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Medicine

नाइट्रिक ऑक्साइड bioactivity परख के लिए विश्लेषणात्मक तकनीक

doi: 10.3791/3722 Published: June 18, 2012

Summary

नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) के उत्पादन अंतर्जात जैविक कार्यों की एक विस्तृत विविधता को नियंत्रित करता है. यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि या सं आधारित संकेत विघटन अनियंत्रण कई मानव रोगों में शामिल है. तरीके मात्रा ठहराना करने के लिए प्रासंगिक नहीं चयापचयों मानव रोग के लिए उपन्यास नैदानिक ​​या शकुन biomarkers प्रदान कर सकता है.

Protocol

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1. पूरे रक्त संग्रह

  1. या / NEM EDTA युक्त ट्यूबों में प्रायोगिक पशुओं से मनुष्यों से शिरापरक रक्त ले लीजिए.
  2. तुरंत नीचे 14,300 पर एक benchtop अपकेंद्रित्र में 7 मिनट के लिए आरसीएफ (सापेक्ष केन्द्रापसारक बल) रक्त प्लाज्मा और लाल रक्त कोशिका गोली तैयार करने के लिए स्पिन.
  3. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) और chemiluminescence (CLD) का पता लगाने के विश्लेषण के लिए प्लाज्मा के नमूने तैयार करते हैं.
    HPLC: प्लाज्मा, भंवर और वेग प्लाज्मा प्रोटीन के लिए 10 मिनट के लिए 13,200 rpm पर अपकेंद्रित्र ठंड मेथनॉल के 1:1 मात्रा जोड़ें. HPLC विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
    CLD: अशेष भाजक और विशेष रूप से परख nitrosothiols sulfanilamide और mercuric क्लोराइड के साथ नमूना preincubate.
  4. HPLC और CLD विश्लेषण के लिए लाल सेल गोली तैयार करते हैं.
    HPLC जोड़ें 01:04 लाल सेल lysis hypotonic 10 मिमी NEM, 2.5 मिमी EDTA और 10 ferricyanide मिमी युक्त समाधान के लिए गोली. भंवर अच्छी तरह से और फिर 1:01 मेथनॉल, भंवर और centrif जोड़नेवेग प्रोटीन से 10 मिनट के लिए 13,200 rpm पर uge. HPLC विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
    CLD. एक hypotonic lysis 10 मिमी EDTA, 2.5 मिमी EDTA और 10 मिमी ferricyanide युक्त समाधान के लिए 1:04 लाल सेल गोली जोड़ें. अशेष भाजक nitrosothiols की विशिष्ट पहचान के लिए sulfanilamide और mercuric क्लोराइड युक्त ट्यूबों के लिए नमूने हैं.

2. ऊतक निष्कर्षण और तैयार

  1. सं चयापचयों ऊतक के स्तर को निर्धारित करने के लिए, यह पहली बार नमूना तैयार करने के लिए रक्त मुक्त ऊतक फसल के लिए आवश्यक के रूप में ऊपर वर्णित है. एक पूर्ण रक्त विनिमय बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के माध्यम से शारीरिक बफर infusing द्वारा जगह ले जाएगा. एक बार सब खून निकाल दिया जाता है, ब्याज के ऊतकों को फिर से काटा जा सकता है.
  2. ऊतकों के नमूनों Homogenize और नमूने तैयार के रूप में HPLC और CLD विश्लेषण के लिए ऊपर वर्णित है.

