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Medicine

一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

doi: 10.3791/3722 Published: June 18, 2012

Summary

一酸化窒素(NO)の内因性産生は、生物多様な機能を調節する。それは、NOベースのシグナリングの中断または調節不全は、多くのヒト疾患に関与していることがますます明らかになりつつあります。関連するNOの代謝産物を定量化しないための方法は、ヒトの疾患の新しい診断または予後バイオマーカーを提供することがあります。

Abstract

一酸化窒素(NO)は1(血液の循環で1秒未満)、生物学的システムに住んでいた非常に短い二原子フリーラジカルです。 NOは含めて本質的な機能を調節する、私たちの体内で作ら最も重要なシグナル伝達分子の一つと考えられませんが、血圧、免疫応答と神経通信の規制に限定されない可能性があります。したがって、生体マトリックスでの正確な検出および定量は、健康と疾患におけるNOの役割を理解することが重要です。 NOのような短い生理的半減期で、NO生化学の反応生成物を検出するための代替戦略が開発されている。複数の生物学的区画内の関連するNO代謝産物の定量化は、 生体内で生産、生物学的利用能および代謝NOに関して貴重な情報を提供します。単にそのような血液または血漿のような単一コンパートメントをサンプリングすると、常に全体のBOの正確な評価を提供することはできません特に組織中のNOのステータスを、DYはありません。実験動物の選択組織と血液を比較する能力は、はるかに健康と病気におけるNOのバイオマーカーの診断および予後診断ユーティリティなどの基礎科学と臨床医学の間のギャップを埋めるのに役立ちます。したがって、興味のある特定の組織へ血漿又は血液の外挿なしの状態は、もはや有効なアプローチではありません。結果として、メソッドを開発し、in vivoでの実験動物の複数の区画内のNOとNO関連製品/代謝物の検出および定量化が許可されて検証され続けています。と硝酸塩(NO 3 - ) -亜硝酸(NO 2)にNO合成酵素によって生産からの可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)の活性化への最終的な酸化にNO生化学の確立されたパラダイムは、in vivoでの NOの影響の一部を表すことができる。 S-nitrosothiを形成するタンパク質のチオール基、二級アミンと金属とのNOとNO由来の代謝物の相互作用OLS(RSNOs)、N-ニトロソアミン(RNNOs)、およびニトロシルヘムは、それぞれのNOのcGMP依存しない効果を表しており、NOによるSGCの活性化として、生理学的に可能性が同様に重要である。生理中のNOの真の理解は、同時に複数のコンパートメントをサンプリングin vivo実験から導出されます。一酸化窒素(NO)の手法は複雑で、しばしば混乱の科学と多くの議論とNO生化学に関するません議論の焦点となっています。我々の能力特異的に上のNOのヒンジを伴わない新しい機構やシグナル伝達経路の解明は、選択的かつ高感度検出とNOと関連するすべての複雑な生体マトリックス中のNOの製品や代謝産物を定量化する。ここでは、高速液体クロマトグラフィーによる亜硝酸及び硝酸の迅速かつ高感度分析のための方法と同様のNO分子のソースなどのex vivoで決定するために、化学derivitazationとin vitroでのオゾンベースの化学発光使用し生体試料中の遊離NOの検出を発表臓器浴筋運動記録法。

Protocol

1。全血採取

  1. ヒトからまたはNEM / EDTAを含むチューブで実験動物からの静脈血を採取する。
  2. 直ちに血漿および赤血球細胞ペレットを準備する7分間14300 RCF(相対遠心力)でベンチトップ遠心分離機で血液をスピンダウンする。
  3. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)および化学発光検出(CLD)分析のために血漿サンプルを準備します。
    HPLC:沈殿物の血漿タンパク質への10分間プラズマ、13200 rpmでボルテックスと遠心に冷メタノールの1:1のボリュームを追加します。 HPLC分析のために上清を収集。
    CLD:アリコート特にアッセイニトロソチオールにスルファニルアミドと塩化第二水銀を使用してサンプルとpreinc​​ubate。
  4. HPLCおよびCLD分析のために赤色細胞ペレットを準備します。
    HPLC:10mMのNEM、2.5 mM EDTAおよび10mMのフェリシアン化を含む低張性溶解液に追加午前1時04分赤い細胞ペレット。 Vortexは徹底的にと、1:1メタノール、渦とcentrifを追加する沈殿タンパク質に10分間13200 rpmでuge。 HPLC分析のために上清を収集。
    CLD。 10mMのEDTA、2.5 mM EDTAおよび10mMのフェリシアン化を含む低張性溶解液に1時04分赤い細胞ペレットを追加します。ニトロソチオールの特異的検出のためのスルファニルアミドと塩化第二水銀を含有するチューブに分注しサンプル。

