Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

doi: 10.3791/3722 Published: June 18, 2012

Summary

ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.

Abstract

תחמוצת החנקן (NO) הוא חינם diatomic הרדיקלי כי הוא קצר ביותר חיו במערכות ביולוגיות (פחות מ 1 השני במחזור הדם) 1. אין לעשות שנחשב לאחד את מולקולות האיתות החשוב ביותר המיוצר בגופנו, ויסות הפונקציות החיוניות, כולל אך לא רק ויסות לחץ הדם, תגובה חיסונית ותקשורת עצבית. לכן זיהוי מדויק שלה וכימות של מטריצות ביולוגיות הוא קריטי כדי להבין את התפקיד של NO מחלה ובריאות. חיים כגון 1/2 קצר הפיזיולוגי של NO, אסטרטגיות חלופיות עבור זיהוי של תוצרי התגובה של הביוכימיה NO פותחו. כימות של מטבוליטים אין הרלוונטיים תאים ביולוגיים רבים מספק מידע רב ערך לגבי in vivo לא, הייצור הזמינות הביולוגית ואת חילוף החומרים. כל שעליך לעשות הוא דגימה תא יחיד, כגון דם או פלסמה לא תמיד לספק הערכה מדויקת של כל בוdy חסרי מעמד, בעיקר ברקמות. היכולת להשוות עם דם ברקמות נבחרים חיות הניסוי יסייע לגשר על הפער בין המדע הבסיסי לבין הרפואה הקלינית ככל כלי אבחון פרוגנוסטית של אין סמנים ביולוגיים בריאות ומחלות. לכן, אקסטרפולציה של מצב NO פלזמה או דם לרקמות ספציפיות של עניין היא כבר לא הגישה חוקי. כתוצאה מכך, שיטות להמשיך להתפתח ומאומתים המאפשרים זיהוי וכימות של מוצרים לא ולא הקשורה / מטבוליטים של תאים רבים של חיות הניסוי in vivo. הפרדיגמה הוקמה לביוכימיה NO מייצור ידי אין synthases על הפעלת מסיסים guanylyl cyclase (SGC) לחמצון בסופו של דבר אל ניטריט (NO 2 -) ו - ניטראט (NO 3 -) יכול לייצג רק חלק מתופעות של אין in vivo. האינטראקציה של מטבוליטים לא ולא הנגזרות עם thiols חלבון, אמינים משניים, ומתכות להקים S-nitrosothiOLS (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), ו-heme nitrosyl בהתאמה מייצגים-cGMP עצמאיים ההשפעות של NO וסביר לא פחות חשובים מבחינה פיזיולוגית כמו הפעלת SGC בשום. הבנה אמיתית של NO בפיזיולוגיה נגזר בניסויים ב vivo הדגימה תאים מרובים בו זמנית. המתודולוגיה החנקן (NO) תחמוצת היא מדע מורכב ומבלבל לעיתים קרובות מוקד ויכוחים רבים ודיון בנוגע NO ביוכימיה. הבהרה מנגנונים חדשים במעברי האותות שאין בה דבר תלוי ביכולת שלנו באופן ספציפי, סלקטיבי וברגישות לזהות ולכמת NO וכל רלוונטי אין מוצרים מטבוליטים של מטריצות ביולוגיות מורכבות. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של הניטריט ו חנקתי על ידי HPLC, כמו גם זיהוי של NO חופשית דגימות ביולוגיות באמצעות ב chemiluminescence האוזון חוץ גופית מבוסס עם derivitazation הכימית כדי לקבוע את המקור המולקולרי של NO כמו גם vivo לשעבר עםאמבטיה איבר myography.

