Summary
La produzione endogena di ossido nitrico (NO) regola una varietà di funzioni biologiche. Sta diventando sempre più chiaro che l'alterazione o disregolazione di NO segnalazione based è coinvolta in molte malattie umane. Metodi per quantificare relativo numero metaboliti possono fornire nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici per le malattie umane.
Abstract
L'ossido nitrico (NO) è un biatomica radicale libero che è estremamente breve durata in sistemi biologici (meno di 1 secondo nel sangue circolante) 1. NO può essere considerato uno dei più importanti molecole di segnalazione prodotte nel nostro corpo, regolando le funzioni essenziali, incluso ma non limitato alla regolazione della pressione sanguigna, la risposta immunitaria e la comunicazione neurale. Pertanto, la sua rilevazione accurata e la quantificazione in matrici biologiche è fondamentale per comprendere il ruolo di NO nella salute e nella malattia. Con una breve semivita fisiologica di NO, strategie alternative per il rilevamento di prodotti di reazione di NO biochimica sono stati sviluppati. La quantificazione dei metaboliti NO rilevanti in diversi compartimenti biologici fornisce preziose informazioni per quanto riguarda il NO in vivo, la biodisponibilità di produzione e il metabolismo. Basta assaggiare un unico vano, come sangue o plasma non può sempre fornire una valutazione accurata di tutta body stato NO, in particolare nei tessuti. La possibilità di confrontare il sangue con i tessuti selezionati in animali da esperimento aiuterà a colmare il divario tra scienza di base e la medicina clinica per quanto riguarda utilità diagnostica e prognostica di NO biomarcatori nella salute e nella malattia. Pertanto, estrapolazione di plasma o sangue stato NO a tessuti specifici di interesse non è più un valido approccio. Come risultato, i metodi continuerà ad essere sviluppato e convalidato che permettono l'individuazione e la quantificazione dei prodotti NO e NO-correlati / metaboliti a compartimenti multipli di animali da esperimento in vivo. Il paradigma stabilito di NO biochimica dalla produzione da NO sintasi all'attivazione di guanylyl ciclasi solubile (SGC) all'ossidazione eventuale nitrito (NO 2 -) e nitrati (NO 3 -), può rappresentare solo una parte di NO gli effetti in vivo. L'interazione dei metaboliti NO e NO-derivati con tioli proteine, ammine secondarie, e metalli per formare S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosammine (RNNOs), e nitrosile-eme rappresentano rispettivamente cGMP indipendenti effetti di NO e probabilmente altrettanto importante fisiologicamente l'attivazione di SGC da NO. Una vera comprensione del NO nella fisiologia deriva da esperimenti in vivo di campionamento comparti multipli contemporaneamente. Ossido nitrico (NO) metodologia è una scienza complessa e spesso confusa e al centro di molti dibattiti e discussioni in merito NO biochimica. Il chiarimento di nuovi meccanismi e le vie di segnalazione che coinvolgono senza cerniere sulla nostra capacità di specifico, in modo selettivo e sensibile rilevare e quantificare NO NO e tutte le informazioni pertinenti prodotti e metaboliti nelle matrici biologiche complesse. Qui, viene presentato un metodo per l'analisi rapida e sensibile di nitriti e nitrati da HPLC e rilevamento di NO libero in campioni biologici utilizzando in chemiluminescenza dell'ozono vitro basato con derivitazation chimica per determinare la fonte di NO molecolare nonché ex vivo conorgano bagno myography.
Protocol
1. Raccolta di sangue intero
- Raccogliere il sangue venoso dagli esseri umani o da animali da esperimento in NEM / provette contenenti EDTA.
- Immediatamente spin down sangue in una centrifuga da banco a 14300 rcf (forza centrifuga relativa) per 7 minuti per preparare plasma e globuli rossi pellet.
- Preparare campioni di plasma per la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e rivelazione chemiluminescenza (CLD) analisi.
HPLC: Aggiungere 01:01 volumi di metanolo freddo al plasma, vortice e centrifugare a 13.200 rpm per 10 minuti per precipitare le proteine plasmatiche. Raccogliere il surnatante per l'analisi HPLC.
CLD: aliquota di un campione e con Preincubare sulfanilamide e cloruro di mercurio in modo specifico nitrosotioli saggio. - Preparare globuli rossi pellet per HPLC e l'analisi CLD.
HPLC: Add 01:04 globuli rossi pellet ad una soluzione di lisi ipotonica contenente 10 NEM mM, EDTA 2,5 mM e 10 mM di ferricianuro. Vortex bene e quindi aggiungere 01:01 metanolo, vortice e centrifUGE a 13.200 rpm per 10 minuti alla proteina precipitato. Raccogliere il surnatante per l'analisi HPLC.