2。組織の抽出と準備

  1. NO代謝産物の組織レベルを決定するために、それは、上述したように試料調製のために血中遊離組織を採取することがまず必要です。完全な血液の交換は、左心室の頂部を介して生理的な緩衝液を注入することによって行われます。すべての血液が取り除かれた後、興味のある組織は、その後収穫することができます。
  2. 組織サンプルをホモジナイズし、HPLCとCLD分析のために上記のようにサンプルを準備します。

3。血管内皮機能のために大動脈リングの分離

ティッシュオーガンバス

  1. マウスはanestになりますもはや応答ピンチをつま先と、手術前に頸椎脱臼を受けるようになるまで、ジエチルエーテルでhetized。開胸術は胸と腹部大動脈を露出するために実行されます。 25ゲージのシリンジは、左心室の頂部に挿入し、酸素クレブスHenseleit緩衝液、血液の自由な灌流されています。
  2. 右心房は血液の出口を提供するためにカットされています。腹部大動脈は、外膜の除去と洗浄されます。
  3. リングは2ミリメートル長さのセグメントに切断し、生理的な緩衝液に浸し、4チャンネルの組織器官浴(DMT 720MO、AD·インスツルメンツ)にマウントされます。
  4. 容器リングは37℃で酸素クレブス緩衝液(95%O 2および5%CO 2)で10 mlの器官浴に保持されます一グラム主張は、それぞれの大動脈リング(以前の実験で決定される最適な血管機能のための適切な開始張力)に配置されます。 8チャンネル進ブリッジ(Powerlab)及びデータ収集ソフトウェア(チャートバージョン5.2.2)すべての力の測定値を記録するために使用再。
  5. リングは、各臓器浴中の緩衝液で80分間平衡化を許可されているすべての20分に変更しました。 80分間平衡化した後、1μMのフェニレフリンは、最大下収縮のために、各リングに追加されます。
  6. 安定した後など、アセチルコリンなどの内皮アゴニストは、血管弛緩のNO産生と程度を決定しないように追加されます。アセチルコリン用量反応した後、お風呂は一酸化窒素、平滑筋の応答性を決定するために、100%の弛緩のための値を取得するためにニトロプルシドナトリウムの外因性の源​​ですすぎ、recontractedして、処理されます。
  7. NOのスカベンジャーは、明らかに血管弛緩のNOおよび抑制のリリースを示すために、浴に添加することはできません。

4。代表的な結果

ENO-20専用のHPLCを使用するには、中の亜硝酸および硝酸の特異的かつ高感度に検出するためのハイスループットメソッドを使用して簡単に提供しています生体マトリックス。検出し、元のクロマトグラムの原理を図1に示されています。このメソッドは、亜硝酸及び硝酸を決定するための任意の生物学的サンプルに使用することができます。 NO代謝産物のCLDベースの検出では、NO分子のソースを決定するために、化学誘導体化ステップを必要とします。化学発光検出器の同時酸化脱ニトロソ化および還元的脱ニトロソ化の実験セットアップを図2に示されています。右側の反応容器にPBS pH7.4中800mmのフェリシアン化で満たされて、左側の反応容器を還元脱ニトロソ化のために酢酸( 図2A)のヨウ化カリウム/ヨウ素混合物が充填されています。全体のセットアップは、 図2Bに示されています。 図3は、グループ固有の脱ニトロソ化亜硝酸を検出し、定量化できるアッセイ、ニトロソ、ニトロソアミンなどニトロシルヘムの製品を示しています。このメソッドは、以前にdescriされているベッドと4,5検証されています。これらの重要な生化学的解析が容易に実験動物の内皮NO産生を決定しないように隔離された大動脈リングの機能研究と相関することができます。この古典的な薬理実験では、簡単かつ正確に血管内皮機能と生産NOを評価することはできません。そのようなアセチルコリンなどの内皮アゴニスト血管反応性を測定する直接して実験動物の血液や組織で検出された生化学的なマーカーと相関させることができる内皮NO産生を決定することはできません。アセチルコリンの用量反応の典型的な表現は、 図4に示します。正常な内皮機能と健康な対照マウスは、リラックスしてアセチルコリンに応答します。内皮機能不全(高コレステロール血症のマウス)のマウスは、同じ刺激​​に対してNO産生を減少させないことが原因で減少し緩和を示しています。