Protocol

1. דם מלא אוסף

  1. איסוף דם ורידי מבני אדם או בחיות מעבדה ב Nem / EDTA מבחנות המכילות.
  2. מיד לסובב את הדם בצנטריפוגה benchtop על 14,300 RCF (כוח צנטריפוגלי יחסית) במשך 7 דקות להכין פלזמה תא דם אדום גלולה.
  3. הכינו דגימות פלסמה של כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) וזיהוי chemiluminescence (CLD) ניתוח.
    HPLC: הוסף 01:01 היקף מתנול קר פלזמה, מערבולת ו צנטריפוגות בסל"ד 13,200 במשך 10 דקות חלבונים פלזמה לשקוע. איסוף supernatant לניתוח HPLC.
    CLD: aliquot מדגם preincubate עם sulfanilamide ו כלוריד כספיתי באופן ספציפי nitrosothiols assay.
  4. הכן אדום תא גלולה עבור HPLC וניתוח CLD.
    HPLC: הוסף 01:04 אדום תא גלולה לפתרון תמוגה hypotonic המכיל 10 Nem מ"מ, 2.5 מ"מ ו - 10 mM EDTA ferricyanide. מערבולת ביסודיות ולאחר מכן להוסיף 01:01 מתנול, מערבולת centrifuge בסל"ד 13,200 במשך 10 דקות לחלבון המשקע. איסוף supernatant לניתוח HPLC.
    CLD. הוסף 01:04 אדום תא גלולה לפתרון תמוגה hypotonic המכיל 10 mM EDTA, 2.5 מ"מ ו - 10 mM EDTA Ferricyanide. Aliquot דוגמאות לצינורות המכילים כלוריד כספיתי ו sulfanilamide לגילוי ספציפי של nitrosothiols.

2. רקמת כריה הכנה

  1. כדי לקבוע רמות של מטבוליטים ברקמות לא, זה הכרחי 1 למסוק רקמת הדם בחינם עבור הכנת המדגם כפי שתואר לעיל. החלפת דם מלאה יתקיימו על ידי יציקת חיץ פיזיולוגית באמצעות איפקס של החדר השמאלי. לאחר כל הדם מוסר, רקמות של עניין לאחר מכן ניתן לקצור.
  2. Homogenize דגימות רקמה והכנת דגימות כפי שתואר למעלה HPLC וניתוח CLD.

3. בידוד טבעות אבי העורקים על תפקוד האנדותל

איברים רקמות אמבטיה

  1. עכברים יהיה anesthetized עם האתר diethyl עד תגובה לא ליישר קורט, ועוברים פריקה צוואר הרחם לפני הניתוח. פתיחת בית החזה מתבצע כדי לחשוף את אבי העורקים החזי ואת הבטן. מזרק 25 מד מוכנס לתוך איפקס של החדר השמאלי ו perfused חופשית של דם מחומצן עם חיץ Henseleit קרבס.
  2. אטריום ימין נחתך לספק היציאה לדם. אבי העורקים בבטן יוסר וניקה של adventitia.
  3. טבעות יהיה חתוך 2 קטעים ארוכים מ"מ רכוב על אמבטיה ערוץ ארבע רקמות איבר (DMT 720MO, מכשירים לספירה) שטוף פתרון חיץ פיזיולוגית.
  4. טבעות כלי השיט נשמרות ל -10 מ"ל אמבטיות איברים עם מחומצן קרבס חיץ (95% O 2 ו - 5% CO 2) ב 37 ° C. אחד יומרה גרם מושם על כל טבעת אבי העורקים (מתח המוצא המתאים לתפקוד אופטימלי vasomotor כפי שנקבע בניסויים קודמים). 8 ערוצים אוקטלי הגשר (Powerlab) ונתונים רכישה התוכנה (גירסה 5.2.2 תרשים)שוב נהג להקליט את כל מדידות כוח.
  5. טבעות מותר לאזן על 80 דקות עם למאגר באמבטיה כל איבר שונה בכל 20 דקות. לאחר איזון 80 דקות, 1 phenylephrine מיקרומטר מתווסף כל טבעת על התכווצות submaximal.
  6. לאחר ייצוב, אגוניסט האנדותל כגון אצטילכולין יתווספו לקבוע NO הייצור ומידת הרפיה כלי. לאחר שסיימת לענות של מינון כדי אצטילכולין, אמבטיות תהיה שטופה recontracted וטופלו לאחר מכן עם מקור אקסוגני של תחמוצת החנקן, nitroprusside נתרן כדי לקבוע התגובה של השריר החלק וכדי לקבל ערך עבור הרפיה 100%.
  7. אוכלי נבלות אין ניתן להוסיף לאמבטיה כדי להמחיש באופן ברור שחרורו של עיכוב NO ושל רוגע כלי.