CLD. Aggiungere 01:04 pellet di globuli rossi ad una soluzione di lisi ipotonica contenente 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA e 10 mM ferricianuro. Aliquota da provette contenenti cloruro di mercurio sulfanilamide e per l'individuazione specifica di nitrosotioli.
2. Tissue estrazione e preparazione
- Per determinare i livelli tissutali di NO metaboliti, è prima necessario prelevare tessuto libero nel sangue per la preparazione del campione come descritto sopra. Uno scambio di sangue completo avverrà mediante infusione di tampone fisiologico attraverso l'apice del ventricolo sinistro. Una volta che tutto il sangue viene rimosso, tessuti di interesse possono essere raccolte.
- Omogeneizzare campioni di tessuto e preparare campioni come descritto sopra per l'analisi HPLC e CLD.
3. Aortica isolamento Anelli per la funzione endoteliale
Tissue Organ Bath
- I topi saranno Anesthetized con etere etilico fino a quando non rispondono più ai piedi pizzico, e subiscono dislocazione cervicale prima dell'intervento. Un toracotomia viene eseguita per esporre aorta toracica ed addominale. Una siringa calibro 25 viene inserito all'apice del ventricolo sinistro e perfusi libera di sangue ossigenato con tampone Krebs Henseleit.
- L'atrio destro è tagliato per fornire un'uscita di sangue. Dell'aorta addominale sarà rimosso e pulito di avventizia.
- Anelli sarà tagliato in segmenti 2 mm di lunghezza e montato su un bagno di quattro canali tessuto organico (DMT 720MO, Instruments AD) immersa in una soluzione tampone fisiologico.
- Anelli serbatoio sono mantenute in 10-ml bagni organo ossigenato con tampone Krebs (95% O 2 e 5% CO 2) a 37 ° C. Una pretesa grammo è posto su ogni anello aortico (adeguata tensione di partenza ottimale per la funzione vasomotoria, come determinato in esperimenti precedenti). Un bambino di otto canali ottale bridge (PowerLab) e di acquisizione dati software (versione 5.2.2 alla tabella) unore utilizzato per registrare tutte le misurazioni di forza.
- Gli anelli sono lasciato equilibrare per 80 minuti con il buffer di ogni bagno organo cambiati ogni 20 min. Dopo l 'equilibrio per 80 min, 1 fenilefrina pM viene aggiunto a ogni anello per la contrazione submassimale.
- Dopo la stabilizzazione, agonista endoteliale come l'acetilcolina sarà aggiunto per determinare la produzione di NO e grado di rilassamento nave. Dopo la dose-risposta all'acetilcolina, bagni viene risciacquato e riassegnato e quindi trattata con una fonte esogena di ossido nitrico, nitroprussiato di sodio per determinare la reattività del muscolo liscio e per ottenere un valore di 100% rilassamento.
- NO decontaminanti può essere aggiunto a bagno per illustrare chiaramente rilascio di NO e inibizione del rilassamento nave.
4. Risultati rappresentativi
L'utilizzo del ENO-20 dedicato HPLC fornisce un facile da utilizzare il metodo per il rilevamento di un elevato throughput specifico e sensibile di nitriti e nitrati inmatrici biologiche. Il principio di rilevamento e un cromatogramma originale viene mostrato nella Figura 1. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi campione biologico per la determinazione nitriti e nitrati. CLD rilevamento basato su di NO metaboliti richiede una fase di derivatizzazione chimica per determinare l'origine molecolare del NO. La configurazione sperimentale per la simultanea denitrosazione ossidativo e denitrosazione riduttiva per il rivelatore di chemiluminescenza è mostrato in Figura 2. Il recipiente di reazione a destra viene riempito con ferricianuro 800mm in PBS pH 7,4 e il recipiente di reazione a sinistra è riempito con ioduro di potassio / iodio miscela in acido acetico per denitrosazione riduzione (Figura 2A). L'intera impostazione è illustrata nella figura 2B. La Figura 3 illustra i saggi denitrosazione gruppo specifico in grado di rilevare e quantificare nitrosotioli, i nitriti, nitrosamine, così come i prodotti eme nitrosilici. Questo metodo è stato precedentemente descriletto e convalidato 4,5. Queste analisi biochimiche importanti possono essere facilmente correlati con studi funzionali sugli anelli aortici isolati per determinare la produzione di NO endoteliale negli animali da esperimento. Questo esperimento classica farmacologica può essere facilmente e valutare con precisione la funzione endoteliale e la produzione di NO. Misurazione reattività nave agonisti endoteliali come acetilcolina può determinare direttamente endoteliale produzione di NO che possono poi essere correlato con biomarcatori biochimici rilevati nel sangue e nei tessuti degli animali sperimentali. Una rappresentazione tipica di una dose-risposta all'acetilcolina è mostrato in Figura 4. Topi di controllo sani con normale funzione endoteliale rispondere a acetilcolina da rilassante. I topi con disfunzione endoteliale (topi ipercolesterolemici) mostrano il rilassamento ridotta a causa della ridotta produzione di NO allo stesso stimolo.
