Påvisning av Invasiv pulmonal aspergillose i hematologisk malignitet pasienter ved hjelp av Lateral-Strømningsteknikk

Summary

En rask og nøyaktig point-of-care test for invasiv pulmonal aspergillose presenteres. Det tar fordel av lateral-flow teknologi i et spesifikt monoklonalt antistoff som binder seg til en

Abstract

Invasiv pulmonal aspergillose (IPA) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet i hematologisk malignitet pasienter og stamcelletransplantasjon resipienter ^1. Påvisning av IPA representerer en formidabel diagnostisk utfordring og, i mangel av en "gullstandard", avhengig av en kombinasjon av kliniske data og mikrobiologi og histopatologi hvor gjennomførbart. Diagnose av IPA må følge den europeiske organisasjonen for forskning og behandling av kreft og National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer mykologi Study Group (EORTC / MSG) konsensus definere "bevist", "sannsynlig" og "mulig" invasive soppsykdommer ² . Foreløpig har ingen nukleinsyre-baserte tester blitt eksternt validert for IPA deteksjon og så polymerase kjedereaksjon (PCR) er ikke inkludert i dagens EORTC / MSG diagnostiske kriterier.

Identifisering av Aspergillus i histologiske deler er problematisk på grunn av Similarities i hyphal morfologi med andre invasive sopp ³ og velprøvd identifisering krever isolering av etiologic agent i ren kultur. Kultur-baserte tilnærminger stole på tilgjengeligheten av biopsiprøver, men disse er ikke alltid tilgjengelig i syke pasienter, og ikke alltid gir levedyktige propagules for kultur når innhentet.

Et viktig trekk i patogenesen av Aspergillus er angio-invasjon, en egenskap som gir muligheter til å spore soppen immunologisk bruke tester som gjenkjenner karakteristiske antigene signaturer molekyler i serum og bronchoalveolar lavage (BAL) væsker. Dette har ført til utviklingen av Platelia enzymet immunoassay (GM-EIA) som oppdager Aspergillus galactomannan og en "pan-sopp" analysen (Fungitell test) som oppdager konservert soppens cellevegg komponent (1 → 3)-β-D- glukan, men ikke i mucorales som mangler denne komponenten i sin celle vegger ^1,4. Ersaksøker rundt nøyaktigheten av disse testene ^1,4-6 har ført til den siste utviklingen av neste generasjons monoklonalt antistoff (MAB)-baserte analyser som gjenkjenner surrogat infeksjonsmarkører ^1,5.

Thornton ⁵ nylig beskrev generering av en Aspergillus-spesifikk MAB (JF5) med hybridoma teknologi og bruken for å utvikle en immuno-kromatografisk lateral-flow enhet (LFD) for point-of-care (POC) diagnose av IPA. En stor fordel av LFD er dens evne til å oppdage aktivitet siden MAB JF5 binder seg til en ekstracellulær glycoprotein antigen som utskilles under aktiv vekst av sopp bare ^fem. Dette er et viktig hensyn ved bruk av væsker som lunge BAL for diagnostisering IPA siden Aspergillus sporer er en vanlig komponent i innåndingsluften. Nytten av enheten i diagnostisering IPA har blitt demonstrert ved hjelp av en dyremodell for infeksjon, hvor LFD vises forbedret sensitivitet og specificity forhold til Platelia GM og Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan analyser ^7.

Her presenterer vi en enkel LFD prosedyre for å oppdage Aspergillus antigen i humant serum og BAL væsker. Dens hastighet og nøyaktighet gir en roman supplement point-of-care test for diagnostisering av IPA i hematologisk malignitet pasienter.

Protocol

1. Innsamling, lagring og klargjøring av serum og Bronchoalveolar lavage Fluids

1. Samle serum fra ubehandlede blodprøver ved at blodet å koagulere ved 4 ° C, og lagre serum som alikvoter ved -20 ° C før bruk. Bronchoalveolar lavage væsker (BAL) bør også lagres som alikvoter ved -20 ° C. Merk: Lagring av serum og BAL som alikvoter begrenser potensialet for nedbrytning av målet antigen ved gjentatt frysing-tining av prøvene under gjentatt testing.
2. Thaw prøver og blande serum og BAL prøver grundig av virvling og sentrifuger i 1 min ved 14 000 rpm.
3. For rutinemessig testing av humane serumprøver, fortynne serum 1:1 (v / v) med vevskultur medium (TCM). TCM består av RPMI-1640 medium, 10% (v / v) kalvefoster serum, 1% (v / v) av 200mm L-glutamin løsning, og natriumazid (0,02% w / v) som konserveringsmiddel. Mediet er forberedt på forhånd og kan oppbevares ved 4 ° C i flere måneder. Påfør 100 mL av diluted serum til LFD.
4. For menneskelige BAL væsker, og for BAL væsker fra dyremodeller, gjelder 100 mL av pen prøven til LFD, uten forbehandling.
5. For serum fra dyremodeller, fortynne serum 01:02 (v / v) med fosfat saltløsning som inneholder 4% (w / v) EDTA, varmen 3min i en kokende vannbad, sentrifuger i 5 min ved 14.000 rpm, og gjelder 100 mL av pen supernatant til LFD enheten.

2. Anvendelse av Serum og BAL til Lateral-flow enhet

1. Oppbevar lateral-flow-enheter ved romtemperatur (23 ° C). Ved denne temperaturen enheter er stabile i 12 måneder. Fjern enhetene fra sine poser og legg dem på et plant underlag.
2. Ved hjelp av en steril pipette tips, påfør 100 mL av pre-behandlet serum eller pen BAL prøven til utgivelsen porten på enheten.
3. La analysen til å kjøre i 15 min ved romtemperatur, da resultatene av testene bør registreres. Merk: I løpet av sekunder vil væsken være seno for å migrere av kapillærkraft langs nitrocellulose membran i observasjon vinduet.

3. Opptak og Tolke LFD Resultater

1. Den LFD består av en intern kontroll linje (angitt med bokstaven C på plasthus) og en test linje (angitt med bokstaven T). Kontrollen linjen skal alltid vises uavhengig av Aspergillus antigen i serum eller BAL prøve. Dette viser at analysen har kjørt riktig.
2. Hvis Aspergillus antigen er til stede i serum eller BAL prøve, vil testen linjen også vises i 15min fra prøven søknad. Fordi intensiteten av testen linjen er proporsjonal med mengden av Aspergillus antigen til stede i prøven, kan testen linjen ser ut som en svak positiv (+), en moderat positiv (+ +) eller som en sterk positiv (+ + +) . Men noen positiv test linje, uavhengig av intensitet, ville indikere tilstedeværelse av Aspergillus antigen i prøven. I the fravær av Aspergillus antigen, vil ingen test strek på skjermen, og resultatet føres som negativ (-).

4. Representative Resultater

Representative eksempler på negative, svake positive, moderat positive, og sterke positive LFD resultater med BAL og serum prøver er vist i figur 1.

Resultater av antigen-positive LFD tester (svake og sterke) eller negative LFD tester bruker BAL væske fra akutt myelogen leukemi (AML) pasienter diagnostisert i henhold til EORTC / MSG diagnostiske kriterier er vist i tabell 1. Inkludert i denne tabellen er de tilsvarende kliniske og mykologisk (galactomannan og kultur) data, og resultatene av en Aspergillus-spesifikk PCR test utviklet ved St. Bartholomews Hospital ^8, for hver pasient. Diagnostisering av sykdom var basert på vertsfaktorer (nøytropeni, langvarig bruk av kortikosteroider, behandling med andre anerkjente T-celle immunosuppressants), kliniske kriterier og GM positivitet for BAL (her definert som en GM indeks> 0,8). Under 2002 EORTC / MSG retningslinjer ^10, pasienter 12, 13 og 16 ble diagnostisert med "mulig" IA på grunnlag av verten faktorer og kliniske kriterier eller GM positivitet. Ifølge de reviderte (2008) EORTC / MSG retningslinjer ^2, vert faktorer og GM positivitet alene eller vert faktorer og kliniske kriterier alene ville ikke indikere "mulig" invasive sopp infeksjon med mindre ledsaget av bevis fra kliniske data og mykologi henholdsvis. Pasient 6 fikk diagnosen «sannsynlig» IA under begge 2002 og 2008 retningslinjer på grunn av vert faktorer, store og små kliniske funksjoner og GM positivitet. Merk at mens verken LFD eller PCR-analysene er for øyeblikket inkludert i EORTC / MSG retningslinjer, er det sterk enighet mellom de to analysene og den kommersielle galactomannan test indikerer tilstedeværelse av Aspergillus antigen og nukleinsyre i BAL prøven s av pasienter 6 og 12. Andre resultater fra studier som viser effekten av de LFD og PCR-analyser i diagnostisering IPA kan bli funnet i Johnson et al ^åtte.

Figur 1. Negative (kontroll linje bare) og positive (kontroll og test linje) resultatene av LFD tester ved hjelp serum og BAL. De intensiteter av testlinjen reaksjoner er proporsjonal med konsentrasjonen av målet antigen i serum og BAL prøver. Reaksjoner vanligvis strekker seg fra svake (+) gjennom moderat (+ +) til sterk (+ + +). Uavhengig av testen linje intensitet, ville alle tre serum positive reaksjoner tyder på invasiv pulmonal aspergillose sykdom på grunn av tilstedeværelsen av sirkulerende Aspergillus antigen i blodet. Positive BAL reaksjoner (svak, moderat eller sterk) skulle tilsi spiring av sporer og utvikling av potensielt sykdomsfremkallende hyfer i lungene.

pdflinebreak ">

Pasient nei.	Patient informasjon	Kliniske kriterier 1	BAL kultur 2	GM EIA indeks 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR resultat	LFD resultat
6	-	Store CT tegn (nodule og glorie) og ett mindre	Negativ	0,9 (positiv)	Sannsynlig	Sannsynlig	Positiv	Svakt positiv (+)
12	Antatt tidligere soppinfeksjon	Ingen store, ett mindre	Candida glabrata	6,43 (sterk positiv)	Mulig	Ingen	Positiv	Sterk positiv (+ + +)
13	Koagulase-negative Staphylococcus og E. coli i blodet	Ingen store, to mindre	Negativ	0,25 (negativ)	Mulig	Ingen	Negativ	Negativ (-)
16	Luftveisinfeksjon	3 mindre kriterier, inkludert ny infiltrere pluss flertall effusjon	Negativ	0,16 (negativ)	Mulig	Ingen	Negativ	Negativ (-)

¹ knuter eller glorier på en CT scan tyder på soppinfeksjon
² Candida glabrata i BAL væske ville bli ansett som en forurensning som det er den nest vanligste gjær isolert som en del av normale menneskelige flora ^9
3 En indeks over> 0,8 i GM EIA test av BAL er en indikasjon på Aspergillus-infeksjon
⁴ Basert på 2002 EORTC / MSG diagnostiske kriterier for 'possible ',' sannsynlig 'eller' bevist 'invasive sopp sykdom ^10
5 Basert på de reviderte (2008) EORTC / MSG diagnostiske kriterier for "mulig", "sannsynlig" eller "bevist" invasive sopp sykdom ²

Tabell 1. Resultater fra LFD tester av Bal prøver fra akutt myelogen leukemi pasienter med sannsynlig IPA og fra kontroll AML pasienter (ingen tegn til infeksjon) og EORTC / MSG diagnose av infeksjon.

Discussion

Definitive identifikasjon av IPA kan bare virkelig oppnås ved isolasjon av etiologic agent fra biopsiprøver, men gjenvinning av egnede prøver er ofte ikke mulig i svært syke pasienter og Aspergillus er sjelden inndrives fra blod. Mens store fremskritt har blitt gjort i bruken av computertomografi skanning av brystet i IPA diagnose, egenskaper som er forenlig med pulmonal IPA som "Halo" eller "air-halvmåne" skiltene er enten forbigående eller kan tilskrives puste artefakter eller andre soppinfeksjoner ^11,12. Slike data er derfor supplert med serologiske teknikker som tar sikte på å identifisere signatur molekyler (GM og β-glukan) fra sopp som sirkulerer i pasientens serum eller som er til stede i BAL væsker, sputum eller urinprøver ^13. Selv om disse testene vise tilfredsstillende sensitivitet, de mangler tilstrekkelig spesifisitet eller lider av innblanding under visse forutsetninger ^1,6

Den LFD test for IPA påvisning presenteres her gjør at "point-of-care" diagnose av IPA og utnytter teknologi som har blitt brukt hittil i tester for påvisning av virus, bakterier, parasitter og giftstoffer ^14-19, og mest kjent, for hjemmelaget graviditetstester først introdusert av Unipath i 1988. I Aspergillus LFD beskrevet her, er Aspergillus-spesifikke MAB JF5 immobilisert til en fangst sone (testen linje) på en porøs nitrocellulose membran. Anti-mus immunoglobulin immobilisert til membranen i en egen sone fungert som en intern kontroll (kontroll linje). På tilsatt serum eller BAL væske til utgivelsen port, binder MAB JF5-kolloidalt gull konjugat i utgivelsen puten til målet antigen og komplekset deretter passerer langs den porøse membranen ved kapillærkraft. MAB JF5 immobilisert i capture sone bindes til JF5-kolloidalt gull-antigen komplekset som resulterer i en rød test linje. Enhver ubundet JF5-kolloidalt gullkonjugat binder seg til den interne kontrollen viser at analysen har kjørt riktig. Dette resulterer i en rød kontroll linje.

Testen er rask, tar bare 15 minutter å utføre, er billig i forhold til serum og BAL tester basert på GM og β-glukan deteksjon, og krever ikke dyrt utstyr eller store laboratorier for å kjøre. Videre er MAB JF5 ikke kryssreagerer med narkotika eller forurensninger som har vist seg å forårsake falskt positiv reaksjon i GM og β-glukan tester ^1,4,6. En ekstra stor fordel fremfor dagens diagnostiske tester er LFDs evnen til å oppdage aktivitet som er et tegn på invasiv vekst av Aspergillus arter.

Et kritisk punkt i LFD prosedyren er behovet for å lese resultatene 15 minutter etter påføring av serum eller BAL prøven til enheten. Testen bør ikke stå lenger enn 15 min før du spiller inn resultatene, da dette kan skjevhet resultatet interpretatipå. En svak reaksjon vil ikke bli styrket ved å utvide inkubasjonstid. Varmebehandling av serum fra dyremodeller av infeksjon er funnet å forbedre analysen følsomhet. En begrensning av testen er at det er kvalitativ, og er avhengig av operatøren til å foreta en subjektiv vurdering av positivitet. Intensiteten av testen linjen varierer i henhold til antigen innholdet i serum og BAL prøver (Figur 1). Imidlertid indikerer noen positiv reaksjon (bestemt ved sammenligning til kjente negativer) tilstedeværelse av Aspergillus antigen og derfor infeksjon. For å begrense subjektivitet LFD analyser, håndholdte enheter er tilgjengelig tillate som kvantifisering av LFD testlinje intensiteter og muliggjøre etablering av grenseverdier for antigen påvisning ^20.

Fremtidig utvikling av LFD inkludere kommersialisering og utvikling av en multiplex LFD som tillater samtidig påvisning av andre invasive soppbruker svært spesifikke mAbs ^tre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspergillus LFD	University of Exeter		Available from the corresponding author on request
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal calf serum	Biosera	S9100	Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1