図1
イチジクURE 1。ENO-20およびサンプルのクロマトグラムによる亜硝酸及び硝酸の検出の原理。亜硝酸塩と硝酸塩の検出ENO-20方式の(上)模式図。 (下)10 pmolの亜硝酸及び硝酸の標準chromotogramは、ENO-20(亜硝酸及び硝酸の100 nM溶液の100μl)を注入した。 100μlの注入量と各陰イオンは1 nMの感度。タンパク質または着色された種との干渉はありません。

図2
パージ一酸化窒素ガスのガス相の検出にヨウ化/ヨウ素アッセイを使用してフェリシアン化及び還元脱ニトロソ化により、両方の酸化的脱ニトロソ化を使用して図2。CLD実験。

図3
図3(パネル)グループ固有のchemicを含むサンプル前処理によって還元脱ニトロソ化アッセイにおける亜硝酸塩の化学発光検出、RSNO、RNNOらの試薬。ピーク面積の減算は、亜硝酸塩とRSNOsの検出を可能にする。フェリシアの酸化脱ニトロソ化ソリューションを使用してニトロシルヘム種(パネルB)化学発光検出。このメソッドは、RSNOs(GSNOまたはSNO-アルブミン)、またはRNNO(NO-ピロリジンとN-ニトロソアルブミン)との交差反応性を有するNO-ヘム製品の固有のものです。

図4
図4分離された大動脈リング上のEx vivoの器官浴は、HPLCとCLDで検出された生化学的なマーカーと相関させることができる内皮NO産生の直接の尺度を提供しています。この図は、NO産生を減少させないことが原因で血管内皮機能障害を持つマウスの減少の緩和を示しています。

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Discussion

複数の生物学的区画内の関連するNO代謝産物の定量化のためにここで説明する方法は、内皮細胞によるNOの機能的な測定値と相関させることができ、健康と疾患におけるNOの生物学のフィンガープリントが可能になる。これらのメソッドは、高スループットのために適応させるための可能性のあるシンプルなサンプル調製を必要とします。これらの分子の相対量は、病気の実験モデルとヒト患者からもシリアルサンプル数におけるNOの産生およびその代謝運命を理解するのに役立ちます。人為的にサンプル調製時にこれらの製品の一部を生成するNOのベースのバイオマーカーと多くの分析法を検出しない多くの落とし穴があります。生体試料中の亜硝酸塩の慎重な会計処理が原因のシステインチオール6ニトロソ7の人為的形成との反応性が非常に重要です。嫌気的条件下で亜硝酸の特異的検出のためにCLDベースの方法論がでにつながる8つの異なる生物学的区画内の特定の亜硝酸還元酵素の活性に起因する一貫した結果。ここで説明するすべてのメソッドは、十分に文書化、検証および成果物9を排除または低減するために考慮の手順を考慮しています。我々はアーティファクトを防ぐために必要な重要なステップを説明します。 NO代謝産物のこのマルチコンパートメントのスクリーニングは、ヒトの診断または予後のユーティリティがあるかもしれませんし、診療所で、または標準的な実験室分析のために使用することができる標準化された方法の開発が可能になる、関連するバイオマーカーを特定するのに役立ちます。硝酸塩と亜硝酸塩は硝酸塩10,11のenterosalivary循環させることによりNOに削減されていませんそれによって人間の窒素循環の最近の認識は、現在特定の疾患におけるNOの状態の潜在的バイオマーカーとして唾液を使用する可能性を開きます。 NOの状態を今日までするには、患者では診断目的のために日常的に使用される標準的な血液化学検査の一部ではありません。番目のNO多くの病気のプロセスの重要な性質を考えると衝撃的であるされています。最終的に、十分な検証の後に使いやすい、おそらく急激なベッドサイドのポイントオブケアのアッセイで、これらのNO関連バイオマーカーのレベルを決定する分子医学におけるその役割への本当の証となります。それは、人間の検証のための動物モデルにおいてNOのステータスを決定しないための標準的かつ正確なアッセイを検証し、開発する分野に集中していると組み合わせての努力をこの時点では賢明である。このプロトコルで説明されている方法は、他の人が急速にこのような測定のためのコンセンサス方式を採用することができます。

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Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgments

著者らは、香港江博士に感謝したいと思いますとディーパParathasarthy、MPHは、技術支援のためのBDS。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific, Inc. 23030
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Potassium Ferricyanide Fluka 60299
HPLC Eicom Corp ENO-20
Autosampler Alcott
DMT Myograph ADInstruments
PowerLab ADInstruments
Chemiluminescent EcoPhysics CLD 88Y
Centrifuge Eppendorf 5415D
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625
R-(-) Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126

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References

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Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).More

Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).

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