعديلات الوراثية التي ت. الكروزية kDNA minicircle التكامل. لا ينظر إلى هذه التعديلات في الكتاكيت فقس البيض من رطل تلقيح.
هذه الظاهرة تشير إلى أن علاجا تجريبيا من اعتلال عضلة القلب والتهابات المناعة الذاتية في kDNA-تحور الدجاج قد تتطلب قمع المخدرات من السلف نخاع العظم من النمط الظاهري تي خلية محددة التسلل الى عضلة القلب، وزرع نخاع العظم متوافق نسيجيا صحي لمنع رفض الأنسجة الذاتي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن مدينون لنانسي ر. شتورم، قسم علم المناعة، علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية، وديفيد جيفن في كلية الطب، جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس، لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد المجلس الوطني للبحوث، CNPq، ومؤسسة البحوث للتنمية، FAPDF، والبرازيل، والدراسة. نشكر المساعدات الفنية من اليساندرو O. سوزا، ماريا Guimaro جيم، كورديرو سيرو، آنا دي روزا كاسيا، ألفيس Roseneide، واندرادي رافائيل، من جامعة برازيليا، البرازيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase Recombinant | Invitrogen | 11615-010 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-030 | |
| Random Primers DNA Labeling System | Invitrogen | 18187-013 | |
| EcoRI | Invitrogen | 15202-021 | |
| MboI | Invitrogen | 15248-016 | |
| dNTP Set, 100mM Solutions | GE Healthcare | 28-4065-51 | |
| Amersham Hybond - N+ -- Cat n. | GE Healthcare | RPN303B | |
| PlasmidPrep Mini Spin kit | GE Healthcare | 28-9042-70 | |
| NsiI | Sigma-Aldrich | R5884 1KU | |
| DNA, Sodium Salt Fish Sperm | AMRESCO | 0644-10G | |
| Mouse anti-chicken Bu-1b | SouthernBiotech | 8370-02 | |
| Mouse anti-chicken CD45 | SouthernBiotech | 8270-08 | |
| Mouse anti-chicken TCRγδ | SouthernBiotech | 8230-08 | |
| Mouse anti-chicken CD8α | SouthernBiotech | 9220-02 | |
| Mouse anti-chicken monocyte/macrophage | SouthernBiotech | 8420-02 | |
| MyCycle Termocycler | Bio-Rad | 580BR 5501 |
References
- Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
- Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
- Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000 (2011).
- Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181 (2010).
- Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
- Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
- Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
- Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
- Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
- Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
- Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571 (2011).
- Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
- Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
- Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
- Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
- Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
- Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).