4. נציג תוצאות

השימוש ENO-20 ייעודי HPLC מספק קל לשימוש שיטת תפוקה גבוהה לגילוי ספציפי ורגיש של הניטריט ו חנקתי במטריצות ביולוגיות. העיקרון של איתור הכרומתוגרמה המקורי מוצג באיור 1. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל דגימה ביולוגית לקביעת הניטריט ו חנקתי. זיהוי מבוסס CLD של מטבוליטים לא דורש derivitization כימיים צעד כדי לקבוע את המקור המולקולרי של NO. התקנה ניסיונית denitrosation חמצוני בו זמנית denitrosation רדוקטיבי עבור גלאי chemiluminescence מוצג באיור 2. כלי התגובה בצד ימין מלא ferricyanide 800mm ב PBS pH 7.4 ואת כלי התגובה בצד שמאל מלא בתערובת יודיד / יוד אשלגן חומצה אצטית על denitrosation ירידה (איור 2 א). ההתקנה כולה מוצג באיור 2 ב. איור 3 מדגים ספציפיים הקבוצה denitrosation מבחני ניתן לזהות ולכמת הניטריט, nitrosothiols nitrosamines, כמו גם מוצרים heme nitrosyl. שיטה זו הייתה בעבר descriהמיטה ומאומתים 4,5. ניתוחים אלה ביוכימיים חשובים יכול בקלות להיות מתואם עם מחקרים תפקודית על טבעות אבי העורקים בודדים כדי לקבוע האנדותל NO ייצור בחיות מעבדה. זה ניסוי תרופתי קלאסית יכול בקלות ובאופן מדויק להערכת תפקוד האנדותל NO והפקה. מדידת תגובתיות כלי כדי אגוניסטים אנדותל כגון אצטילכולין יכולה ישירות לקבוע ייצור האנדותל NO אז מה שיכול להיות בקורלציה עם סמנים ביוכימיים שהתגלו בדם ורקמות של חיות הניסוי. ייצוג אופייני בתגובה המינון כדי אצטילכולין מוצגת באיור 4. עכברים שליטה בריאים עם תפקוד האנדותל תקין להגיב אצטילכולין על ידי הרפיית. עכברים עם תפקוד לקוי של האנדותל (עכברים כולסטרול) הצג הרפיה מופחתת עקב ירידה בייצור NO לגירוי זהה.

איור 1
תאנהיור 1. עקרון זיהוי של הניטריט ו חנקתי על ידי ENO-20 ו הכרומתוגרמה המדגם. (למעלה) סכמטי של שיטת-20 ENO של גילוי הניטריט ו חנקתי. (למטה) chromotogram רמת הניטריט pmol 10 ו חנקתי מוזרק ENO-20 (100 μl של 100 ננומטר הפתרון של הניטריט ו חנקתי). הרגישות של 1 ננומטר עבור כל אניון עם נפח הזרקה 100 μl. לא הפרעה חלבון או מינים צבעוניים.

איור 2
2. איור CLD התקנה ניסיונית הן באמצעות denitrosation חמצוני על ידי denitrosation ferricyanide ו רדוקטיבי באמצעות יודיד / יוד assay עם גילוי הגז שלב מטוהר גז תחמוצת החנקן.

איור 3
איור 3. (לוח) איתור chemiluminescence של הניטריט, RSNO, RNNO ב assay denitrosation רדוקטיבי ידי preincubation המדגם עם קבוצה ספציפית chemicאל חומרים כימיים. הפחתה של אזורים השיא לאפשר זיהוי של הניטריט ו RSNOs. (לוח ב ') גילוי chemiluminescent המינים heme nitrosyl באמצעות פתרון denitrosation חמצוני של ferricyanide. שיטה זו היא ספציפית עבור NO-heme מוצרים עם תגובתיות לא צלב עם RSNOs (GSNO או sno-אלבומין), או RNNO (NO-pyrrolidine ו N-nitroso-אלבומין).

