Summary
En snabb och korrekt point-of-care test för invasiv pulmonell aspergillos presenteras. Det tar fördel av lateralt flöde teknik med användning av en specifik monoklonal antikropp som binder till en
Abstract
Invasiv pulmonell aspergillos (IPA) är en ledande orsak till morbiditet och mortalitet hos hematologiska maligniteter patienter och hematopoetiska stamceller transplanterade 1. Detektering av IPA är en formidabel diagnostisk utmaning, och i avsaknad av en "gold standard", bygger på en kombination av kliniska data och mikrobiologi och histopatologi där så är möjligt. Diagnos av IPA måste överensstämma med den europeiska organisationen för forskning och behandling av cancer och det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar mykologi Study Group (EORTC / MSG) konsensus definiera "bevisade", "troligt" och "möjlig" invasiva svampsjukdomar 2 . För närvarande har ingen nukleinsyra-baserade tester har externt validerats för IPA upptäckt och så polymeras kedjereaktion (PCR) ingår inte i nuvarande EORTC / MSG diagnostiska kriterier.
Identifiering av Aspergillus i histologiska snitt är problematisk på grund av Simiheter i hyfernas morfologier med andra invasiva svamppatogener 3 och beprövad identifiering kräver isolering av etiologiska agens i ren kultur. Kultur-baserade metoder beroende av tillgången på biopsiprover, men dessa är inte alltid tillgängliga i sjuka patienter och inte alltid ger hållbara spridningsenheter för kultur när det erhållits.
Ett viktigt inslag i patogenesen av Aspergillus är angio-invasion, ett drag som ger möjligheter att spåra svampen immunologiskt med hjälp av tester som upptäcker karakteristiska antigena signaturer molekyler i serum och bronkoalveolär lavage (BAL) vätska. Detta har lett till utvecklingen av Platelia enzymimmunoanalys (GM-EIA) som detekterar Aspergillus galaktomannan och en "pan-svamp"-analys (Fungitell test) som detekterar den konserverade fungös komponenten cellvägg (1 → 3)-β-D- glukan, men inte i Mucorales som saknar denna komponent i deras cellväggar 1,4. Ärstämmer omgivande noggrannheten av dessa tester 1,4-6 har lett till den senaste utvecklingen av nästa generations monoklonala antikropp (MAb)-baserade analyser som detekterar surrogatmarkörer för infektion 1,5.
Thornton 5 beskrev nyligen generering av en Aspergillus-specifik MAb (JF5) med användning av hybridomteknologi och dess användning för att utveckla en immuno-kromatografisk lateralt flöde anordning (LFD) för punkt-of-care (POC) diagnos av IPA. En stor fördel med LFD är dess förmåga att detektera aktivitet eftersom MAb JF5 binder till en extracellulär glykoproteinantigen som utsöndras under aktiv tillväxt av svampen endast 5. Detta är en viktig faktor när man använder vätskor som lung BAL för att diagnostisera IPA eftersom Aspergillus sporer är en vanlig komponent i inandningsluften. Användbarheten av anordningen för att diagnostisera IPA har visats med användning av en djurmodell för infektion, där den LFD visas förbättrad känslighet och specificity jämfört med Platelia GM och Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan-analyser 7.
Här presenterar vi en enkel LFD förfarande för att upptäcka Aspergillus-antigen i humana serum och BAL vätskor. Dess snabbhet och noggrannhet ger en ny adjungerad point-of-care test för diagnos av IPA i hematologiska maligniteter patienter.
Protocol
1. Insamling, lagring och beredning av serum-och lungsköljning vätskor
- Samla serum från obehandlade blodprov genom att låta blodet koagulera vid 4 ° C, och lagra serum som alikvoter vid -20 ° C före användning. Bronkoalveolära tvättceller vätskor (BAL) bör också lagras som alikvoter vid -20 ° C. Anm: Lagring av serum och BAL som alikvoter begränsar potentialen för nedbrytning av målantigenet genom upprepad frysning-tining av prover under upprepad testning.
- Tina prover och blanda serum och BAL prover noggrant genom att vortexa och centrifugera i 1 minut vid 14.000 rpm.
- För rutintestning av humana serumprover, utspädda serumet 1:1 (volym / volym) med vävnadsodlingsmedium (TCM). TCM består av RPMI-1640-medium, 10% (volym / volym) fetalt kalvserum, 1% (volym / volym) av 200 mM L-glutamin-lösning, och natrium-azid (0,02% vikt / volym) som konserveringsmedel. Mediet bereds i förväg och kan lagras vid 4 ° C under flera månader. Tillsätt 100 | il av diluted serum till LFD.
- För humana BAL vätskor och för BAL vätskor från djurmodeller, gäller 100 ^ ren prov till LFD, utan förbehandling.
- För serum från djurmodeller, utspädd serum 1:2 (volym / volym) med fosfatbuffrad saltlösning innehållande 4% (vikt / volym) EDTA, värme för 3min i ett kokande vattenbad, centrifug under 5 min vid 14.000 varv per minut, och applicera 100 il ren supernatant till LFD enheten.
2. Applicering av serum och BAL till lateralt flöde Anordning
- Lagra de lateralt flöde anordningar vid rumstemperatur (23 ° C). Vid denna temperatur anordningar är stabil i 12 månader. Ta bort enheter från sina påsar och placera på en plan yta.
- Användning av en steril pipettspets, applicera 100 ^ il av förbehandlat serum eller outspädd BAL-provet till frisättning öppningen i anordningen.
- Tillåta analys för att löpa i 15 min vid rumstemperatur, vid vilken tidpunkt resultaten av de tester dokumenteras. Obs: Inom sekunder vätskan kommer seen att migrera genom kapillärkraft längs nitrocellulosamembranet i observationsfönstret.
3. Inspelning och tolkning LFD resultat
- Den LFD består av en intern kontroll linje (indikeras av bokstaven C på plasthöljet) och ett test linje (anges med bokstaven T). Kontrollen skall alltid synas oavsett Aspergillus-antigen i serum eller BAL prov. Detta visar att analysen har att fungera korrekt.
- Om Aspergillus-antigen finns i serum eller BAL prov, kommer testet linjen verkar också inom 15min prov ansökan. Eftersom intensiteten av testet linjen är proportionell mot mängden av Aspergillus-antigen närvarande i provet, kan testet raden visas som en svagt positiv (+), en moderat positiv (+ +) eller som en stark positiv (+ + +) . Men något positivt test linje, oavsett intensitet, skulle indikera förekomsten av Aspergillus-antigen i provet. I: tee avsaknad av Aspergillus-antigen, kommer ingen test linje visas och resultatet redovisas som negativt (-).
4. Representativa resultat
Representativa exempel på negativa, svagt positiva, måttligt positiva och starkt positivt LFD resultat med BAL och serum prov visas i figur 1.
Resultat av antigen-positiva LFD test (svaga och starka) eller negativa LFD tester med BAL vätska från akut myeloisk leukemi (AML) patienter diagnostiserad enligt EORTC / MSG diagnostiska kriterier visas i tabell 1. Ingår i denna tabell är motsvarande kliniska och mykologiska (galaktomannan och kultur) uppgifter, och resultatet av en Aspergillus-specifik PCR-test utvecklades vid S: t Bartholomews sjukhus 8, för varje patient. Diagnos av sjukdomar baserades på värdens faktorer (neutropeni, långvarig användning av kortikosteroider, behandling med andra erkända T-cell immunosuppressants), kliniska kriterier och GM positivitet för BAL (här definierad som en genetiskt modifierad indexvärde> 0,8). Enligt 2002 EORTC / MSG riktlinjer 10, 12 patienter, 13 och 16 hade diagnosen "möjligt" IA på grundval av värd faktorer och kliniska kriterier eller GM positivitet. Enligt de reviderade (2008) EORTC / MSG riktlinjer 2, faktorer värd och GM positivitet enbart eller värd faktorer och kliniska kriterier enbart skulle inte ange "möjligt" invasiv svampinfektion om det inte åtföljs av styrkande handlingar från kliniska data och mykologi resp. Patient 6 fick diagnosen "trolig" IA under både 2002 och 2008 riktlinjer på grund av värd faktorer, stora och små kliniska fynd och GM positivitet. Observera att medan varken LFD eller PCR-analyser för närvarande ingår i EORTC / MSG riktlinjer finns det en stark överenskommelse mellan de två analyserna och det kommersiella galaktomannan testa indikerar närvaro av Aspergillus-antigen och nukleinsyra i BAL-provet s patienter 6 och 12. Ytterligare resultat från studier som visar effekten av de LFD och PCR-analyser i diagnostisering IPA återfinns i Johnson et al 8.
Figur 1. Negativ (kontroll ledningar) och positiv (kontroll och test linje) Resultaten av LFD försök med serum och BAL. Intensiteterna hos de reaktioner testlinje är proportionell till koncentrationen av mål-antigen i serum och BAL-prover. Reaktioner ligger typiskt i intervallet från svag (+) genom måttlig (+ +) till stark (+ + +). Oavsett test linje intensitet, skulle alla tre serum positiva reaktioner visar invasiv pulmonell aspergillos sjukdom på grund av närvaron av cirkulerande Aspergillus-antigen i blodet. Positiva BAL reaktioner (svag, måttlig eller stark) skulle indikera groning av sporer och utveckling av potentiellt patogena hyfer i lungorna.
| Patient nr. | Patient informationen | Kliniska kriterier 1 | BAL kultur 2 | GM MKB index 3 | EORTC / MSG (2002) 4 | EORTC / MSG (2008) 5 | Aspergillus PCR-resultat | LFD resultat |
| 6 | - | Stora CT tecken (knöl och halo) och en mindre | Negativ | 0,9 (positiv) | Trolig | Trolig | Positiv | Svagt positiv (+) |
| 12 | Förmodas tidigare svampinfektion | Inga större, en mindre | Candida glabrata | 6,43 (starkt positiv) | Möjligt | Ingen | Positiv | Starka positiva (+ + +) |
| 13 | Koagulasnegativa Staphylococcus och E. coli i blod | Inga större, två mindre | Negativ | 0,25 (negativ) | Möjligt | Ingen | Negativ | Negativ (-) |
| 16 | Bröstinfektion | 3 Mindre kriterier, bland annat nya infiltrera plus plural utgjutning | Negativ | 0,16 (negativ) | Möjligt | Ingen | Negativ | Negativ (-) |
1 knölar eller glorior på en datortomografi tyder på svampinfektion
2 Candida glabrata i BAL vätska skulle betraktas som en förorening eftersom det är den näst vanligaste jäst isolerade som en del av normala mänskliga flora 9
3 Ett index på> 0,8 i GM EIA-test av BAL är ett tecken på Aspergillus-infektion
4 Baserat på 2002 EORTC / MSG diagnostiska kriterier för "possible "," troligt "eller" bevisad "invasiv svampsjukdom 10
5 Baserat på de reviderade (2008) EORTC / MSG diagnostiska kriterier för "möjligt", "troligt" eller "bevisad" invasiv svampsjukdom 2
Tabell 1. Resultat av LFD tester av BAL prover från akut myeloisk leukemi patienter med trolig IPA och från kontroll AML-patienter (inga tecken på infektion) och EORTC / MSG diagnos av infektion.
Discussion
Slutgiltig identifiering av IPA kan endast verkligen uppnås genom isolering av det etiologiska medlet från biopsiprover, men återhämtning av lämpliga prov är ofta inte möjligt i mycket sjuka patienter och Aspergillus är sällan återvinnas från blodet. Medan stora framsteg har gjorts när det gäller användningen av datortomografi scanning av bröstet i IPA diagnos, egenskaper som tyder på pulmonell IPA såsom "halo" eller "air-Crescent" skyltar är antingen övergående eller kan hänföras till andning artefakter eller andra svampinfektioner 11,12. Sådana uppgifter är därför kompletteras med serologiska tekniker som syftar till att identifiera signatur molekyler (GM β-glukan) från svampar som cirkulerar i patientens serum eller som finns i BAL vätska, sputum eller urinprover 13. Även om dessa tester visar tillfredsställande känslighet, saknar de tillräcklig specificitet eller lider av störningar under vissa förutsättningar 1,6
Den LFD test för IPA upptäckt presenteras här gör det möjligt för "point-of-care" diagnos av IPA och bedrifter teknik som har använts hittills i test för påvisande av virus, bakterier, parasiter och toxiner 14-19 och mest känt, för hem graviditetstest som först infördes genom Unipath 1988. I Aspergillus LFD som beskrivs här, är Aspergillus-specifik MAb JF5 immobiliseras till en infångningszon (testet linje) på ett poröst nitrocellulosamembran. Anti-mus-immunglobulin immobiliserad på membranet i en separat zon tjänade som en intern kontroll (kontroll linje). Vid tillsats av serum eller BAL-vätskan till tömningsporten binder MAb JF5-kolloidalt guldkonjugat i frisättning dynan till målantigenet och komplexet passerar sedan längs det porösa membranet genom kapillärverkan. MAb JF5 immobiliserad i infångningszonen binder till JF5-kolloidalt guld och antigen komplex resulterade i en röd testlinjen. Eventuell obunden JF5-kolloidalt guldkonjugat binder till den interna kontrollen indikerar att analysen har att fungera korrekt. Detta resulterar i en röd styrledning.
Testet är snabb, tar endast 15 minuter att utföra, är billig i jämförelse med serum och BAL tester baserade på GM och β-glukan upptäckt och inte kräver dyr utrustning eller omfattande faciliteter laboratorium för att köra. Dessutom, inte MAb JF5 korsreagerar inte med droger eller föroreningar som har visat sig orsaka falskt positiv reaktion i GM och β-glukan tester 1,4,6. En ytterligare stor fördel jämfört med nuvarande diagnostiska tester är LFDs förmågan att detektera aktivitet som är indikativ för invasiv tillväxt av Aspergillus-arter.