Ficoure 1. Principio di rilevamento di nitriti e nitrati da ENO-20 e cromatogramma del campione. (Top) Schema di ENO-20 metodo di rilevamento per nitriti e nitrati. (Basso) chromotogram standard di 10 pmol nitriti e nitrati iniettata ENO-20 (100 pl di soluzione 100 nM di nitriti e nitrati). Sensibilità di 1 nM per ogni anione con 100 pl di volume di iniezione. Nessuna interferenza con le proteine o specie colorate.
Figura 2. CLD setup sperimentale utilizzando sia denitrosazione ossidativo da denitrosazione ferricianuro e riduttivo con ioduro / iodio test con rilevazione di fase gas depurato gas ossido nitrico.
Figura 3. (Pannello A) individuazione Chemiluminescenza di nitrito, Royal Scottish National Orchestra, RNNO nel test denitrosazione riduttivo da una preincubazione del campione con il gruppo Chemic specificoal reagenti. Sottrazione delle aree dei picchi consentono di individuare nitriti e RSNOs. (Pannello B), rivelazione chemiluminescente di specie eme nitrosilici usando la soluzione ossidativo denitrosazione di ferricianuro. Questo metodo è specifico per NO-eme prodotti alcuna reattività incrociata con RSNOs (GSNO o SNO-albumina), o RNNO (NO-pirrolidina e N-nitroso-albumina).
Figura 4. Bagno ex vivo organo su anelli aortici isolati fornisce una misura diretta della produzione di NO endoteliale che possono poi essere correlato con marcatori biochimici rilevati mediante HPLC e CLD. Questa figura illustra il rilassamento ridotta nei topi affetti da disfunzione endoteliale dovuta a ridotta produzione di NO.
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Discussion
I metodi qui descritti per la quantificazione di metaboliti NO pertinenti a compartimenti multipli biologici consentirà di impronte digitali di NO biologia in salute e di malattia che possono essere correlati con misurazioni funzionali di NO da parte dell'endotelio. Questi metodi richiedono una preparazione semplice del campione con un potenziale di adattamento per un throughput elevato. La quantità relativa di queste molecole possono aiutare a comprendere la produzione di NO e il suo destino metabolico in un certo numero di modelli sperimentali di patologia e anche campioni seriali di pazienti umani. Ci sono molte insidie a rilevare NO biomarcatori basati su metodi analitici e molti artificialmente produrre alcuni di questi prodotti durante la preparazione del campione. Contabilizzazione attenta di nitriti nei campioni biologici è un fattore critico a causa della sua reattività con tioli 6 cisteina e la formazione di artefatti nitrosotioli 7. CLD metodologie based per il rilevamento specifico di nitrito in condizioni anaerobiche causare unarisultati costanti a causa della attività di enzimi specifici nitrito riduttasi in differenti compartimenti biologici 8. Tutti i metodi descritti qui sono ben documentate e convalidate e prendere in considerazione misure per eliminare o ridurre gli artefatti 9. Ci descrive i passaggi critici necessari per evitare artefatti. Questo multi-vano screening NO metaboliti aiutare a identificare marcatori biologici relativi che possono avere utilità diagnostica o prognostico negli esseri umani e consentirà poi lo sviluppo di metodi standardizzati che possono essere utilizzati in clinica o per analisi di laboratorio standard. Il recente riconoscimento di un ciclo dell'azoto umana in cui sono ridotti di nitrati e nitriti di NO da una circolazione enterosalivary di nitrato di 10,11 apre il potenziale per l'utilizzo di saliva come un potenziale biomarcatore di stato NO in certe malattie. Ad oggi non è stato NO parte del sangue chimica standard utilizzato di routine per scopi diagnostici in pazienti. Thè scioccante viene data la natura critica di NO molti processi patologici. In definitiva, i livelli di questi marcatori che determinano NO, ad opera di facile da usare e lato del letto, forse un rapido point-of-care test dopo una adeguata validazione sarà un vero e proprio testamento al loro ruolo nella medicina molecolare. E 'prudente in questo momento per concentrare gli sforzi e combinati in campo per convalidare e sviluppare un test standard e accurato per la determinazione NO stato in modelli animali per la convalida negli esseri umani. I metodi descritti in questo protocollo permetterà ad altri di adottare rapidamente un metodo del consenso per tali misurazioni.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Jiang Hong, Ph.D. e Deepa Parathasarthy, MPH, BDS per l'assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 | |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Autosampler | Alcott | ||
| DMT Myograph | ADInstruments | ||
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
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