3. Endothelial समारोह के लिए महाधमनी के छल्ले अलगाव

ऊतक अंग स्नान

  1. चूहे anest होगाDiethyl ईथर के साथ hetized जब तक अब उत्तरदायी चुटकी पाँव तक, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था सर्जरी से पहले से गुजरना. एक thoracotomy के वक्ष और उदर महाधमनी का पर्दाफाश किया जाता है. एक 25 गेज सिरिंज के बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष में डाला जाता है और ऑक्सीजन क्रेब्स Henseleit बफर के साथ रक्त के मुक्त perfused.
  2. सही atrium रक्त के लिए एक से बाहर निकलें प्रदान करने के लिए काट रहा है. उदर महाधमनी और हटाया जाएगा बाह्यकंचुक साफ है.
  3. के छल्ले 2 मिमी लंबे समय खंडों में कटौती की जाएगी और एक ऊतक चार चैनल अंग (DMT 720MO, विज्ञापन उपकरण) एक शारीरिक बफर समाधान में स्नान स्नान पर घुड़सवार.
  4. पोत के छल्ले 10 मिलीलीटर अंग स्नान में ऑक्सीजन क्रेब्स बफर (95% 2 हे और 5% सीओ 2) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है ग्राम गुमान प्रत्येक महाधमनी रिंग (इष्टतम vasomotor समारोह के लिए उपयुक्त शुरू तनाव के रूप में पिछले प्रयोगों में निर्धारित) पर रखा गया है. आठ चैनल अष्टाधारी (Powerlab) के पुल और डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (चार्ट संस्करण 5.2.2)फिर बल के मापन रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया.
  5. रिंगों प्रत्येक अंग स्नान में बफर के साथ हर 20 मिनट के बदल 80 मिनट के लिए संतुलित करना करने के लिए अनुमति दी जाती है. 80 मिनट के लिए संतुलन के बाद, 1 माइक्रोन phenylephrine के submaximal संकुचन के लिए प्रत्येक अंगूठी करने के लिए जोड़ा जाता है.
  6. स्थिरीकरण के बाद, acetylcholine जैसे endothelial agonist के सं उत्पादन और पोत छूट की डिग्री का निर्धारण करने के लिए जोड़ दिया जाएगा. Acetylcholine की खुराक के लिए प्रतिक्रिया करने के बाद, स्नान और rinsed जाएगा recontracted और नाइट्रिक ऑक्साइड, सोडियम चिकनी मांसपेशियों की जवाबदेही तय करने के लिए और 100% छूट के लिए एक मूल्य प्राप्त nitroprusside बहिर्जात स्रोत के साथ फिर इलाज.
  7. सं मैला ढोने वालों को स्नान करने के लिए जोड़ा जा सकता है स्पष्ट रूप से पोत छूट की सं और निषेध की रिहाई वर्णन.

4. प्रतिनिधि परिणाम

Eno-20 समर्पित HPLC का उपयोग करने के लिए एक विशिष्ट और संवेदनशील नाइट्राइट और नाइट्रेट में पता लगाने के लिए उच्च throughput विधि का उपयोग करने के लिए आसान प्रदान करता हैजैविक matrices के. पता लगाने और एक मूल वर्णलेख के सिद्धांत चित्र 1 में दिखाया गया है. इस विधि नाइट्राइट और नाइट्रेट का निर्धारण करने के लिए किसी भी जैविक नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सं चयापचयों का CLD आधारित पता लगाने एक रासायनिक derivitization के कदम सं आणविक स्रोत निर्धारित करने की आवश्यकता है. साथ oxidative chemiluminescence डिटेक्टर लिए reductive denitrosation का denitrosation के लिए प्रयोगात्मक स्थापना चित्रा 2 में दिखाया गया है. सही पर प्रतिक्रिया पोत में पीबीएस पीएच 7.4 800mm ferricyanide से भर जाता है और छोड़ दिया पर प्रतिक्रिया पोत कमी denitrosation (2A चित्रा) के लिए एसिटिक एसिड में पोटेशियम योडिद आयोडीन / मिश्रण के साथ भरा है. पूरे सेटअप चित्रा 2B चित्रा 3 में दिखाया गया है. समूह के विशिष्ट denitrosation assays कि पता लगाने और नाइट्राट मात्रा ठहराना कर सकते हैं है, nitrosothiols, nitrosamines के रूप में के रूप में अच्छी तरह से nitrosyl heme उत्पादों को दिखाता है. यह पद्धति पहले से किया गया है descriबिस्तर और 4,5 मान्य. इन महत्वपूर्ण जैव रासायनिक विश्लेषण आसानी से अलग महाधमनी के छल्ले पर कार्यात्मक अध्ययन के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है के लिए endothelial प्रायोगिक पशुओं में नहीं उत्पादन का निर्धारण. यह शास्त्रीय औषधीय प्रयोग आसानी से और सही सं endothelial समारोह और उत्पादन का आकलन कर सकते हैं. Acetylcholine जैसे endothelial agonists के लिए पोत जेट मापने सीधे endothelial सं उत्पादन जो तो जैव रासायनिक और प्रायोगिक पशुओं के रक्त और ऊतकों में पाया बायोमार्कर के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है निर्धारित कर सकते हैं. Acetylcholine की एक खुराक के जवाब का एक विशिष्ट प्रतिनिधित्व चित्रा 4 में दिखाया जाता है. सामान्य endothelial समारोह के साथ स्वस्थ नियंत्रण चूहों आराम से acetylcholine का जवाब. Endothelial रोग के साथ चूहों (hypercholesterolemic चूहों) कम ही प्रोत्साहन सं उत्पादन कम कारण छूट दिखा.

चित्रा 1
अंजीर1 उरे और Eno-20 और वर्णलेख नमूना द्वारा नाइट्राइट और नाइट्रेट का पता लगाने के सिद्धांत. Eno 20 नाइट्राइट और नाइट्रेट के लिए पता लगाने की विधि के योजनाबद्ध (शीर्ष). (नीचे) 10 pmol नाइट्राइट और नाइट्रेट के मानक chromotogram Eno 20 (नाइट्राइट और नाइट्रेट की 100 एनएम के समाधान के 100 μl) में इंजेक्ट किया. 100 μl इंजेक्शन की मात्रा के साथ प्रत्येक आयनों के लिए 1 एनएम की संवेदनशीलता. प्रोटीन या रंग प्रजातियों के साथ हस्तक्षेप.

चित्रा 2
चित्रा 2. CLD प्रयोगात्मक ferricyanide और reductive पर्ज नाइट्रिक ऑक्साइड गैस की गैस चरण का पता लगाने के साथ आयोडाइड / आयोडीन परख का उपयोग denitrosation द्वारा दोनों oxidative denitrosation के प्रयोग से व्यवस्था.

चित्रा 3
चित्रा 3 (पैनल). Chemiluminescence नाइट्राट का पता लगाने, RSNO, RNNO समूह विशिष्ट रसायन के साथ नमूना preincubation द्वारा reductive denitrosation परख मेंअल अभिकर्मकों. शिखर क्षेत्रों के घटाव नाइट्राइट और RSNOs का पता लगाने की अनुमति देते हैं. (बी पैनल) ferricyanide की oxidative denitrosation समाधान का उपयोग nitrosyl heme प्रजातियों के chemiluminescent का पता लगाने. इस विधि सं heme उत्पादों के लिए RSNOs (GSNO या SNO - albumin), या RNNO (सं pyrrolidine और एन nitroso - albumin) के साथ कोई पार जेट के साथ विशिष्ट है.

चित्रा 4
चित्रा 4 अलग महाधमनी के छल्ले पर पूर्व vivo में अंग स्नान endothelial सं उत्पादन है कि फिर से जैव रासायनिक HPLC और CLD से पता चला बायोमार्कर के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है की एक सीधा उपाय प्रदान करता है. यह आंकड़ा endothelial रोग के साथ चूहों में कम छूट दिखाता सं उत्पादन में कमी के कारण.

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Discussion

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तरीकों कई जैविक डिब्बों में प्रासंगिक सं चयापचयों की मात्रा का ठहराव के लिए यहाँ वर्णित स्वास्थ्य और रोग है कि अन्तःचूचुक द्वारा सं कार्यात्मक माप के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है में कोई जीव विज्ञान की फिंगरप्रिंटिंग के लिए अनुमति देगा. इन विधियों उच्च throughput के लिए आदत डाल के लिए क्षमता के साथ सरल नमूना तैयार करने की आवश्यकता है. इन अणुओं के सापेक्ष मात्रा सं उत्पादन और रोग की प्रयोगात्मक मॉडल और मानव रोगियों से भी धारावाहिक के नमूने की एक संख्या में अपने चयापचय भाग्य समझने में मदद कर सकते हैं. सं आधारित biomarkers और कई विश्लेषणात्मक तरीकों का पता लगाने के कृत्रिम नमूना तैयार करने के दौरान कुछ इन उत्पादों के उत्पादन में कई बाधाएं हैं. जैविक नमूनों में नाइट्राइट की सावधान लेखांकन कारण सिस्टीन 6 thiols और 7 nitrosothiols की artifactual गठन के साथ अपने जेट के लिए महत्वपूर्ण है. नाइट्राइट की anaerobic शर्तों के तहत विशिष्ट पहचान के लिए CLD आधारित तरीके में नेतृत्वलगातार विभिन्न जैविक 8 डिब्बों में विशिष्ट नाइट्राट रिडक्टेस एंजाइमों की गतिविधि के कारण परिणाम. यहाँ वर्णित विधियों के सभी अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं मान्य और विचार चरणों में ले लो को खत्म करने के लिए या 9 कलाकृतियों को कम. हम महत्वपूर्ण कलाकृतियों को रोकने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन करेंगे. यह बहु डिब्बे सं चयापचयों की स्क्रीनिंग प्रासंगिक biomarkers कि मानव में नैदानिक ​​या शकुन उपयोगिता है और तो मानकीकृत तरीके जो क्लिनिक में या मानक प्रयोगशाला विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास के लिए अनुमति देगा कर सकते हैं की पहचान करने में मदद मिलेगी. एक मानव नाइट्रोजन चक्र जिससे नाइट्रेट और नाइट्राइट 10,11 नाइट्रेट enterosalivary परिसंचरण द्वारा नहीं करने के लिए कम कर रहे हैं हाल ही में मान्यता अब कुछ बीमारियों में सं स्थिति के लिए एक संभावित biomarker के रूप में लार का उपयोग करने के लिए क्षमता को खोलता है. सं स्थिति की तारीख मानक रक्त नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए नियमित रूप से रोगियों में इस्तेमाल किया रसायन विज्ञान का हिस्सा नहीं है. गुदी सं कई रोग प्रक्रियाओं की गंभीर प्रकृति चौंकाने वाला है. अंततः, आसान द्वारा निर्धारित इन सं संबंधित बायोमार्कर के स्तर का उपयोग करने के लिए और शायद तेजी से बिस्तर के पक्ष पर्याप्त सत्यापन के बाद बिंदु की देखभाल assays आण्विक चिकित्सा में उनकी भूमिका के लिए एक असली वसीयतनामा होगा. यह क्षेत्र में केंद्रित है और संयुक्त प्रयासों के लिए मान्य है और सत्यापन के लिए मानव में पशु मॉडल में सं स्थिति का निर्धारण करने के लिए एक मानक और सही परख के विकास के लिए इस मोड़ पर समझदारी है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों दूसरों को तेजी से इस तरह के मापन के लिए एक आम सहमति पद्धति अपनाने के लिए अनुमति देगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए हाँग जियांग, पीएच.डी. शुक्रिया अदा करना चाहूँगा और दीपा Parathasarthy, mph, तकनीकी सहायता के लिए बीडीएस.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific, Inc. 23030
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Potassium Ferricyanide Fluka 60299
HPLC Eicom Corp ENO-20
Autosampler Alcott
DMT Myograph ADInstruments
PowerLab ADInstruments
Chemiluminescent EcoPhysics CLD 88Y
Centrifuge Eppendorf 5415D
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625
R-(-) Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126

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References

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Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).More

Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).

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