Ett kritiskt steg i LFD förfarandet är behovet av att läsa resultaten 15 minuter efter applicering av serum eller BAL prov till enheten. Testet bör inte lämnas för längre tid än 15 min innan du spelar in resultaten, eftersom detta kan fördomar resultat interpretatividare. En svag reaktion kommer inte att förbättras genom att förlänga inkubationsperioden. Värmebehandling av serum från djurmodeller av infektion har visat sig förbättra analyskänsligheten. En begränsning av testet är att det är kvalitativ och bygger på operatören att göra en subjektiv bedömning av positivitet. Intensiteten hos den testlinjen varierar beroende på de antigen-innehållet i serum och BAL-prover (fig. 1). Emellertid indikerar någon positiv reaktion (bestämdes genom jämförelse med kända negativa) närvaron av Aspergillus-antigen och således infektion. För att begränsa subjektivitet LFD analyser, handhållna enheter är tillgängliga som tillåter kvantifiering av LFD intensiteter testlinje och möjliggöra etablering av tröskelvärden för att påvisa antigen 20.
Framtida utveckling av LFD inkluderar dess kommersialisering och utveckling av en multiplex LFD som tillåter samtidig detektering av andra invasiva svamppatogenermed mycket specifika MAbs 3.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Finansiering Dr Thornton från Pfizer Limited tacksamt erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus LFD | University of Exeter | Available from the corresponding author on request | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal calf serum | Biosera | S9100 | Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM |
| EDTA | Fisher Scientific | BPE120-1 |
References
- Thornton, C. R. Detection of invasive aspergillosis. Adv. Appl. Microbiol. 70, 187-216 (2010).
- De Pauw, B., Walsh, T. J., Donnelly, J. P. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) concensus group. Clin. Infect. Dis. 46, 1813-1821 (2008).
- Thornton, C. R. Tracking the emerging human pathogen Pseudallescheria boydii by using highly specific monoclonal antibodies. Clin. Vacc. Immunol. 16, 756-764 (2009).
- Pickering, J. W. Evaluation of a (1 -> 3)-β-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections. J. Clin. Microbiol. 43, 5957-5962 (2005).
- Thornton, C. R. Development of an immunochromatographic lateral-flow device for rapid serodiagnosis of invasive aspergillosis. Clin. Vacc. Immunol. 15, 1095-1105 (2008).
- Verweij, P. E., Mennink-Kersten, M. A. S. H. Issues with galactomannan testing. Med. Mycol. 44, 179-183 (2006).
- Wiederhold, N. P. Comparison of lateral flow technology and galactomannan and (1 -> 3)-β-D-glucan assays for detection of invasive pulmonary aspergillosis. Clin. Vacc. Immunol. 16, 1844-1846 (2009).
- Johnson, G. L., Bibby, D., Bustin, S. Detection of Aspergillus in broncho-alveolar lavage fluid using two biological assays; evidence of active infection. Mycoses. 54, Suppl 2. 130-131 (2011).
- Malani, A. Candida glabrata fungemia: experience in a tertiary care centre. Clin. Infect. Dis. 41, 975-981 (2005).
- Ascioglu, S. Defining opportunistic invasive fungal infection in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international concensus. Clin. Infect. Dis. 34, 71-74 (2002).
- Denning, D. Early diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet. 355, 423-424 (2000).
- Greene, R., Shibuya, K., Ando, T. Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Latge, J. -P., Steinbach, W. J. , ASM Press. 353-363 (2009).
- Klont, R. R., Mennink-Kersten, M. A. S. H., Verweij, P. E. Utility of Aspergillus antigen detection in specimens other than serum samples. Clin. Infect. Dis. 39, 1467-1474 (2004).
- Iweala, O. I. HIV diagnostic tests: an overview. Contraception. 70, 141-147 (2004).
- Ketema, F., Zeh, C., Edelman, D. C. Assessment of the performance of a rapid, lateral flow assay for the detection of antibodies to HIV. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 27, 63-70 (2001).
- Moody, A. Rapid diagnostic tests for malaria parasites. Clin. Microbiol. Rev. 15, 66-78 (2002).
- Parkash, O. Performance of a lateral flow test for the detection of leprosy patients in India. J. Med. Microbiol. 57, 130-132 (2008).
- Sharma, S. K. Evaluation of lateral-flow Clostridium botulinum neurotoxin detection kits for food analysis. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3935-3941 (2005).
- Smits, H. L. Lateral-flow assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 166-169 (2001).
- Faulstich, K. Lateral Flow Immunoassay. Wong, R., Tse, H. , Humana Press. 157-185 (2009).