איור 4
איור 4. איבר Ex vivo אמבטיה על טבעות אבי העורקים מבודדות מספק מדד ישירה של ייצור NO האנדותל כי אז יכול להיות מתואם עם סמנים ביוכימיים שזוהו על ידי HPLC ו CLD. נתון זה ממחיש הרפיה מופחת בעכברים עם תפקוד לקוי של האנדותל בגלל ירידה בייצור NO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשיטות שתוארו כאן כימות של מטבוליטים אין הרלוונטיים תאים ביולוגיים רבים תאפשר טביעת אצבע של הביולוגיה NO בבריאות ומחלות שיכולים להיות מתואם עם מדידות פונקציונליות של NO על ידי האנדותל. שיטות אלו דורשים הכנה מדגם פשוט עם פוטנציאל להתאים את קצב העברת נתונים גבוה. הכמות היחסית של שתי המולקולות האלה מסוגלות לעזור להבין את הייצור של NO וגורלו חילוף החומרים שלה במספר מודלים ניסויים של המחלה, ואפילו דגימות מחולים סדרתיים אדם. ישנם מכשולים רבים אין גילוי סמנים ביולוגיים המבוססים על שיטות אנליטיות רבות מלאכותי לייצר כמה מוצרים אלה במהלך הכנת המדגם. חשבונאית קפדנית של הניטריט של דגימות ביולוגיות הוא קריטי עקב התגובה שלה עם thiols ציסטאין 6 ו היווצרות artifactual של nitrosothiols 7. שיטות המבוססות על CLD לגילוי ספציפי של הניטריט בתנאים אנאירוביים להוביל בתוצאות עקביות, בשל פעילות של אנזימים ספציפיים הניטריט רדוקטאז בתאים ביולוגיים שונים 8. כל השיטות המתוארות כאן מתועדים היטב תוקף לקחת צעדים התחשבות למנוע או להפחית ממצאים 9. נתאר את השלבים הקריטיים הדרושים כדי למנוע את החפצים. זו הקרנה רב תא של מטבוליטים לא יעזור בזיהוי סמנים ביולוגיים הנוגעות בדבר אשר ייתכן כלי אבחון או פרוגנוסטית בבני אדם לאחר מכן מאפשרים פיתוח של שיטות סטנדרטיים אשר ניתן להשתמש בהם במרפאה או ניתוח מעבדה סטנדרטי. ההכרה האחרונה של מחזור חנקן חנקתי לפיה האדם ואת הניטריט מופחתים NO על ידי זרימת enterosalivary של ניטראט 10,11 עכשיו נפתח את הפוטנציאל באמצעות הרוק כמו סמן פוטנציאל מצב NO במחלות מסוימות. עד כה לא המצב אינו חלק הכימיה בדם הסטנדרטית המשמשת באופן שגרתי אצל חולים למטרות אבחון. ההוא מזעזע בהתחשב באופי קריטית של אין תהליכי מחלה רבים. בסופו של דבר, קביעת רמות אלו סמנים ביולוגיים הקשורים NO על ידי קל לשימוש בצד המיטה מהירה אולי הנקודה של טיפול לאחר מבחני אימות נאותה תהיה עדות ממשית תפקידם ברפואה מולקולרית. זה נבון בשלב זה על המאמצים מרוכזים ומשולבים בתחום כדי לאמת ולפתח assay תקן מדויק לקביעת חסרי מעמד במודלים של בעלי חיים לצורך אימות אצל בני אדם. השיטות המתוארות פרוטוקול זה יאפשר לאחרים במהירות לאמץ שיטה הסכמה על מדידות כאלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות הונג ג'יאנג, Ph.D. ו דיפה Parathasarthy, MPH, BDS לסיוע טכני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific, Inc. 23030
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Potassium Ferricyanide Fluka 60299
HPLC Eicom Corp ENO-20
Autosampler Alcott
DMT Myograph ADInstruments
PowerLab ADInstruments
Chemiluminescent EcoPhysics CLD 88Y
Centrifuge Eppendorf 5415D
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625
R-(-) Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
  2. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  3. Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
  4. Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
  5. Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
  6. Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
  7. Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
  8. Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
  9. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
  10. Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
  11. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).More

Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter